肝癌组织中具备致瘤潜能的细胞团的分离方法

摘要

本发明公开了一种肝癌组织中具备致瘤潜能的细胞团的分离方法，本发明可以快速、简便和有效地从临床样本中分离到具备体外生长增殖、克隆形成和对抗肿瘤药物耐受能力的细胞团，并且其传代细胞在具备一定的稳定性，是分离和鉴定其中存在的高致瘤性的源头细胞的基础。在目前难以在原代组织中获得足够性状稳定的细胞研究肝癌干细胞及其生活的微环境的条下，研究这些细胞团的细胞组成及在其表现出的维持肿瘤细胞持续增长、耐药和致瘤性中发挥的作用，能够帮助研究者逐步缩小搜索范围，从而最终锁定导致肝癌形成和治疗后复发的元凶肝癌干细胞，结合研究其特定微环境来探索对临床治疗有借鉴价值的可行方案。

权利要求

1.一种临床肝癌样本中样本能够维持肝癌特性的细胞团的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）收集临床标本，利用机械分离和透明质酸酶、IV型胶原酶和DNA酶联合消化制备组织团和细胞悬液；

（2）将组织团和细胞悬液稀释先后用100um和40um孔径的滤网过滤，分别收集能通过

40um滤网的细胞悬液和能通过100um滤网而不能通过40um滤网的细胞团；结合苔盼蓝染色方法细胞计数和统计细胞成活率，能通过40um孔径滤网的组分以单细胞为主要组分，能通过100um滤网而不能通过40um滤网组分为9-29个细胞组成的细胞团；

（3）与能通过40um孔径滤网的以单细胞为主要组分的细胞悬液相比，能通过100um滤网而不能通过40um滤网的细胞团在体外原代培养中表现出明显显著的体外生长能力、耐药能力和克隆形成能力；

（4）通过100um滤网而不能通过40um滤网的组织细胞团，从原代培养得到传代细胞与病理标本在抗人Hepatocyte、CK18、CK19和CD133蛋白的表达上一致；

所述步骤（1）中，所述制备组织团和细胞悬液，其实施步骤为：（1.1）手术完成后30分钟内取Edmondson-Steiner病理分级确定为Ⅱ-Ⅲ级肝癌组织3

1-2cm 置于预冷4℃无钙镁HBSS离心管中；

（1.2）生物安全柜内用组织冲洗液冲洗5遍，在该溶液中除去白色纤维状组织、血凝3

块、组织碎片及明显坏死的组织后，取1.2-1.6g组织块，利用无菌眼科剪分解成1mm 大小组织块，转移至50ml无菌离心管中，加组织冲洗液至50ml，混匀，4℃500rpm离心10分钟，弃上清；所述组织冲洗液的溶剂为无钙镁HBSS，其内含有400U/ml的青霉素和400mg/ml的链霉素；

（1.3）按15ml/g组织加入预热至37℃的消化液，37℃消化1小时，间隔10分钟轻柔混匀消化液30秒；所述消化液的溶剂为William’s E培养基，其内含有0.025%的IV型胶原酶、0.05%的透明质酸酶，10U/ml的DNA酶。

2.根据权利要求1所述临床肝癌样本中样本能够维持肝癌特性的细胞团的分离方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述分别收集能通过40um滤网的细胞悬液和能通过100um滤网而不能通过40um滤网的细胞团，其实施方法为：（2.1）按照消化液1:1-2体积添加4℃预冷组织冲洗液至总体积为50ml，悬液通过

100um滤网除去未消化的组织块；得到悬液用40um滤网继续过滤，收集40um滤网滤过溶液，用4℃组织冲洗液收集和重悬滤网上的组织块，所述组织冲洗液的溶剂为无钙镁HBSS，其内含有400U/ml的青霉素和400mg/ml的链霉素；所述消化液的溶剂为William’s E培养基，其内含有0.025%的IV型胶原酶、0.05%的透明质酸酶，10U/ml的DNA酶；

（2.2）40um滤网滤过悬液和滤网上组织块用4℃预冷组织冲洗液15ml重悬，500rpm离心10分钟，弃上清，用组织冲洗液5ml重悬沉淀；

（2.3）得到成分为两组：能通过40um的细胞悬液和能通过100um滤网而不能通过40um滤网的组织细胞团。

3.根据权利要求1所述临床肝癌样本中样本能够维持肝癌特性的细胞团的分离方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述体外原代培养的方法为：（3.1）培养器皿利用鼠尾胶原预包被，参照细胞计数结果和成活率统计，利用细胞培养

