一种蹄甲多肽的复合水解制备方法

摘要

本发明为一种蹄甲多肽的复合水解制备方法，是将经过干燥和粉碎后的蹄甲原料，在碱溶液中进行温和的部分水解；然后使用蛋白水解酶进一步水解；制得蹄甲多肽产品。本发明所制得的蹄甲多肽产品中，相对分子质量10000-3500的组分含量达50％；氨基氮含量不超过总氮含量的3％。与现有技术相比较其凝血、抗炎效果具有明显的提高。

权利要求

1.一种蹄甲多肽的复合水解制备方法，其特征在于采用先在碱溶液中进行水解，然后使用蛋白水解酶进一步水解的双重复合水解方法，并控制氨基氮含量不超过总氮含量的

3％；

具体操作步骤和条件如下：

1)将原料蹄甲进行洗涤、热解、干燥和粉碎，制得原料粉末；

2)将原料粉末置于重量为原料干粉的20～22倍、pH为8.4～8.6的NaOH溶液中，在温度为84～86℃下，均匀搅拌，碱解11-12小时；

3)将水解混合液过滤滤出粗渣后，再将滤液用分子量不大于30000道尔顿的超滤膜进行超滤，两次滤出的滤渣返回NaOH溶液中再进行碱解；所得滤液进行酶解；

4)向超滤所得的滤液中，添加重量为原料干粉0.15～0.2％的木瓜蛋白酶，酶活1000u/mg，以及重量为原料干粉0.15～0.2％的枯草杆菌蛋白酶或沙雷肽酶，酶活

300000u/g，调整溶液pH为6.5～7，在温度为54～56℃下，酶解3.5～4小时，酶解终止时间以酶解液中氨基氮含量不超过总氮含量的3％为准；

5)将所得酶解液用分子量不大于30000道尔顿的超滤膜进行过滤，所得滤液即为蹄甲多肽液体产品。

说明书

一种蹄甲多肽的复合水解制备方法

技术领域：

[0001] 本发明属多肽类生物药物制备方法，特别涉及一种以猪蹄甲为原料，通过水解制备蹄甲多肽的方法。背景技术：

[0002] 蹄甲多肽是从猪蹄甲中经水解获取的具有生物活性的多肽组分，具有显著的止血、抗炎、调整内分泌、提高机体免疫等功能，对功能性子宫出血症、月经不调等妇科疾病，具有独特的治疗作用，而且未出现任何毒副作用，临床上已广泛应用。目前，生产蹄甲多肽的方法主要是酸水解法或碱水解法，碱水解法的报道占多数。

[0003] 最近的相关报道为2010年5月19日中国专利CN 101709076A公开的“一种蹄甲多肽的制备方法”。该方法是一种改进的碱水解生产蹄甲多肽的方法，主要步骤是在pH为8-12、温度为90-100℃的NaOH水溶液中，对猪蹄甲进行水解，以期提高蹄甲多肽的收率和纯度。

[0004] 但是，该方法与传统的酸或碱水解法相同，在单纯追求提高蹄甲水解率的同时，忽略了对药物组分和活性的综合考察，尽管水解率有一定的提高，但并没有带来药物效果的提高，相反，由于其产品中氨基氮占总氮含量高达4％以上，意味着过多的多肽分子被过度水解为对治疗效果没有多大贡献的氨基酸，反而对实际疗效不利。

[0005] 因此，改进和筛选优化猪蹄甲的水解工艺，使其在将大分子蛋白质水解为多肽的同时，能够有效控制多肽组分的过度水解，是当前蹄甲多肽生产过程中急需解决的技术难题。发明内容：

[0006] 为了克服现有蹄甲多肽生产技术中存在的不足，本发明提供了一种采用碱液和蛋白水解酶双重复合水解法生产蹄甲多肽的方法。

[0007] 为了合理筛选工艺路线和工艺条件，本发明人参照前人对蹄甲多肽的药理研究，结合本发明人实际临床应用试验结果，进行综合分析对比后确认，蹄甲多肽成分中，具有药效功能的成分为多肽，特别是相对分子质量范围为10000～3500的多肽组分的实际临床应用试验效果最好，应尽力提高该相对分子质量范围内的多肽组分，同时，摒弃相对分子质量高于30000的组分，并控制其过度水解为相对分子质量低于3500的组分，以最大限度的提高产品药物的凝血、抗炎作用，降低其兴奋子宫的负面功能。

[0008] 为了实现上述发明目的，本发明所提供的技术方案如下：

[0009] 将经过干燥和粉碎后的蹄甲原料，先在碱溶液中进行温和的部分水解；然后使用蛋白水解酶进一步水解，并控制氨基氮含量不超过总氮含量的3％。

[0010] 本发明所述方法的具体操作步骤和条件如下：

[0011] 1.将原料蹄甲进行洗涤、热解、干燥和粉碎，制得原料粉末；

[0012] 2.将原料粉末置于重量为原料干粉的20～22倍、pH为8.4～8.6的NaOH溶液中，在温度为84～86℃下，均匀搅拌，碱解11-12小时；

[0013] 3.将水解混合液过滤滤出粗渣后，再将滤液用分子量不大于30000道尔顿的超滤膜进行超滤，两次滤出的滤渣返回NaOH溶液中再进行碱解；所得滤液进行酶解；

[0014] 4.向超滤所得的滤液中，添加重量为原料干粉0.15～0.2％的木瓜蛋白酶(酶活1000μ/mg)和重量为原料干粉0.15～0.2％的枯草杆菌蛋白酶(酶活30万μ/g)，调整溶液pH为6.5～7，在温度为54～56℃下，酶解3.5～4小时，酶解终止时间以酶解液中氨基氮含量不超过总氮含量的3％为准；

[0015] 5.将所得酶解液用分子量不大于30000道尔顿的超滤膜进行过滤，滤除酶等大分子杂质，所得滤液即为蹄甲多肽产品；经浓缩、干燥、粉碎，用于制备蹄甲多肽口服片剂；或将所得滤液经浓缩、醇提取、再浓缩后，用于制备注射水针剂或冻干粉针剂。

[0016] 采用上述复合水解方法中制得的蹄甲多肽的收率为28％左右，产品中总氮含量为16.5-16.8％，与现有技术基本相近，但产品中氨基氮占总氮量的比例，仅为2.9-3.0％，远低于现有技术的4.2-4.3％，说明多肽的过度水解问题得到了有效地控制，有效多肽成分相对提高，相应的临床应用效果也相应提高。

[0017] 采用高效液相色谱与质谱联用对本发明及现有技术(CN 101709076)所制得的蹄甲多肽分别进行分离、检测，所得的统计对比数据如下：

[0018]

[0019] 由上述分离检测结果可以看出，本发明所制得的蹄甲多肽中具有明显凝血、抗炎效果的多肽含量高于现有技术水平，特别是具有明显药效的相对分子质量10000-3500的组分含量高于现有技术50％，而过度水解所生成的氨基氮含量则低于现有技术的30％。本发明所述方法达到了预期的发明目的。具体实施方式：

[0020] 实施例1.

[0021] 1)将原料蹄甲进行洗涤、热解、干燥和粉碎，制得原料粉末；

[0022] 2)将原料粉末置于重量为原料干粉的20倍、pH为8.6的NaOH溶液中，在温度为86℃下，均匀搅拌，碱解11小时；

[0023] 3)将水解混合液过滤滤出粗渣后，再将滤液用分子量不大于30000道尔顿的超滤膜进行超滤，所得滤液进行酶解；两次滤出的滤渣返回NaOH溶液中再进行碱解；