N-保护氨基酸的制造方法

摘要

在本申请中，不对使用微生物菌体或催化剂等生物催化剂制造的氨基酸进行分离，而是将含有氨基酸的反应产物进行酸化处理，使其pH为4以下，然后，在碱性条件下进行氨基保护反应得到N-保护氨基酸。按照上述方法，即使是对使用生物催化剂制造的氨基酸直接(不对氨基酸进行分离)实施保护反应的情况下，通过使用当量～稍过量的保护试剂，即可定量且高效地制造高质量的N-保护氨基酸。

权利要求

1.N-保护氨基酸的制造方法，其中，使用利用具有编码选自氨基酸脱氢酶、转氨酶、酯酶、酰基转移酶、酰胺酶、乙内酰脲酶、腈水解酶、D或L-氨基酸氧化酶、或者具有辅酶再生能力的酶中的至少1种酶的DNA的载体进行转化得到的大肠杆菌，对使用生物催化剂制造的氨基酸不进行分离，而是将含有氨基酸的反应产物进行酸化处理，使其pH为4以下，然后，在碱性条件下使用选自N-烷氧基羰基化剂、N-氨基甲酰化剂或N-酰化剂中的至少1种进行氨基保护反应。

2.根据权利要求1所述的N-保护氨基酸的制造方法，其中，氨基酸是叔亮氨酸。

3.根据权利要求1或者2所述的N-保护氨基酸的制造方法，其中，氨基保护所使用的保护试剂是氯甲酸甲酯、氯甲酸乙酯、氯甲酸苄酯、焦碳酸二叔丁酯中的任意试剂。

4.根据权利要求1或者2所述的N-保护氨基酸的制造方法，其中，酶是氨基酸脱氢酶。

5.根据权利要求1或者2所述的N-保护氨基酸的制造方法，其中，氨基酸脱氢酶是亮氨酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、缬氨酸脱氢酶、赖氨酸脱氢酶或天冬氨酸脱氢酶。

6.根据权利要求5所述的N-保护氨基酸的制造方法，其中，氨基酸脱氢酶来源于球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)。

说明书

N-保护氨基酸的制造方法

技术领域

[0001] 本发明涉及作为医药品或农药的中间体有用的N-保护氨基酸的制造方法。

背景技术

[0002] 无论天然或非天然氨基酸，均是作为医药品或农药的原料或者中间体而被广泛应用的非常有用的化合物。

[0003] 在利用上述氨基酸作为原料或中间体的情况下，为了在将其提供至所希望发生的反应前，抑制该反应中的副反应，而向其分子内存在的羧基和/或氨基导入保护基。

[0004] 在导入所述保护基对氨基进行保护时，通常可以在碱性条件下，通过使用理论当量～稍过量的保护试剂，快速且几乎定量地得到N-保护氨基酸。(非专利文献1、专利文献1)。

[0005] 现有技术文献

[0006] 专利文献

[0007] 专利文献1：日本特开2007-131589公报

[0008] 非专利文献

[0009] 非专利文献1：日本化学会编第5版实验科学讲座16、221-226页

发明内容

[0010] 发明要解决的问题

[0011] 从得到高光学纯度的光学活性氨基酸等理由来考虑，通常可以通过使用生物催化剂来制造氨基酸。使用生物催化剂来制造氨基酸，通常是在水系中进行，但在水系中进行反应的情况下，出于对与水中溶解性高的氨基酸共存的水溶性无机盐进行分离、对氨基酸与菌体/蛋白质成分进行分离的复杂操作等是必要的等理由，其分离纯化效率低下，较为困难。另外，显然利用上述分离纯化无法回收的氨基酸还会导致成本方面的不利情况。因此，在以得到氨基酸的保护体为目的的情况下，从生产效率和费用等观点来看，希望直接使用反应液来进行氨基的保护。

