用于检测人类EGFR基因20号基因外显子突变的引物组合物、试剂盒及方法

摘要

本发明属于生物技术领域和医学领域，具体地，本发明涉及一种用于检测人类EGFR基因20号基因外显子突变的引物组合物、试剂盒及方法。该引物组合物包括用于检测EGFR基因外显子20突变的引物，其中用于检测EGFR基因外显子20的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：2，另外包含一条EGFR基因外显子19内部的上游引物SEQ ID NO：3，下游SEQ ID No：4。本发明以人类EGFR基因20号外显子突变为检测对象，利用特异引物组的巢式PCR反应，通过对PCR产物进行微流体芯片检测，实现快速、简单、准确、敏感的诊断人类EGFR基因突变。

权利要求

1.一种用于检测人类EGFR基因20号基因外显子突变的引物组合物，其特征在于其是由如下所述的核苷酸序列的引物组成：

5’- ACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCA-3’ SEQ ID No:1,

5’- TCCAAAATAAAGGAATGTGTGTGTG-3’ SEQ ID No:2,

5’- AAGCCACACTGACGTGCCTCTC-3’ SEQ ID No:3,和

5’- TAGTCCAGGAGGCAGCCGAA -3’ SEQ ID No:4。

2.一种试剂盒，其特征在于至少包括如权利要求1所述的引物组合物和PCR反应液。

3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的PCR反应液包括以下组分：pH8.4的Tris-HCl 40 mM，MgCl2 15～24 mM，KCl 50 mM，(NH4)2SO4 10 mM，dNTP 0.5mM，终浓度

0.06～0.10 U/μL 的Taq DNA聚合酶；所述的引物组合物包括：各10μM的SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物。

说明书

用于检测人类EGFR基因20号基因外显子突变的引物组合

物、试剂盒及方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域和医学领域，具体地，本发明涉及一种用于检测人类EGFR基因20号基因外显子突变的引物组合物、试剂盒及方法。

背景技术

[0002] 肺癌是较为常见的肺原发性恶性肿瘤，发病率和病死率较高，男性肺癌占各种癌病死因第一位，女性则仅次于乳腺癌占第二位。按传统的组织病理学分类，肺癌可分小细胞肺癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌（Non-small-cell carcinoma ，NSCLC）即“非小细胞癌”，包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚，非小细胞肺癌约占肺癌总数的80-85%。

[0003] 上皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR）是上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3) 和 Her 4 (ErbB-4)。EGFR也被称作HER1、ErbB1，突变或过表达一般会引发肿瘤。EGFR是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体。研究表明，EGFR突变基因与酪氨酸激酶抑制类药物使用有疗效关联，这些药物包括Iressa（易瑞沙）和Tarceva（特罗凯）。EGFR 基因突变影响着EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的临床疗效，目前发现EGFR基因突变90%以上的突变位于外显子19-21。EGFR外显子20的点突变或者碱基插入突变，点突变主要是790位密码子出现C-T转换，引起EGFR蛋白中该位点的氨基酸由苏氨酸转变突变为甲硫氨酸（T790M），仅见于药物治疗后复发者，突变使肿瘤对药物产生抗性。碱基插入突变发生在770-775位密码子，在GACAACCCCCACGTGTGTGC序列间，存在8种不同的插入方式，插入片段为3～9个碱基。

[0004] 目前EGFR突变基因的检测方法有DNA测序法、特异性位点的聚合酶链式反应、荧光实时聚合酶链式反应、高效液相色谱法、毛细管电泳分析。相对于DNA测序，其它分子生物学方法尽管灵敏度和／或特异度有所提高，但是大多数方法仍对组织的取材要求较高，需要较多的肿瘤组织和有较高的肿瘤细胞含量。此外，有的方法，如荧光实时聚合酶链式反应、高效液相色谱和毛细管电泳等，需要特殊的仪器设备，因而仍然不能在临床上进行大范围推广。而聚合酶链式反应一单链构象多态性分析（PCR-SSCP），尽管只能做定性的分析，但通过条件优化，临床上可以作为一种初筛突变的方法。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种用于检测人类EGFR基因20号基因外显子突变的引物组合物。