6 6

液将权利要求1步骤1）得到的两种组分调配成含活细胞浓度为2×10/ml的悬液，按10/2

cm 浓度接种至鼠尾胶原预包被的培养皿中；

（3.2）静置15-30分钟后小心吸去培养皿上层细胞培养液，根据培养皿面积大小不同2

按照0.05-0.1ml/cm 比例小心地沿培养皿边沿加入新鲜细胞培养液；CO2培养箱37℃培养2

30-90分钟待60%以上细胞贴壁，间隔30分钟观察并按照0.05ml/cm 比例添加新鲜细胞培养液；

2

（3.3）细胞完成贴壁后按0.5ml/cm 添加新鲜细胞培养液，12小时后换液去除死细胞2

或未贴壁细胞，按1ml/cm 加入细胞培养液，后续培养间隔2-3天后换液。

4.根据权利要求1所述临床肝癌样本中样本能够维持肝癌特性的细胞团的分离方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述从原代培养得到传代细胞的方法为：（4.1）细胞培养皿或洁净无菌载玻片利用鼠尾胶原预包被；

（4.2）待细胞生长至铺满培养皿表面，利用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化后成单细胞后，加入细胞培养液终止消化，接种到鼠尾胶原预包被的培养皿或清洁无菌的载玻片；

（4.3）细胞贴壁后更换，后续培养中2-3天更换细胞培养液。

说明书

肝癌组织中具备致瘤潜能的细胞团的分离方法

技术领域

[0001] 本发明属于肿瘤组织细胞和肿瘤组织细胞原代培养领域，尤其涉及一种肝癌临床标本中性状相对稳定的高生长增殖和致瘤能力及高耐药能力的肝癌细胞亚群的体外获取方法。

背景技术

[0002] 目前认为肿瘤细胞具有异质性（heterogeneous），其中少量癌干细胞，表现出更强的生长增殖、致瘤性和对抗肿瘤药物的耐受能力，是肿瘤形成和维持以及治疗后复发的源头细胞，找到这些细胞并确定其细胞生物学特点有助于发展新的诊疗方案实现恶性肿瘤的早期诊断和靶向治疗方案，降低其发生率和致死率。

[0003] 1997年发现粒细胞性白血病中存在能在免疫缺陷鼠体内大量扩增的白血病干细胞亚群，实体瘤癌干细胞便成了研究者搜寻的目标。2003年，Al-Hajj等报道的人乳腺癌]干细胞和Singh等报道的人脑瘤干细胞为这一研究拉开了序幕。随后，在肺癌 、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和肝癌等恶性肿瘤中先后报道了少量细胞亚群表现出癌干细胞特性。以往的研究发现原发性肝癌组织及相关组织中，能检测到CD133表达于肝硬化假小结外周的卵圆或立方形的肝细胞，或汇管区附近由胆管上皮细胞和肝细胞过渡区域的与成熟肝细胞相+
比体积较小的细胞，这些细胞符合肝干细胞的结构特点；而肝癌细胞系中CD133 细胞表现+
出更强的致瘤性，因此认为CD133 细胞是肝脏癌变的起源细胞(tumor initiating cell)，或癌干细胞样细胞（Cancer stem-like cell），CD133是肝癌干细胞的表面标志得到多家研究机构的认同。与此同时，肝癌细胞系中的侧群细胞（Side Population）表现出的癌干细胞样特征也被报道。随后，研究者在肝癌细胞系中报道了根据不同方法得到的细胞亚群具有肝癌干细胞(Cancer Stem Cell)或癌前体细胞（HCC progenitor-like cells）特性，+
如CD90+肝癌细胞，OV-6 和内源性Wnt/β-Catenin活化的肝癌细胞，表达胰岛素样生长因+ + +
子-1受体和表皮生长因子受体的肝癌细胞，Epcam 肝癌细胞及CD13 细胞等。而在CD133+ +
细胞群内，研究者又分别分离出ALDH 或CD44 的细胞在其表现出的癌干细胞特性中扮演了更加重要的角色。虽然众多关于肝癌干细胞的报道让其真实面目扑朔迷离，但其中存在更强生长增殖、致瘤和耐药能力的细胞亚群得到越来越多的支持证据，而细胞表面表达CD133的细胞亚群得到了多家机构研究结果的支持。