[0012] 然而，通过本发明人等的研究发现，使用生物催化剂制造氨基酸的情况下，在现有方法中，仅使用当量～稍过量的保护试剂，存在无法定量制造N-保护氨基酸的情况。特别是，不对得到的氨基酸进行分离纯化，直接对该氨基进行保护时，上述趋势变得更强烈，令人意外的是，即使存在过量的保护试剂，该保护反应也难以进行。在商业性规模化生产中，认为上述情况会导致制造效率低下以及成本增加，并阻碍了向市场提供廉价有用的氨基酸保护体。

[0013] 鉴于上述情况，本发明提供高效率制造高质量的N-保护氨基酸的方法。

[0014] 解决问题的方法

[0015] 本发明人等对所述技术问题进行了深入研究，结果发现：为了高效地由使用生物催化剂制造的氨基酸来制造N-保护氨基酸，在保护反应前经过酸化处理是非常有效的。

[0016] 即，本发明涉及N-保护氨基酸的制造方法，所述方法不对使用生物催化剂制造的氨基酸进行分离，而是将含有氨基酸的反应产物进行酸化处理，使其pH为4以下，然后，在碱性条件下进行氨基保护反应。

[0017] 发明效果

[0018] 根据本发明涉及的方法，即使在对使用生物催化剂制造的氨基酸直接(不对氨基酸进行分离)实施保护反应的情况下，使用当量～稍过量的保护试剂，也可定量且高效地制造高质量的N-保护氨基酸。

具体实施方式

[0019] 首先，对本发明中使用的氨基酸进行说明。

[0020] 对于作为可以在本发明中使用的氨基酸，没有特别地限定，具体而言，可以列举如下，甘氨酸、丙氨酸、3-氯丙氨酸、β-丙氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸、正亮氨酸、异亮氨酸、别异亮氨酸、叔亮氨酸、苯丙氨酸、高苯丙氨酸、酪氨酸、二碘酪氨酸、苏氨酸、别苏氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、异丝氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、3，4-脱氢脯氨酸、色氨酸、甲状腺素、甲硫氨酸、高甲硫氨酸、胱氨酸、高胱氨酸、α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、α-氨基异丁酸、天冬氨酸、天冬氨酸-β-环己酯、天冬氨酸-β-甲酯、天冬氨酸-β-异丙酯、天冬氨酸-β-苄酯、谷氨酸、谷氨酸-γ-环己酯、谷氨酸-γ-甲酯、谷氨酸-γ-异丙酯、谷氨酸-γ-苄酯、赖氨酸、羟基赖氨酸、鸟氨酸、羟基鸟氨酸、精氨酸、组氨酸、抗荚膜菌素、金刚烷基甘氨酸、牛磺酸、γ-甲酰-N-甲基正缬氨酸、Ng-甲苯磺酰精氨酸、O-苄基丝氨in酸、O-苄基苏氨酸、N -甲酰色氨酸、2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-羟基亚胺乙酸、2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-甲氧基亚胺乙酸、2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-乙醛酸(グリオキシ酢酸)、2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-戊烯酸、3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酸、3-氨基-3-苯基丙酸、苯基甘氨酸、4-羟基苯基甘氨酸、4-氯苯基甘氨酸、4-氯苯丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、3-(1-萘基)丙氨酸、3-(2-萘基)丙氨酸、肌酸、亚丙基亚胺-2-羧酸、Orcylalanine(オルシルアラニン)、麦角硫因、羊毛硫氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸等。

[0021] 在除了甘氨酸以外的氨基酸中，存在光学异构体、立体异构体，因此本发明可以使用其立体异构体，也可以使用其混合物或消旋体。

[0022] 此外，可以将上述氨基酸的羧基转换为其他官能团，具体而言，可以转换为适于使用的酰胺体或酯体。

[0023] 就通过使用本发明中所使用的生物催化剂制造氨基酸而言，例如可以按照以下方法来制造，但并不限定于这些方法。

[0024] 1)使氨基酸脱氢酶或具有生产该酶能力的微生物的培养物作用于相应的酮酸，选择性地对D构型体或L构型体进行氨基化。作为本反应中使用的氨基酸脱氢酶，可以列举如下，例如，亮氨酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、缬氨酸脱氢酶、赖氨酸脱氢酶、天冬氨酸脱氢酶等。