[0006] 本发明的另一个目的是提供一种利用上述的引物组合物制备的试剂盒，以及该试剂盒在检测非小细胞肺癌药物疗效相关的EGFR基因20号基因外显子突变中的应用。

[0007] 本发明的又一个目的是提供一种检测人类EGFR基因20号基因外显子突变的方法，该方法利用本发明提供的试剂盒进行检测，检测耗时少、灵敏度高、特异性好、检测结果稳定。

[0008] 本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的：

[0009] 一种用于检测人类EGFR基因20号基因外显子突变的引物组合物，是由具有如下所述的核苷酸序列的引物组成：

[0010] 5’- ACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCA-3’ SEQ ID No：1,

[0011] 5’- TCCAAAATAAAGGAATGTGTGTGTG-3’ SEQ ID No：2,

[0012] 5’- AAGCCACACTGACGTGCCTCTC-3’ SEQ ID No：3,

[0013] 5’- TAGTCCAGGAGGCAGCCGAA -3’ SEQ ID No：4。

[0014] 该引物组合物包括用于检测EGFR 基因外显子20突变的引物，其中用于检测EGFR 基因外显子20的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：2，另外包含一条EGFR 基因外显子19内部的上游引物SEQ ID NO：3，下游SEQ ID No：4。

[0015] 一种试剂盒，至少包括上述的引物组合物和PCR反应液。作为优选，所述的PCR反应液包括以下组分：pH 8.4的Tris-HCl 40 mM，MgCl2 15～24 mM，KCl 50 mM，(NH4)2SO410 mM，dNTP 0.5mM，终浓度0.06～0.10 U/μl 的Taq DNA聚合酶；所述的引物组合物包括：各10μM的SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物。本试剂盒针对外显子20的突变类型的检测，设计了特异性的引物，当EGFR外显子20基因突变时，扩增产物将出现4条扩增产物，而野生型的只出现2条扩增产物。

[0016] 本发明还提供一种所述的试剂盒在检测非小细胞肺癌药物疗效相关的EGFR基因20号基因外显子突变中的应用。所述的药物为Iressa（易瑞沙）或Tarceva（特罗凯）。本发明的试剂盒用于辅助临床医生诊断出可受益于Iressa（易瑞沙）和Tarceva（特罗凯）等特效药的肺癌患者，适合于非小细胞肺癌患者在进入个体化靶向治疗疗程之前使用，可为病者个体用药提供用药科学依据，降低治疗风险以及患者负担。

[0017] 一种检测人类EGFR基因20号基因外显子突变的方法，包括以下步骤：（1）待测样本处理和模板DNA提取；（2）使用本发明所述的试剂盒对步骤（1）得到的DNA进行巢式PCR扩增；（3）检测步骤（2）所得到的PCR扩增产物。

[0018] 作为优选，步骤（1）中的样本为手术切除的新鲜病理组织、石蜡包埋病理组织、全血、血浆、血清或胸腔积液。

[0019] 作为优选，步骤（3）中的检测方法为微流体芯片检测法。

[0020] 作为优选，本发明的检测方法与微流体芯片检测法相结合，具体包括以下步骤：

[0021] （1）用本发明所述的引物组合物对被测样本的DNA进行巢式PCR扩增，纯野生型、纯突变型和杂合突变型的扩增产物不同；

[0022] （2）扩增产物通过微流体芯片进行检测；

[0023] （3）通过对各检测峰的数量及检测峰位置的判断，确定检测到的片段数量及大小，从而确定被检测的基因，判断临床样本EGFR基因20号外显子的突变情况；

[0024] （4）结果判断：a）出现422bp和152bp两个PCR扩增产物，说明临床样本的EGFR基因20号外显子未出现突变情况，为纯野生型；b）出现422bp和152bp两个PCR扩增产物，以及其他两个条带，说明临床样本的EGFR基因20号外显子发生突变。

[0025] 本发明以人类EGFR基因20号外显子突变为检测对象，利用特异引物组的巢式PCR反应，通过对PCR产物进行微流体芯片检测，实现快速、简单、准确、敏感的诊断人类EGFR基因突变。与现有的检测方法和试剂盒相比，本发明具有以下优点：