[0004] 目前大部分关于癌干细胞的研究结果都是基于已经建成的肿瘤细胞系，尤其是肝癌干细胞研究更是主要集中于在肝细胞癌细胞系筛选具有更强致瘤性的细胞亚群，对癌干细胞特性的主要考量是其致瘤性，即分选细胞后进行体外成瘤实验或免疫缺陷鼠体内成瘤实验。我国HBV发病率高，相关的肝癌发病率和致死率都非常高，结合肝癌临床样本寻找肝癌干细胞为临床治疗提供参考是非常切实意义的工作。而临床肝癌样本大多伴有较严重的肝纤维化，难以获得活力和数量足够的细胞来完成分选和必要的鉴定，难以在此基础上分离鉴定具有肝癌干细胞特性的细胞亚群。以往的研究表明，即便是癌旁肝组织，接种免疫缺陷鼠BNX皮下能够观察到肿瘤结节的形成，这提示其中存在具有致瘤性能力的功能单位，而需要对目前分离和鉴定肝癌干细胞的策略进行适当的调整。

[0005] 根据干细胞与其生长的微环境（Niche）的关系，研究者认为癌干细胞至少应该具备自我更新、分化和归巢等基本特性，而正是这些特性造成癌干细胞表现出肿瘤生成和耐药等细胞生物学行为，而癌干细胞所有基本特性和表现行为受其Niche对它的支持和调控。肝细胞癌干细胞生长Niche特异性结构目前虽然尚无定论，纤维化是HBV相关的肝癌病程中的一个重要环节，成纤维细胞被认为在肝癌的病程具有非常重要的支持作用。但目前得到广泛认同的其中存在支持肝癌干细胞生长的niche。临床样本中分离得到的单个肝癌细胞在传代过程中分化和难以观察到致瘤能力的原因可能是因为被消化过程损伤或离开支持和调控其生长的微环境相关。

[0006] 因此，分离具有一定数量细胞的细胞团，如果能获得在体外生长增殖、致瘤性和耐药等特性上具有一定优势，并且其传代细胞能够表现出与原始标本比较一致的性状，可以为从临床肝癌样本中分离和鉴定肝癌干细胞提供基础。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种肝癌组织中具备致瘤潜能的细胞团的分离方法。

[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种临床肝癌样本中样本能够维持肝癌特性的细胞团的分离方法，包括以下步骤：

[0009] （1）收集临床标本，利用机械分离和透明质酸酶、IV型胶原酶和DNA酶联合消化制备组织团和细胞悬液；

[0010] （2）将组织团和细胞悬液稀释先后用100um和40um孔径的滤网过滤，分别收集能通过40um滤网的细胞悬液和能通过100um滤网而不能通过40um滤网的细胞团；结合苔盼蓝染色方法细胞计数和统计细胞成活率，能通过40um孔径滤网的组分以单细胞为主要组分，能通过100um滤网而不能通过40um滤网组分为9-29（23.8±6.9）个细胞组成的细胞团；

[0011] （3）与能通过40um孔径滤网的以单细胞为主要组分的细胞悬液相比，能通过100um滤网而不能通过40um滤网的细胞团在体外原代培养中表现出明显显著的体外生长能力、耐药能力和克隆形成能力；

[0012] （4）通过100um滤网而不能通过40um滤网的组织细胞团，从原代培养得到传代细胞与病理标本在抗人Hepatocyte、CK18、CK19和CD133等蛋白的表达上基本一致。

[0013] 本发明的有益效果是，本发明可以快速、简便和有效地从临床样本中分离到具备体外生长增殖、克隆形成和对抗肿瘤药物耐受能力的细胞团，并且其传代细胞在具备一定的稳定性，是分离和鉴定其中存在的高致瘤性的源头细胞的基础。在目前难以在原代组织中获得足够性状稳定的细胞研究肝癌干细胞及其生活的微环境的条下，研究这些细胞团的细胞组成及在其表现出的维持肿瘤细胞持续增长、耐药和致瘤性中发挥的作用，能够帮助研究者逐步缩小搜索范围，从而最终锁定导致肝癌形成和治疗后复发的元凶——肝癌干细胞，结合研究其特定微环境来探索对临床治疗有借鉴价值的可行方案。