[0025] 2)使转氨酶或具有生产该酶能力的微生物的培养物作用于相应的酮酸，选择性地对D构型体或L构型体进行氨基化。

[0026] 3)使酯酶或具有生产该酶能力的微生物的培养物作用于DL-氨基酸烷基酯，选择性地对D构型体或L构型体进行水解。

[0027] 4)使酰基转移酶或具有生产该酶能力的微生物的培养物作用于L-N-酰基氨基酸，选择性地对D构型体或L构型体进行水解。

[0028] 5)使酰胺酶或具有生产该酶能力的微生物的培养物作用于DL-氨基酸酰胺，选择性地对D构型体或L构型体进行水解。

[0029] 6)使乙内酰脲酶或具有生产该酶能力的微生物的培养物或其处理物作用于5-取代乙内酰脲，选择性地对D构型体或L构型体进行水解。

[0030] 7)使腈水解酶或具有生产该酶能力的微生物的培养物作用于α-氨基硝基化合物，选择性地对D构型体或L构型体进行水解。

[0031] 8)使选择性分解D构型体或L构型体的微生物培养物作用于DL-氨基酸，对氨基酸的一种立体异构体进行水解。

[0032] 9)使D或L-氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶、以及具有辅酶再生能力的酶、或者具有生产该酶能力的微生物的培养物作用于DL-氨基酸，以100％的理论收率，使DL-氨基酸转换为D构型体或L构型体的氨基酸。

[0033] 此外，本发明中所述的“生物催化剂”，是指在制造氨基酸时利用的上述氨基酸脱氢酶等酶，或者具有产生该酶的能力的微生物的培养物或其处理物。在此，“微生物的培养物”是指，含有菌体的培养液或培养菌体，“其处理物”是指，通过物理方法、酶等破碎得到的菌体破碎物、通过离心分离等除去破碎物中的不溶成分从而得到的粗提取液、冷冻干燥菌体、丙酮干燥菌体等。

[0034] 作为“制造氨基酸时利用的酶”，可以列举如下，例如，氨基酸脱氢酶、转氨酶、酯酶、酰基转移酶、酰胺酶、乙内酰脲酶、腈水解酶。

[0035] 作为氨基酸脱氢酶，可以列举如下，例如，亮氨酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、缬氨酸脱氢酶、赖氨酸脱氢酶、天冬氨酸脱氢酶。

[0036] 具体而言，在制造的氨基酸为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸或叔亮氨酸等脂肪族氨基酸的情况下，作为氨基酸脱氢酶，优选亮氨酸脱氢酶、缬氨酸脱氢酶。在制造的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、高苯丙氨酸、金刚烷基甘氨酸等芳香族氨基酸的情况下，作为所使用的氨基酸脱氢酶，优选苯丙氨酸脱氢酶。在制造的氨基酸为谷氨酸、6-羟基正亮氨酸等的情况下，优选谷氨酸脱氢酶。在制造的氨基酸为α-氨基丁酸、α-氨基戊酸、丝氨酸、甘氨酸、3-氯丙氨酸、3-氟丙氨酸等的情况下，优选丙氨酸脱氢酶。

[0037] 其中，作为亮氨酸脱氢酶，只要是具有该酶活性的酶均可任意利用，例如，芽孢杆菌属(Bacillus)、高温放线菌属(Thermoactinomyces)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)微生物来源的酶，优选球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus celeus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、中间型高温放线菌(Thermoactinomyces intermedis)、热醋酸菌(Clostridium thermoaceticum)来源的酶，进一步优选球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)NBRC3341菌株来源的酶。

