极端嗜酸热古菌分离纯化固体培养基及配制方法转让专利
申请号 : CN201110095165.8
文献号 : CN102199567B
文献日 : 2013-06-19
发明人 : 夏金兰 , 邱冠周 , 巩三强 , 潘佳民 , 聂珍媛 , 梁长利 , 张瑞永
申请人 : 中南大学
摘要 :
本发明提供了一种分离纯化极端嗜酸热古菌的固体培养基及其配制方法。固体培养基成分为：果冻粉、硫氰酸钾、硫酸亚铁、酵母粉、9K基础培养基。配制方法为(1L)：A液：400～550ml蒸馏水，调pH＝1.8～2.5，加入果冻粉2～3g；B液：9K基础培养基150～300ml，调pH＝1.8～2.5，添加硫氰酸钾5～11g，酵母粉母液(0.2g/L)5～9ml；C液：50～100mL 9K基础培养基，加入硫酸亚铁9～15g，调节pH＝1.8～2.5，采用滤膜过滤除菌；将A、B液分别高温灭菌，冷却5～10分钟，分别纱布过滤后，与C液混合均匀，加蒸馏水至1L。基于该培养基可采用平板法分离和纯化极端嗜酸热古菌。
权利要求 :
1.一种分离纯化万座酸菌或金属硫化叶菌的固体培养基，其特征在于，配制1L所述培养基的配方包括： 硫氰酸钾5~11g、硫酸亚铁9~15g、0.2g/L的酵母粉母液5~9ml、9K基础培养基
200~400ml、果冻粉2~3g，所述的果冻粉购自湖南长沙日成晟食品添加剂厂，产品型号为ZG-30B；余量为蒸馏水； 所述的分离纯化万座酸菌或金属硫化叶菌的固体培养基的配制方法包括以下步骤： A液：400~550ml蒸馏水，调pH=2.5~3，加入果冻粉2~3g，所述的果冻粉购自湖南长沙日成晟食品添加剂厂，产品型号为ZG-30B；
B液：9K基础培养基150~300ml，调pH=1.8~2.5，添加硫氰酸钾5~11g，0.2g/L的酵母粉母液5~9ml； C液：9K基础培养基50~100mL，加入硫酸亚铁9~15g，调节pH=1.8~2.5,采用0.22μm滤膜过滤除菌； 将A、B液分别在121℃灭菌10~30分钟，冷却5~10分钟，纱布过滤后，与C液混合均匀， 加蒸馏水至1L；倒制平板。
2.一种分离纯化万座酸菌或金属硫化叶菌的固体培养基的配制方法，其特征在于，包括以下步骤： A液：400~550ml蒸馏水，调pH=2.5~3，加入果冻粉2~3g，所述的果冻粉购自湖南长沙日成晟食品添加剂厂，产品型号为ZG-30B；
B液：9K基础培养基150~300ml，调pH=1.8~2.5，添加硫氰酸钾5~11g，0.2g/L的酵母粉母液5~9ml； C液：9K基础培养基50~100mL，加入硫酸亚铁9~15g，调节pH=1.8~2.5,采用滤膜过滤除菌； 将A、B液分别高温灭菌，冷却5~10分钟，纱布过滤后，与C液混合均匀， 加蒸馏水至1L；倒制平板。
3.根据权利要求2所述的固体培养基的配制方法，其特征在于，所述的C液采用
0.22μm滤膜过滤除菌。
4.根据权利要求2所述的固体培养基的配制方法，其特征在于，与C液混合前将A、B液 在121℃灭菌10~30分钟。
说明书 :
极端嗜酸热古菌分离纯化固体培养基及配制方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种极端嗜酸热古菌分离纯化固体培养基及其配制方法。
背景技术