附图说明

[0014] 图1是分离细胞生长曲线（P<0.05）；

[0015] 图2是药物阿糖胞苷对分离细胞的生长抑制图（P<0.05）；

[0016] 图3是药物甲氨喋呤对分离细胞的生长抑制图(P<0.05)。

具体实施方式

[0017] 通过机械分离和透明质酸酶、IV型胶原酶和DNA酶联合消化结合获得单细胞悬液和细胞团，比较它们在体外培养过程中生长、克隆形成和耐药能力的差异，发现其中能通过100um滤网而不能通过40um滤网的组分中，存在9-29（23.8±6.9）个细胞组成的细胞团，在体外即能表现出更强的持续生长、体外克隆形成和对抗肿瘤药物的耐受能力，同时其传代细胞能维持表达与组织样本相当的蛋白标志。

[0018] 该发明包括以下步骤：

[0019] 1、收集临床标本，利用机械分离和透明质酸酶、IV型胶原酶和DNA酶联合消化制备组织团和细胞悬液。

[0020] 其中，制备组织细胞悬液的实施步骤为：

[0021] 1.1、手术完成后30分钟内取Edmondson-Steiner病理分级确定为Ⅱ-Ⅲ级肝癌3
组织1-2cm 置于预冷4℃无钙镁 HBSS离心管中；

[0022] 1.2、生物安全柜内用组织冲洗液冲洗5遍，在该溶液中除去白色纤维状组织、血3
凝块、组织碎片及明显坏死的组织后，取1.2-1.6g组织块，利用无菌眼科剪分解成1mm 大小组织块，转移至50ml无菌离心管中，加组织冲洗液至50ml，混匀，4℃ 500rpm离心10分钟，弃上清；

[0023] 1.3、按15ml/g组织加入预热至37℃的消化液，37℃消化1小时，间隔10分钟轻柔混匀消化液30秒。

[0024] 2、将组织团和细胞悬液稀释先后用100um和40um孔径的滤网过滤，分别收集能通过40um滤网的细胞悬液和能通过100um滤网而不能通过40um滤网的细胞团；结合苔盼蓝染色方法细胞计数和统计细胞成活率，能通过40um孔径滤网的组分以单细胞为主要组分，能通过100um滤网而不能通过40um滤网组分为9-29（23.8±6.9）个细胞组成的细胞团。

[0025] 其中，分别收集能通过40um滤网的细胞悬液和能通过100um滤网而不能通过40um滤网的细胞团的实施步骤为：

[0026] 2.1、按照消化液1:1-2体积添加4℃预冷组织冲洗液至总体积为50ml，悬液通过100um滤网除去未消化的组织块；得到悬液用40um滤网继续过滤，收集40um滤网滤过溶液，用4℃组织冲洗液收集和重悬滤网上的组织块；

[0027] 2.2、 40um滤网滤过悬液和滤网上组织块用4℃预冷组织冲洗液15ml重悬，500rpm离心10分钟，弃上期，用组织清洗液5ml重悬沉淀；

[0028] 2.3、得到成分为两组：能通过40um的细胞悬液和能通过100um滤网而不能通过40um滤网的组织细胞团。

[0029] 其中，对能通过40um滤网的悬液结合苔盼蓝染色方法细胞计数和统计细胞成活率方法为：

[0030] A、利用组织冲洗液将能通过40um滤网的悬液细胞悬液稀释至细胞计数板四个计6
数区细胞数在100个左右，即对应的细胞浓度约10/ml；

[0031] B、取稀释好的能通过40um的组织细胞悬液0.9ml置于24孔板中，加入0.1ml0.4%苔盼蓝PBS悬液，混匀1分钟后，5-10分钟内迅速利用血球计数板计数，判断被染成蓝色的细胞为死细胞；

[0032] C、细胞总数= 细胞计数×稀释倍数×获得细胞悬液体积

[0033] 成活率 = 1- 死细胞数/细胞总数。

[0034] 对能通过100um滤网而不能通过40um滤网的细胞团结合苔盼蓝染色方法细胞计数和统计细胞成活率方法为：

[0035] a、利用组织冲洗液将细胞团从40um滤网上洗脱至Φ60mm培养皿，清洗离心后转移到15ml离心管定容成5ml，即权利要求3所述获得悬液体积为常数5ml；