[0038] 作为苯丙氨酸脱氢酶，只要是具有该酶活性的酶均可任意利用，例如，芽孢杆菌属、芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)、红球菌属(Rhodococcus)、高温放线菌属、短杆菌属(Brevibacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、微杆菌属(Microbacterium)微生物来源的酶。优选栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)、球形芽孢杆菌、脲芽孢八叠球菌(Sporosarcina ureae)、海洋红球菌(Rhodococcus maris)、中间型高温放线菌(Thermoactinomyces intermedius)来源的酶，进一步优选栗褐芽孢杆菌IAM11059菌株来源的酶。

[0039] 关于其他的脱氢酶等，只要是具有该酶活性的酶均可任意利用。

[0040] 需要说明的是，上述各种微生物，可以从专利微生物保藏机构或其他研究机构获得。例如，按照NBRC编号特定的微生物，可以从独立行政法人制品评价技术基础机构生物遗传资源部门获得，按照IAM编号特定的微生物，可以从东京大学分子细胞生物学研究所细胞机能信息研究中心获得。

[0041] 作为上述“具有可以产生在制造氨基酸时所利用的酶的能力的微生物”，可以是野生株或者任意突变株。或者，可以是通过基因操作等遗传学方法来衍生得到的微生物。

[0042] 作为基因操作得到的微生物，可以列举如下，例如，使用具有编码制造上述氨基酸时所利用的酶的DNA的载体进行转化得到的转化体。

[0043] 在制造氨基酸所利用的酶是氨基酸脱氢酶的情况下，优选具有该酶，并且具有下述能力的微生物，所述能力是指具备产生能够再生该酶所依赖的辅酶的酶的能力，可以列举如下，例如，使用下述载体进行转化得到的转化体：所述载体具有编码氨基酸脱氢酶的DNA和编码具备使该酶所依赖辅酶再生的能力的酶的DNA，优选的转化体其具备辅酶再生能力的酶是甲酸脱氢酶或葡糖脱氢酶，进一步优选，转化体的上述甲酸脱氢酶为硫杆菌(Thiobacillus sp.)来源的酶，转化体的上述葡糖脱氢酶为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源的酶。作为导入载体的宿主，可以列举细菌、酵母、丝状菌、植物细胞、动物细胞，从转化的难易和酶的表达效率的观点来看，优选细菌，特别优选大肠杆菌。

[0044] 例如，制造氨基酸所利用的酶是亮氨酸脱氢酶的情况下，作为生物催化剂被使用的微生物，可以列举如下，如通过具有编码亮氨酸脱氢酶的DNA的载体转化得到的转化体，优选通过具有编码亮氨酸脱氢酶的DNA和编码上述甲酸脱氢酶的DNA的载体转化得到的转化体，例如，作为亮氨酸脱氢酶，可以列举使用球形芽孢杆菌NBRC3341菌株来源的酶的WO2007/015511号记载的大肠杆菌HB101(pFTLB)。

[0045] 上述酶或微生物的培养物作用于酮酸等时，可以按照例如下述方法进行。然而，并不限定于下述方法。

[0046] 在水等适宜的溶剂中，添加相应的酮酸、甲酸铵和硫酸铵等包括甲酸与氨的无机+盐类、NAD 等辅酶、以及具有生产上述氨基酸脱氢酶和甲酸脱氢酶能力的上述微生物的培养液或从培养液中取得的培养菌体，在调节pH值的条件下，进行搅拌反应。

[0047] 上述反应在10～70℃、优选在20～60℃的温度条件下进行，保持反应液pH为4～12，优选6～10。酮酸以0.1％～60％(w/w)、优选以1％～30％(w/w)的投料浓度添加。此外，酮酸可以一次添加，也可以分批添加。

[0048] 通常以水溶液的形态获得按照上述制造的含氨基酸的反应产物，但可以共存有机溶剂，进一步地，也可以共存有无机盐。此外，在本发明涉及的方法中，不对得到的氨基酸进行分离，可以以含氨基酸的溶液或浆料的形态进行保护反应，也可以不直接实施保护反应，而是经过以纯化为目的的过滤不溶物等操作。具体而言，作为可能经过的操作，可以列举如下，例如过滤蛋白质等不溶物、蒸馏除去溶剂、使用活性炭处理、通过离心沉降分离菌体、通过离子交换树脂除去无机盐类等。此外，上述操作未必一定要在酸化处理前进行，也可以在酸化处理后适当地实施，进一步地，也可以组合使用多种处理。