[0026] （1）本发明采用SPCR—SSCP（聚合酶链式反应—单链构象多态性分析）技术，定向对人类EGFR基因20号外显子缺失突变进行检测，与微流体芯片检测法的结合，具有灵敏度高、特异性好、速度快、结果直观、可信性好的优点。

[0027] （2）本发明的检测方法与微流体芯片检测法联合，具有自动化程度高、人机界面良好的优点，避免了诸多人为因素所带来的误差，所需时间和费用远远低于常规测序技术，符合临床上的需要。

附图说明

[0028] 图1为EGFR基因20号外显子纯野生型DNA样品的微流体芯片检测图。

[0029] 图2为EGFR基因20号外显子突变型DNA样品的微流体芯片检测图。

[0030] 图3为EGFR基因20号外显子突变型的基因测序图。

[0031] 图4为EGFR基因20号外显子纯野生型的基因测序图。

具体实施方式

[0032] 以下参照具体的实施例及附图来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

[0033] 以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。本发明所述的“PCR”是指聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR），是本领域技术人员熟知的用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性-退火-DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增的一项分子生物学技术。

[0034] 本发明微流体芯片检测法使用的检测仪器是宁波基内生物技术有限公司生产的AMA2100型全自动微流芯片分析仪，该仪器的专利申请号为：CN200910272437.X、CN200920230097.X、CN200910272874.X、CN200910273037.0、CN200920288540.9 、CN200910272436.5。

[0035] 实施例1：试剂盒的组成与配制

[0036] 本发明的试剂盒由PCR反应液、引物和内参引物混合液、阴性对照物、阳性对照物和灭菌双蒸水组成。

[0037] 1.配制PCR反应液：Tris-HCl（pH 8.4）40 mM，MgCl2 15～24mM，KCl 50 mM，(NH4)2SO4 10 mＭ，dNTP 0.5 mM，Taq DNA聚合酶的终浓度为0.06～0.10 U/μl。其中MgCl2最佳的浓度为20 mM，Taq DNA多聚酶的最佳终浓度为0.08 U/μl。

[0038] 2.配制引物组合物的混合液：各10μM的SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物，SEQ ID No:1所示的引物、SEQ ID No:2所示的引物、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物的体积比值为1：1：1：1；

[0039] 3.灭菌双蒸水（ddH2O）；

[0040] 4.阳性对照物：20号外显子发生突变的临床样本DNA；

[0041] 5.阴性对照物：ddH2O。

[0042] 为方便描述本发明的效果，以下各实施例均采用本试剂盒的最优配比，即本发明的试剂盒包括：

[0043] 1. PCR反应液：Tris-HCl（pH 8.4）40 mM，MgCl2 20 mM，KCl 50 mM，(NH4)2SO4 10 mＭ，dNTP 0.5 mM，Taq DNA多聚酶的终浓度为0.08 U/μl；

[0044] 2. 引物组合物的混合液：各10μM的SEQ ID No:1、 SEQ ID No:2、 SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物混合配制而成，SEQ ID No:1所示的引物、SEQ ID No:2所示的引物、SEQ ID No:3所示的引物和SEQ ID No:4所示的引物的体积比值为1：1：1：1 ；

[0045] 3.灭菌双蒸水（ddH2O）；

[0046] 4.阳性对照物：20号外显子发生突变的临床样本DNA；

[0047] 5.阴性对照物：ddH2O。

[0048] 实施例2：临床样本DNA的提取

[0049] 临床样本适用范围包括手术切除的新鲜病理组织、石蜡包埋病例组织、全血、血浆、血清、胸腔积液等，DNA提取试剂盒使用宁波基内生物技术有限公司生产的血液/组织基因组提取试剂盒（注册号：浙甬食药监械（准）字2010第1400013号），按照试剂盒说明书进行操作。本实施例使用此试剂盒分别提取1个正常生理组织样本及29个临床非小细胞肺癌新鲜病理组织样本基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明，提取的正常生理组织样本DNA编号为1号，其它病理组织DNA样本依次编号为2-30号。