[0036] b、取0.5ml细胞团置于15ml离心管中，用组织冲洗液稀释至2.5ml，连续用该比例稀释至滴加100ul溶液至96孔板中，孔内细胞团数不大于1个目标稀释度；

[0037] c、取适量的细胞团悬液置于15ml离心管，用组织冲洗液稀释至目标稀释度，总体积10ml，混匀后每孔100ul加入96孔板中；

[0038] d、加入PH 7.4 PBS缓冲液配制的0.05%的Ⅳ胶原酶至终浓度0.025%，37℃消化成单细胞，按照9:1的比例加入0.4%的苔盼蓝PBS悬液，混匀染色1分钟后，5-10分钟内迅速计数，判断被染成蓝色的细胞为死细胞；

[0039] e、细胞团中细胞总数为折算方法为：

[0040] 细胞浓度= 平均细胞数×有细胞的培养孔的概率×稀释倍数

[0041] 细胞总数= 细胞浓度×获得细胞团体积

[0042] 成活率 = 1- 死细胞数/细胞总数。

[0043] 3、与能通过40um孔径滤网的以单细胞为主要组分的细胞悬液相比，能通过100um滤网而不能通过40um滤网的细胞团在体外原代培养中表现出明显显著的体外生长能力、耐药能力和克隆形成能力。

[0044] 体外原代培养，获得组分体外原代培养的方法为：

[0045] 3.1、培养器皿利用鼠尾胶原预包被，参照细胞计数结果和成活率统计，利用细胞6
培养液将权利要求1步骤1）得到的两种组分调配成成含活细胞浓度为2×10/ml的悬液，
6 2
按10/cm 浓度接种至鼠尾胶原预包被的培养皿中；

[0046] 3.2、静置15-30分钟后小心吸去培养皿上层细胞培养液，根据培养皿面积大小不2
同按照0.05-0.1ml/cm 比例小心地沿培养皿边沿加入新鲜细胞培养液；CO2培养箱37℃培
2
养30-90分钟待细胞贴壁（60%以上），间隔30分钟观察并按照0.05ml/cm 比例添加新鲜细胞培养液；

[0047] 3.3、细胞完成贴壁后按0.5ml/cm2添加新鲜细胞培养液，12小时后换液去除死细2
胞或未贴壁细胞，按1ml/cm 加入细胞培养液，后续培养间隔2-3天后换液。

[0048] 体外生长能力检测，体外生长能力检测方法为：

[0049] A、96孔板利用鼠尾胶原预包被，接种活细胞细胞密度为2000细胞/孔；

[0050] B、培养24小时后用无钙镁PBS清洗去除未贴壁生长细胞或团块后，更换细胞培养液，后续培养中间隔2天换液，37℃ 5%CO2培养；

[0051] C、在细胞接种后第1、3、6、9和12天，取5个重复孔，每孔加入5mg/ml MTT 10ul37℃孵育4小时；

[0052] D、加入100ul Formazan溶解液37℃继续孵育4小时待结晶紫完全溶解；

[0053] E、用酶标仪检测OD570吸光度值，以OD570为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制生长曲线。

[0054] 耐药能力，耐药能力的检测方法为：

[0055] a、96孔板利用鼠尾胶原预包被，接种活细胞细胞密度4000细/孔；

[0056] b、培养24小时后无钙镁PBS清洗除去未贴壁生长细胞，添加加入含5ug/ml阿糖胞苷或40ug/ml甲氨喋呤的细胞培养液，24小时后小心更换新细胞培养液，后续培养间隔48小时更换细胞培养液，37℃ 5%CO2培养；

[0057] e、从加药后第一天开始连续7天，每天取5个重复孔，每孔加入5mg/ml MTT 10ul37℃孵育4小时；

[0058] d、加入100ul Formazan溶解液37℃继续孵育4小时待结晶紫完全溶解；

[0059] e、用酶标仪检测OD570吸光度值，以OD570为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制曲线。