[0049] 接下来对酸化处理进行说明。根据该处理，可以提高N-保护氨基酸的制造效率。

[0050] 对于作为可以在酸化处理中使用的酸，没有特别地限定，通常可以使用例如盐酸、硫酸、硝酸等无机酸；甲磺酸、乙磺酸等有机酸。上述酸可以单独使用，也可以混合使用。

[0051] 对于酸的添加形态，没有特殊地限定，可以仅添加酸，也可以使用水和/或有机溶剂将酸稀释后使用。用有机溶剂对酸进行稀释并使用时，该有机溶剂只要不与酸发生反应即可，没有特殊限定。具体而言，可以列举甲醇、乙醇、2-丙醇、甲苯等可以使用的有机溶剂。

[0052] 需要说明的是，优选通过注意搅拌等对上述酸进行混合，以避免局部的强酸性。

[0053] 在本发明中，通过添加上述酸调节溶液的pH为4以下，优选3以下，进一步优选2以下。如上所述，即使使用理论当量～稍过量的保护试剂，也可以高效地制得N-保护氨基酸。

[0054] 保持溶液pH的时间优选5分钟以上，更优选30分钟以上。长时间保持势必损害制造效率，因此，可以通过容易的实验，设定最适保持时间。

[0055] 对于一系列的操作温度没有特殊规定，为了得到简便的操作性，通常设定为0～50℃的范围。

[0056] 经过上述酸化处理的氨基酸，通过使用理论当量～稍过量的保护试剂，即可快速且几乎定量地实施氨基保护。

[0057] 对于作为用于保护氨基的保护试剂，没有特别限定，可以使用公知的试剂，例如可以使用N-烷氧基羰基化剂、N-氨基甲酰化剂和N-酰化剂。更具体来说，优选使用卤代甲酸烷基酯、焦碳酸二烷基酯、烷基异氰酸酯、羧酸酐、烷基碳酰卤化物(アルキルカルボニルハライド)，其中从通用性的观点来看，特别优选使用：氯甲酸甲酯、氯甲酸乙酯、氯甲酸苄酯、焦碳酸二甲酯、焦碳酸二乙酯、焦碳酸二叔丁酯、异氰酸叔丁酯、异氰酸异丙酯、异氰酸苯酯、苯甲酰氯、乙酰氯、乙酸酐。

[0058] 保护反应条件可以采用公知的条件。由于氨基酸与所使用的保护试剂的不同组合，最适条件会有所不同，因此无法统一规定，通常是在碱性条件下进行，反应pH为8～14，优选9～14，反应温度为-5～90℃，优选0～50℃。

[0059] 此外，保护试剂通常设定为0.95当量以上1.20当量以下，优选0.98当量以上1.10当量以下，更优选0.99当量以上1.05当量以下。

[0060] 按照上述，可以从使用生物催化剂制造的氨基酸来高效地制造N-保护氨基酸。

[0061] 需要说明的是，通过上述保护反应制造的N-保护氨基酸，可以通过后续的结晶析出、分级蒸馏、柱色谱等常规方法进行纯化、分离。

[0062] 实施例

[0063] 下面记载了本发明的实施例，然而本发明并不限定于这些实施例。

[0064] (参考例1)使用具有亮氨酸脱氢酶活性的微生物的培养菌体制造L-叔亮氨酸[0065] 将由Bacto胰蛋白胨1.6％(w/v)、Bacto酵母提取物1.0％(w/v)、NaCl0.5％(w/v)组成的2×YT培养基(pH7)50ml分别注入容积为500ml振荡烧瓶(坂ロフラスコ)中，于120℃蒸汽杀菌20分钟。