[0002] 极端嗜酸热古菌是目前生物地球化学研究的热点之一，它能在高温、强酸/强碱条件、高盐、缺氧等极端环境下存在，其数量巨大，在全球的生物地球化学作用中扮演着重要角色。极端嗜酸热古菌是微生物进化的一个独立分支，由于其较强的铁、硫氧化活性，极端嗜热、嗜酸性，被作为生物冶金机制、古菌遗传机制及嗜热性研究的模式生物。极端嗜酸热古菌大多存在于含硫的酸性温泉中，能氧化亚铁和硫，在60-70℃下，促使氧化剂三价铁的再生，从而加速硫化矿中金属的溶出。大大缩短了浸矿周期，提高了浸矿效率，而被作为矿产资源综合利用和环境保护最有价值的微生物。但是，由于极端嗜酸热古菌的生存条件苛刻，认识相对局限，培养条件很难与自然条件一致，限制了纯培养物的大量获得，种质资源十分有限，并且大多为高温嗜盐古菌，其它种类的纯培养物尤为珍稀。如果能够得到较多的纯培养物，就能够为嗜热古菌的研究提供依据，揭开古菌研究的新篇章。该领域的研究对阐明生命运动的基本规律，揭示生命起源和物种进化，生物圈与地圈环境的相互作用，环境的生物治理，具有重要的意义。
[0003] 目前，极端嗜酸热古菌纯培养物的获得仍然是限制其相关研究及应用的“瓶颈”之一。近些年来，随着分子生物学技术和其他相关技术在微生物分离检测中的应用，越来越多的极端微生物被检测到，并且随着研究的深入和技术的进步，许多微生物从不可培养状态达到了可培养状态，对新分离纯的极端菌的性质的研究也取得了许多新进展。极端微生物分离纯化方法概括起来可分为以下三种：1)模拟自然环境分离得到纯培养。2)利用荧光探针标记已探知的基因，跟踪分离得到纯培养。3)通过极端微生物营养状态研究，实现微生[1]物分离纯化。例如Kaeberlein等 (2002年)利用选择性膜技术和固定化技术，通过限制营养得到不可培养微生物纯培养，其研究方法和思路发表于2002年科学杂志上。Rappé等[2]
(2002年)利用DNA杂交技术从海洋中分离得到大量不可培养微生物纯培养，其中SAR11菌株被确认为目前发现的最小细菌，其研究思路与方法发表在2002年自然杂志上。这些技术推动了极端微生物研究的进步，但是由于其要求苛刻，操作繁琐，很难在实验室推广。因此，大多数研究者依然采用固体培养基分离纯化极端微生物，固体培养基分离纯化是细菌分离纯化的一种常用手段，它是利用细菌先分离、后克隆的原则，形成一个肉眼可见的单菌落进行分离的。常规固体培养基利用琼脂作为凝固剂，琼脂由于形成凝胶后透明度高、保水性好、无毒、不被微生物液化等优点，而被广泛的使用。但是，对极端嗜酸热古菌，利用常规琼脂固体平板分离方法很难获得纯培养物。其原因是过低的pH会造成培养基的胨化，以及琼脂的熔点难以满足高温的要求。近些年来，人们发现无机硅胶、瓜尔胶、卡拉胶黄原胶、刺槐豆角、聚丙烯酸系高分子化合物在某些情况下可以替代琼脂用作凝固剂。可是，这些凝固剂在使用过程中存在的许多弊端，也难以实现极端嗜酸热古菌的分离纯化。因此，寻找一种来源广泛、廉价、优良的替代品是必须的。
(2002年)利用DNA杂交技术从海洋中分离得到大量不可培养微生物纯培养，其中SAR11菌株被确认为目前发现的最小细菌，其研究思路与方法发表在2002年自然杂志上。这些技术推动了极端微生物研究的进步，但是由于其要求苛刻，操作繁琐，很难在实验室推广。因此，大多数研究者依然采用固体培养基分离纯化极端微生物，固体培养基分离纯化是细菌分离纯化的一种常用手段，它是利用细菌先分离、后克隆的原则，形成一个肉眼可见的单菌落进行分离的。常规固体培养基利用琼脂作为凝固剂，琼脂由于形成凝胶后透明度高、保水性好、无毒、不被微生物液化等优点，而被广泛的使用。但是，对极端嗜酸热古菌，利用常规琼脂固体平板分离方法很难获得纯培养物。其原因是过低的pH会造成培养基的胨化，以及琼脂的熔点难以满足高温的要求。近些年来，人们发现无机硅胶、瓜尔胶、卡拉胶黄原胶、刺槐豆角、聚丙烯酸系高分子化合物在某些情况下可以替代琼脂用作凝固剂。可是，这些凝固剂在使用过程中存在的许多弊端，也难以实现极端嗜酸热古菌的分离纯化。因此，寻找一种来源广泛、廉价、优良的替代品是必须的。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种适合极端嗜酸热古菌分离纯化的固体培养基及其配制方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下方式实现的：