[0060] 克隆形成能力，克隆形成能力的检测方法为：

[0061] ⅰ、含0.5% 软琼脂的细胞培养液，42℃条件下取1ml铺被于Φ35mm培养皿；

[0062] ⅱ、待基层软琼脂凝集后，置37℃培养箱待温度恒定；

[0063] ⅲ、上层琼脂终浓度0.3%，42℃接种1000个细胞入1ml细胞培养液，迅速混匀铺被于预铺好基层软琼脂的培养皿；

[0064] ⅳ、待琼脂凝集后加入0.5ml细胞培养液，37℃ 5%CO2培养，间隔2-3天更换上层细胞培养液；

[0065] ⅴ、间隔24小时利用倒置显微镜观察细胞克隆生长和形成，最长观察至9天。

[0066] 4、通过100um滤网而不能通过40um滤网的组织细胞团，从原代培养得到传代细胞与病理标本在抗人Hepatocyte、CK18、CK19和CD133等蛋白的表达上基本一致。

[0067] 从原代培养得到传代细胞，从原代培养得到传代细胞的方法为：

[0068] 4.1、细胞培养皿或洁净无菌载玻片利用鼠尾胶原预包被；

[0069] 4.2、待细胞生长至铺满培养皿表面，利用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化后成单细胞后，加入细胞培养液终止消化，接种到鼠尾胶原预包被的培养皿或清洁无菌的载玻片；

[0070] 4.2、 细胞贴壁后更换，后续培养中2-3天更换细胞培养液。

[0071] 抗人Hepatocyte、CK18、CK19和CD133等蛋白的表达，传代细胞Hepatocyte、CK18、CK19和CD133等蛋白表达检测方法为：

[0072] A、接种于载玻片上的细胞或小组织团块除去细胞培养液，PH7.4 PBS缓冲液，置于摇床上50rpm 5分钟，重复清洗3次；

[0073] B、接种于载玻片的细胞利用PH7.4 PBS配制的4%多聚甲醛固定10分钟后用-20℃预冷丙酮固定10分钟；

[0074] C、PBS清洗三次后，3%过氧化氢孵育20分钟后，含1%牛血清白蛋白的PBS室温封闭1小时；

[0075] D、抗人CD133(1:10稀释)、Hepatocye(1:250稀释)、CK18(1:250稀释)、CK19（1:150稀释）和Albumin（1:150稀释） 4℃过夜孵育，含0.1% Tween-20 的PBS（PBST）清洗6次，每次5分钟；

[0076] E、分别用1:250稀释度HRP标记的相应的二抗室温孵育1小时，PBST清洗6次后，DAB显色后，苏木精复染后，显微镜检并采集图像。

[0077] 抗人Hepatocyte、CK18、CK19和CD133等蛋白的表达，病理标本Hepatocyte、CK18、CK19和CD133等蛋白表达检测方法为：

[0078] a、厚度4mm石蜡组织切片用二甲苯脱蜡和梯度乙醇溶液水化后利用标准微波程序进行抗原修复；

[0079] b、3%过氧化氢阻断和1%BSA封闭1小时后；

[0080] c、抗人CD133(1:10稀释)、Hepatocye(1:250稀释)、CK18(1:250稀释)、CK19（1:150稀释）和Albumin（1:150稀释） 4℃过夜孵育，含0.1% Tween-20 的PBS（PBST）清洗6次，每次5分钟；

[0081] d、分别用1:250稀释度HRP标记的相应的二抗室温孵育1小时，DAB显色后苏木精复染，显微镜检及采集图像。

[0082] 组织冲洗液配制方法为：组织冲洗液：含400U青霉素/ml+400mg链霉素/ml的无钙镁HBSS。

[0083] 消化液的配制方法为：消化液：0.025%IV型胶原，0.05%透明质酸酶，10U/mlDNA酶的 William’s E 培养基。

[0084] 细胞培养液的配制方法为：细胞培养液：含17%胎牛血清、5ug/ml胰岛素，1mg/ml牛血清白蛋白，20mM丙酮酸钠，100U青霉素/ml和100mg链霉素/ml的William’s E 培养基。

[0085] 统计分析方法为：利用微软办公软件Excel软件进行student’s t检验，P<0.05判定具有统计意义。

[0086] 利用鼠尾胶原预包被，利用鼠尾胶原预包被的方法为：用0.01mg/ml浓度鼠尾胶2
原按照2ug/cm 密度加入需要预包被的培养介质表面完全覆盖，静置30分钟以上，吸干残余液体，置超净台中过夜风干，超净台内紫外光照30分钟完成包被。