[0066] 植菌根据WO2007/015511号中记载的方法得到的具有亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶活性的转化体大肠杆菌HB101(pFTLB)，然后于37℃振荡30小时，进行需氧培养，得到具有亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶活性的微生物的培养液。对培养液进行离心分离、收集菌体、并悬浮到培养液上清液中从而调节菌体浓度为培养液的20倍。在容积为1L的可拆式烧瓶中，加入3，3-二甲基-2-氧代-丁酸(DMOB)40g，用30重量％氢氧化钠水溶液将pH调节为7.3，然后添加甲酸铵19.4g、硫酸铵8.2g、硫酸锌七水合物40mg、NAD 61mg、离子交换水256g和相当于3200u的甲酸脱氢酶活性的上述菌体悬浮液，在搅拌条件下，一边使用55重量％硫酸控制pH为7.3，一边于33℃进行反应19小时。通过高效液相色谱(HPLC)分析生成的L-叔亮氨酸的光学纯度和含量，结果显示得到了含有光学纯度100％e.e.的L-叔亮氨酸38.8g的菌体反应液。进一步地，通过离心分离除去得到的一部分菌体反应液中的菌体，得到含有L-叔亮氨酸的水溶液。作为参考，蛋白质的含量为0.0～1.1mg/L。

[0067] 作为HPLC分析中的色谱柱，使用SUMICHIRAL OA-5000(4.6×150mm，住化分析中心公司制造)，作为流动相，使用2mM硫酸铜水溶液与甲醇以容量比95∶5混合的溶液，流速为1.0mL/min，柱温为40℃，检测波长为210nm进行分析。

[0068] (实施例1)

[0069] 使用浓盐酸，将根据参考例制得的含L-叔亮氨酸2.48g(18.4mmol)的菌体反应液的pH调节为4.0。搅拌2小时后，通过30重量％氢氧化钠水溶液调节pH为7.0，并通过离心沉降将菌体成分分离。

[0070] 然后，使用30重量％氢氧化钠水溶液，调节制得的上清液的pH为10.6。随后一边保持在40℃以下一边进行减压浓缩，并调节溶液量至30.1g。

[0071] 在冰冷却搅拌下，向上述溶液中缓慢加入氯甲酸甲酯1.78g(18.8mmol、1.02当量)。此时，添加氯甲酸甲酯会降低pH值，但通过同时加入30重量％氢氧化钠水溶液，保持溶液的pH为9.5～10.5。添加氯甲酸甲酯结束后，搅拌1小时，然后通过HPLC分析的结果为：转化率为98％。

[0072] 需要说明的是，转化率通过以下计算式计算。

[0073] 转化率(％)＝(生成的N-保护-氨基酸的峰面积值)/(氨基酸的峰面积值+生成的N-保护-氨基酸的峰面积值)×100

[0074] 作为HPLC分析中的色谱柱，使用CAPCELLPAKSCX(250×4.6mm i.d.)，作为流动相，使用磷酸缓冲液(pH＝3.3)和乙腈以容量比95∶5混合的溶液，流速为1.0mL/min，柱温为35℃，使用差示折射计作为检测器进行分析。

[0075] 以下的实施例中也进行相同的计算。

[0076] (实施例2)

[0077] 使用浓盐酸，将根据参考例制得的含L-叔亮氨酸3.01g(23.0mmol)的水溶液的pH调节为2.0后，保持2小时。然后，通过30重量％氢氧化钠水溶液调节pH为10.6以后，一边保持在40℃以下一边减压浓缩，并调节溶液量至29.7g。

[0078] 在冰冷却搅拌下，向上述溶液中缓慢加入氯甲酸甲酯2.19g(23.1mmol、1.01当量)。此时，添加氯甲酸甲酯会降低pH值，但通过同时加入30重量％氢氧化钠水溶液，保持溶液的pH为9.8～12.9。添加氯甲酸甲酯结束后，搅拌2小时，然后通过HPLC分析的结果为：转化率为99％。