[0006] 一种分离纯化极端嗜酸热古菌的固体培养基，配制1L所述培养基的配方包括：
[0007] 硫氰酸钾5～11g、硫酸亚铁9～15g、0.2g/L的酵母粉母液5～9ml、9K基础培养基200～400ml、果冻粉2～3g；余量为蒸馏水。
[0008] 一种分离纯化极端嗜酸热古菌的固体培养基的配制方法，包括以下步骤：
[0009] A液：400～550ml蒸馏水，调pH＝2.5～3，加入果冻粉2～3g；
[0010] B液：9K基础培养基150～300ml，调pH＝1.8～2.5，添加硫氰酸钾5～11g，0.2g/L的酵母粉母液5～9ml；
[0011] C液：9K基础培养基50～100mL，加入硫酸亚铁9～15g，调节pH＝1.8～2.5，采用滤膜过滤除菌；
[0012] 将A、B液分别高温灭菌，冷却5～10分钟，纱布过滤后，与C液混合均匀，[0013] 加蒸馏水至1L；倒制平板。
[0014] 所述的C液采用0.22μm滤膜过滤除菌。与C液混合前将A、B液在121℃灭菌10～30分钟。
[0015] 本发明在对实验室保藏的几株极端嗜酸热古菌生存环境及条件了解的基础上，抓住限制其生长的主要因素，采用一种新型耐高温、耐酸凝固剂，合成一种分离纯化固体培养基，并结合水盘培养法，成功分离纯化了极端嗜酸热古菌万座酸菌(Acidianus manzaensis)和金属硫化叶菌(Sulfolobus metallicus)。该培养基在极端嗜热/嗜酸，中度嗜热/嗜酸及嗜热/嗜酸菌的分离纯化、改良等方面具有广阔的应用前景。
[0016] 采用本发明的培养基并结合水盘培养法，对中南大学教育部生物冶金重点实验室保藏的极端嗜酸热古菌万座酸菌(Acidianus manzaensis)和金属硫化叶菌(Sulfolobus metallicus)进行了检验。结果表明，万座酸菌、金属硫化叶菌能够在合成培养基上形成1mm大小的黄褐色菌落(见图1)，培养基能够应用于极端嗜酸热古菌的分离纯化等领域。
[0017] 该固体培养基与传统固体培养基相比还具有以下两大优点：
[0018] 果冻粉作为凝固剂，其来源广泛且价格低廉(30元/公斤)，传统琼脂粉凝固剂(80元/500g)。
[0019] 作为凝固剂的果冻粉耐受高温(≤95℃)、高酸(≥1.8)，是极端嗜酸热古菌生长的良好媒介。
附图说明
[0020] 图1为本发明培养基分离纯化的万座酸菌、金属硫化叶菌的照片。其中左图为Acidianusmanzaensis；右图为Sulfolobus metallicus。
具体实施方式
[0021] 下面结合实施案例对本发明作进一步说明，而非限制本发明。
[0022] 实施例1
[0023] 1.培养基的合成
[0024] A液：550ml蒸馏水，调pH＝2.5，加入果冻粉2g。果冻粉购自湖南长沙日成晟食品添加剂厂，产品型号为ZG-30B。
[0025] B液：9K基础培养基300ml，调pH＝1.8，加入硫氰酸钾5.83g，酵母粉母液(0.2g/L)9ml。
[0026] C液：9K基础培养基80mL，加入硫酸亚铁9.17g，调节pH＝1.8，采用0.22μm滤膜过滤除菌。
[0027] B液于121℃分别灭菌10分种，冷却5分钟，纱布过滤后，与C液混合均匀，加蒸馏水至1L；倒制平板(9cm)，每板大约20ml。