[0087] 收集临床标本方法为：Edmondson-SteinerⅡ-Ⅲ级临床肝癌切除或肝癌移植受者手术切除病肝，HBV阳性，术前影像诊断均为单个癌灶，边界清晰的肝细胞癌患者，肿瘤直径3.2cm-7.4cm（4.4±1.2cm），无血管侵犯和远处转移。

[0088] 下面根据实施例进一步说明本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。

[0089] 实施例1：样本基本资料

[0090] 36例标本均取自HBV阳性，术前影像诊断均为单个癌灶，边界清晰的肝细胞癌患者，肿瘤直径3.2cm-7.4cm（4.4±1.2cm），无血管侵犯和远处转移，所有病肝均存在不同程度纤维化。

[0091] 实施例2：细胞和细胞团块活性

[0092] 利用上述分离方法处理后获得悬液为单细胞与不同大小细胞团块组成的混合物，苔盼蓝染色显示蓝染细胞<5%，利用40um孔径滤网过滤清洗后得到细胞基本为单个细胞，其中含部分胆汁液滴，平均每克组织得到单个细胞数量6 7
5.6-21.4×10(1.312±0.464*10)，苔盼蓝染色显示获得的细胞悬液中活细胞占
95.7±4.5%。取部分获得的小团组织进一步消化后统计其中细胞数量并计算细胞总量，将
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这部分细胞列入统计结果，平均每克样本经本方法处理获得细胞为1.625±0.324*10 细胞。小团组织块内细胞数为9-29（23.8±6.9）个，利用培养基稀释至合适倍数后能够贴附于经鼠尾胶原包被的培养皿表面。苔盼蓝染色结果表明细胞团块继续消化后活细胞占
96.0±3.8%，与获得的单个细胞悬液中活细胞率没有统计上的差异。细胞和细胞团原代培养12小时后贴壁状态没有明显的变化，贴壁细胞约占75-80%。贴壁培养七天后，两组细胞图像显示细胞生长良好，形态呈较为均一的三角形，细胞边界清楚，其中接种组织团块的培养皿中细胞以接种部位为中心成簇生长，而接种单细胞悬液培养皿中细胞呈均匀分布。

[0093] 实施例3：肝癌组织不同蛋白的表达

[0094] 免疫组化结果表明抗人hepatocyte抗体在所有36例肝癌样本中均在肝细胞癌胞膜检测呈阳性；CK19则在胆管上皮细胞呈强阳性：在肝癌组织中，大部分肝癌细胞CK18阳性，在中央静脉周围散在部分细胞胞浆和胞膜均呈抗CK18强阳性；和我们以往的研究结果[1]一致 ，CD133阳性细胞在肝癌细胞中分散成条索状或呈簇状分布。

[0095] 实施例4：小细胞团具有更显著的致瘤能力

[0096] 单个细胞在软琼脂培养过程中，单个细胞在第五天可以观察到细胞分裂现象，但继续培养无明显的克隆形成，第九天镜检常见细胞崩解现象，而利用能通过100um滤网而不能通过40um滤网的细胞团进行软琼脂培养九天后，形成的克隆形态完整，边界清晰，显示出良好的生长状态。初步检测表明小细胞团，培养2-3周后能够继续观察到形成克隆继续扩增并且其中细胞具备传代能力的超过15%。

[0097] 实施例5：传代细胞相关蛋白的表达

[0098] 细胞团原代培养或挑取软琼脂培养的细胞进行传代培养，目前的检测结果表明，传代至四代后，获得的细胞在抗人hepatocyte、CK18、CK19和CD133等蛋白表达上基本一致。所有细胞hepatocyte呈强阳性和CK18强阳性，而CK19则基本上检测不到，而前期研究中我们发现可望作为肝癌干细胞标志物的CD133则部分表达于细胞膜表面，并且表达强度不均一。传代蛋白在这几个标志蛋白的表达上基本与其原始样本中肝癌细胞上这些蛋白的表达一致。