[0079] (实施例3)

[0080] 使用浓盐酸，将根据参考例制得的含L-叔亮氨酸1.96g(14.9mmol)的菌体反应液的pH调节为4.0。搅拌1小时后，通过离心沉降将菌体成分分离。

[0081] 然后，使用30重量％氢氧化钠水溶液，调节制得的上清液的pH为10.6。随后一边保持在40℃以下一边进行减压浓缩，并调节溶液量至20.1g。

[0082] 在冰冷却搅拌下，向上述溶液中缓慢加入氯甲酸乙酯1.63g(15.0mmol、1.01当量)。此时，添加氯甲酸乙酯会降低pH值，但通过同时加入30重量％氢氧化钠水溶液，保持溶液的pH为8.9～12.8。添加氯甲酸乙酯结束后，搅拌2小时，然后通过HPLC分析的结果为：转化率为96％。

[0083] (实施例4)

[0084] 使用浓硫酸，将根据参考例制得的含L-叔亮氨酸2.05g(15.6mmol)的水溶液的pH调节为2.0后，保持30分钟。然后，通过30重量％氢氧化钠水溶液调节pH为10.7以后，一边保持在40℃以下一边进行减压浓缩，并调节溶液量至19.8g。

[0085] 边搅拌以及保持25℃以下的条件下，边向上述溶液中缓慢加入氯甲酸苄酯2.70g(15.8mmol，1.00当量)。此时，添加氯甲酸苄酯会降低pH值，但通过同时加入30重量％氢氧化钠水溶液，保持溶液的pH为9.9～12.5。添加氯甲酸苄酯结束后，搅拌2小时，然后通过HPLC分析的结果为：转化率为97％。

[0086] (实施例5)

[0087] 使用浓硫酸，将根据参考例制得的含L-叔亮氨酸2.03g(15.5mmol)的水溶液的pH调节为2.0后，保持30分钟。然后，通过30重量％氢氧化钠水溶液调节pH为10.7以后，一边保持在40℃以下一边进行减压浓缩，并调节溶液量至19.6g。

[0088] 在搅拌以及室温条件下，向上述溶液中缓慢加入焦碳酸二叔丁酯3.41g(15.6mmol，1.00当量)。此时，添加焦碳酸二叔丁酯会降低pH值，但通过同时加入30重量％氢氧化钠水溶液，保持溶液的pH为9.5～10.5。添加焦碳酸二叔丁酯结束后，搅拌
2.5小时，然后通过HPLC分析的结果为：转化率为99％。

[0089] (比较例1)

[0090] 使用30重量％氢氧化钠水溶液，将根据参考例制得的含L-叔亮氨酸3.01g(23.0mmol)的水溶液的pH调节为10.6以后，一边保持在40℃以下一边进行减压浓缩，并调节溶液量至30.3g。

[0091] 在冰冷却搅拌条件下，向上述溶液中缓慢加入氯甲酸甲酯2.20g(23.3mmol、1.01当量)。此时，添加氯甲酸甲酯会降低pH值，但通过同时加入30重量％氢氧化钠水溶液，保持溶液的pH为10.0～13.0。添加氯甲酸甲酯结束后，搅拌2小时，然后通过HPLC分析的结果为：转化率为86％。

[0092] (比较例2)

[0093] 使用30重量％氢氧化钠水溶液，将根据参考例制得的含L-叔亮氨酸3.01g(23.0mmol)的水溶液的pH调节为10.6以后，一边保持在40℃以下一边进行减压浓缩，并调节溶液量至30.3g。

[0094] 在冰冷却搅拌下，向上述溶液中缓慢加入氯甲酸甲酯2.20g(23.3mmol，1.01当量)。此时，氯甲酸甲酯会降低pH值，但通过同时加入30重量％氢氧化钠水溶液，保持溶液的pH为10.0～13.0。添加氯甲酸甲酯结束后，搅拌2小时，然后通过HPLC分析的结果为：转化率为86％。