[0050] 实施例3：用引物组合物混合液扩增DNA样本

[0051] 实施例为采用本发明所提供的引物组合物序列扩增实施例2所提取的1-30号共30个DNA样品，引物的序列见表2。

[0052] 表2 PCR扩增混合引物序列

[0053]SEQIDNO 引物名称 引物信息方向5′ 3′
1 EGFR20.0 ACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCA
2 EGFR20.1r TCCAAAATAAAGGAATGTGTGTGTG
3 EGFR20.1 AAGCCACACTGACGTGCCTCTC
4 EGFR3r TAGTCCAGGAGGCAGCCGAA

[0054] 1、PCR反应体系见表3。

[0055] 表3

[0056]成份 体积/μl
ddH2O 9.5
PCR反应液 12.5
引物组合物混合液 2
提取的DNA样品 1

[0057] 2、PCR反应程序

[0058] 第一轮（SEQ ID No:1/SEQ ID No:2所示的引物进行PCR反应）

[0059] 94℃ 20sec, 60℃ 20sec, 72℃ 30sec. 35 cycles；

[0060] 第二轮 （SEQ ID No:3/SEQ ID No:4所示的引物进行PCR反应）

[0061] 94℃ 20sec, 63℃ 20sec, 72℃ 20sec. 35 cycles

[0062] 实施例4：微流体芯片检测样本方法

[0063] 本实施例为采用微流体芯片检测实施例3中所扩增出的PCR产物。检测方法如下：

[0064] （1）用权利要求1所述的引物组合物对被测样本的DNA进行巢式PCR扩增，纯野生型、纯突变型和杂合突变型的扩增产物不同；

[0065] （2）扩增产物通过微流体芯片进行检测；

[0066] （3）通过对各检测峰的数量及检测峰位置的判断，确定检测到的片段数量及大小，从而确定被检测的基因，判断临床样本EGFR基因20号外显子的突变情况；

[0067] （4）结果判断：a）出现422bp和152bp两个PCR扩增产物，说明临床样本的EGFR基因20号外显子未出现突变情况，为纯野生型；b）出现422bp和152bp两个PCR扩增产物，以及其他两个条带，说明临床样本的EGFR基因20号外显子发生突变。

[0068] 微流体芯片检测样本具体包括以下操作步骤：

[0069] 1）接通AMA2100型全自动微流芯片分析仪（宁波基内生物技术有限公司生产）电源，仪器预热30分钟。

[0070] 2）连接检测池与主机箱正面输出接口，在缓冲溶液瓶中加入新配制好的缓冲溶液（2% HPMC-50，80mM MES，40mM Tris），将电极和毛细管的两端浸在缓冲溶液中，保持毛细管两端出口在同一水平面上，且毛细管内必须充满缓冲溶液，关好仪器正门，确认仪器各部分连接正确后，按动高压启动按钮，如果发生异常应立即按动高压关断钮，检查并排除故障后，再重新加压。

[0071] 3）进样：在样品池点加20μl样品溶液。

[0072] 4）根据实验需要设定仪器工作参数。其中进样电压为380v，电泳电压为700v。

[0073] 5）运行进样及电泳程序，当DNA条带通过检测点时，其信息由数据采集系统记录下来，并转化为电信号，即开始样品的分析工作，收集芯片检测图谱。

[0074] 按照上述方法检测实施例3中所扩增出的30个DNA样品，其中26号样本检测结果图如图2，检测结果图中出现4个峰，因此判定26号样本为EGFR基因20号外显子杂合突变型；其它样本检测结果都是一样的，如图1，检测结果中只出现2个峰，因此其它29个样本为EGFR基因20号外显子纯野生型。

[0075] 委托Invitrogen上海分公司对图2中所示EGFR基因20号外显子杂合突变型的26号样本和纯野生型的2号样本的扩增结果进行测序比对，EGFR基因20号外显子突变型和野生型的基因测序图分别如图3和图4所示，通过比对可知，26号临床样本扩增得到的序列相比纯野生型基因序列确实存在3bp基因（GTG）的缺失。

[0076] CCCAGCAGGCGGCACACGTGGGGGTTGTCCACGCTGGCCATCACGTAGGCTTCCTGGAGGGAG（突 变型序列）

[0077] GTGGTGGGGGTTGTCCACGCTGGCCATCACG（纯野生型序列）

[0078] 本发明检测方法相比测序方法，不仅耗时少，检测费用也相对较低，对取材和技术要求也没测序方法那么高。