[0099] 实施例6：小细胞团具有更强的生长能力

[0100] 接种能通过40um滤网单细胞为主要组分的悬液和能通过100um滤网而不能通过40um滤网的的细胞团MTT方法检测细胞生长增殖状况。细胞贴壁后第1和第3天，接种单细胞悬液的培养孔OD570值高出接种细胞团的分别高出5.20±1.34%和9.19±2.07%，而在第6、9、12天接种单个细胞的培养孔中，MTT检测显示细胞无显著增加，而接种细胞团的培养孔OD570检测值继续升高（如图1所示），与接种单细胞悬液的相比，接种细胞团的培养孔在接种后第6、9和12天分别相应高出13.26±2.11%、21.78±3.40%和26.40±3.37%。

[0101] 实施例7：小细胞团具有更强的耐药性

[0102] 利用5ug/ml阿糖胞苷处理24小时后，继续培养96小时过程中，接种单细胞和细胞团块的培养孔细胞生长受到抑制，MTT检测表明继续培养96小时后，接种单细胞悬液的培养孔中OD570值降低了28.34%，而接种细胞团的培养孔该吸光度值仅降低23.46%；而如果继续培养到168小时的过程中，接种单细胞悬液的培养孔OD570值继续下降，168小时后降低至51.68%；而接种细胞团的培养孔OD570值升高，168小时后与阿糖胞苷处理24小时时相比，570nm吸光度值降低6.35%（如图2）。

[0103] 40ug/ml甲氨蝶呤处理24小时后，接种单细胞悬液的培养孔在后续培养前72小时细胞生长没有明显表现出受到抑制的趋势，培养48小时后，OD570升高3.89%，随后OD570开始表现出下降趋势，72小时后OD570降低7.98%，培养168小时后OD570降低42.47%。而接种细胞团的培养孔在整个7天168小时培养过程中OD570值没有表现出显著的下降趋势，仅继续培养48小时后，OD570降低5.80%，而培养72小时后OD570即开始升高，但整个过程中升高趋势平缓(如图3所示)，培养72小时后OD570升高10.83%，而168小时后OD570升高27.42%。

[0104] 机械分离得到的1-2mm3的组织样本通过透明质酸酶、Ⅳ型胶原酶和DNA酶联合消化后，通过40um孔径滤网后得到的细胞以单细胞为主，其中存在极少量的由2-5个细胞黏连在一起的小细胞团，为指代和理解方便，本文称之为“单细胞悬液”。能够通过100um孔径滤网而不能通过40um滤网的细胞团经进一步消化成单细胞后计数统计其中细胞最少9个，最多29个，平均细胞数23.8±6.9。

[0105] 同得到的单细胞悬液相比，这些小的“细胞团”在体外培养中表现出更显著的持续生长的能力（如图1所示），同时获得的传代细胞与临床样本中肝癌细胞的hepatocyte、CK18和CK19的表达上保持一致，而作为我们前期研究中发现的癌干细胞的一个重要表面标志物CD133的表达上也表现出较显著的一致性，而CD133同时也是目前得到众多研究机[1-4]构认可的肝癌CSC 的细胞表面标志，这意味着如果将CD133作为一个评价指标，能够通过100um孔径滤网而不能通过40um滤网的细胞团原代培养传代扩增获得的细胞中可望富集到一定数量的CD133阳性细胞，这是进行其中肝癌干细胞分离和鉴定的第一步。同时体外软琼脂克隆形成及对抗肿瘤药物阿糖胞苷和甲氨喋呤的耐受性表明，得到的细胞团具备一定的体外克隆形成能力和耐受能力。

[0106] 而本专利研究发现能够通过100um孔径滤网而不能通过40um滤网的细胞团能够具有一定的比例能够维持稳定的细胞生长增殖能力，其传代细胞与原始标本相比，在一些细胞标志表现一致，存在一定比例的细胞表达目前公认的肝癌干细胞表面标志的同时，体现出可以被本文研究方法检测的致瘤和耐药能力。能够检测到体外生长增殖、致瘤和耐药能力，传代细胞能够在Hepatocyte、CK18、CK19及CD133等抗体表达上与原始标本一致，是进一步从临床标本中富集具备CD133阳性等潜在肝癌干细胞标志的细胞的基础，为研究肝癌样本中致瘤性源头细胞提供可能。能够通过100um孔径滤网而不能通过40um滤网的细胞团能保持源头细胞功能稳定性的同时，保全其必不可少的外部微环境，因而体现与肿瘤特性相关的细胞生物学特征，研究其细胞组成和相互调控是可望为肝癌干细胞研究带来新的进展。