[0028] 2.细菌活化
[0029] 分别取出冷冻保藏的菌种：万座酸菌(Acidianus manzaensis)、金属硫化叶菌(Sulfolobusmetallicus)(由中南大学生物冶金课题组采用传统无限稀释分离纯化方法获得，并鉴定，现保藏于中南大学生物冶金教育部重点实验室)，分别利用9K基础培养基，并利用硫酸亚铁作为能源，进行活化，待接种菌株进入对数生长期后，分别吸取1ml，进行十倍梯度稀释，分别吸取稀释了10倍和100倍的稀释液各1ml，置于固体培养基中央，涂布平板。
[0030] 3.细菌培养
[0031] 将接种的固体培养平皿放于自制水盘内(医用手术盘，用脱脂棉铺4cm厚，注入大约500ml蒸馏水，定期补足水分)。置于隔水式恒温培养箱(上海一恒-9050)中65℃培养，直至长出肉眼可见的菌落。
[0032] 4.单菌落分离、纯化与鉴定
[0033] 大约4天左右，固体培养基上会长出单菌落(见图1)，分别挑取单菌落，重复上述1-4步骤2-3次，获得纯培养，对其进行生理生化和分子生物学鉴定，确定纯培养物分别为万座酸菌(Acidianus manzaensis)和金属硫化叶菌(Sulfolobus metallicus)。
[0034] 5.细菌再培养实验
[0035] 分别对纯培养物进行液体再培养，重复以上1-4步骤。结果表明：单菌落经过多代再培养后能在培养基上形成黄色菌落，大小和数目与第一次培养相近。
[0036] 实施例2
[0037] A液：450ml蒸馏水，调pH＝3，加入果冻粉2g。果冻粉购自湖南长沙日成晟食品添加剂厂，产品型号为ZG-30B。
[0038] B液：9K基础培养基250ml，调pH＝2，加入硫氰酸钾8g，酵母粉母液(0.2g/L)6ml。
[0039] C液：9K基础培养基100mL，加入硫酸亚铁11g，调节pH＝2，采用0.22μm滤膜过滤除菌。
[0040] B液于121℃分别灭菌10分种，冷却5分钟，纱布过滤后，与C液混合均匀，加蒸馏水至1L；倒制平板(9cm)，每板大约20ml。
[0041] 实施例3
[0042] A液：550ml蒸馏水，调pH＝2.5，加入果冻粉2g。果冻粉购自湖南长沙日成晟食品添加剂厂，产品型号为ZG-30B。
[0043] B液：9K基础培养基180ml，调pH＝2.5，加入硫氰酸钾10g，酵母粉母液(0.2g/L)8ml。
[0044] C液：9K基础培养基60mL，加入硫酸亚铁15g，调节pH＝2.5，采用0.22μm滤膜过滤除菌。
[0045] B液于121℃分别灭菌10分种，冷却5分钟，纱布过滤后，与C液混合均匀，加蒸馏水至1L；倒制平板(9cm)，每板大约20ml。
[0046] 以上实施例2-3制备的培养基也成功分离培养出万座酸菌和金属硫化叶菌的单菌落。
[0047] 参考文献
[0048] [1]Kaeberlein，T.，Lewis，K.，Epstein，S.S.，2002.Isolating″uncultivable″microorganisms in pureculture in a simulated natural environment.Science，296：1127-1129.
[0049] [2]Rappé，M.S.，Connon，S.A.，Vergin，K.L.，Giovannoni，S.J.，2002.Cultivation of the ubiquitousSAR11 marine bacterioplankton clade.Nature，418：630-633.