一种高纯度培美曲塞二钠的纯化方法

摘要

本发明提供一种高纯度培美曲塞二钠的纯化方法，该方法是通过将盐析法与有机溶剂/水混合溶剂析晶法相结合实现的，本发明方法在常温下进行，可有效控制纯化产品中的有机杂质和无机杂质的数量和含量，使有机杂质含量符合国家对原料药杂质的鉴定限度要求并明显减少有机杂质数量。

权利要求

1.一种制备高纯度培美曲塞二钠的纯化方法，其特征在于包含以下步骤：（1）将培美曲塞二钠粗品加入水中使之溶解，调节pH值至7.5～8.5，再加入氯化钠溶液，搅拌，直至氯化钠溶液的浓度为8～20%，静置析晶；

（2）过滤，滤饼用8～20%的氯化钠溶液洗涤，抽干；

（3）滤饼加入水中使之溶解，再加入与水混溶的有机溶剂，搅拌，直至有机溶剂量达

70～90%，静置析晶；

（4）过滤，用70～90%的步骤（3）所述有机溶剂洗涤，抽干，减压干燥，上述步骤（3）所述与水混溶的有机溶剂选自乙醇、乙腈和二甲基甲酰胺中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于该方法在5～39℃下操作。

说明书

一种高纯度培美曲塞二钠的纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种培美曲塞二钠盐的纯化方法，属医药技术领域，具体来说属于药品制造领域。

背景技术

[0002] 培美曲塞二钠(Pemetrexed disodium)，化学名称为N-[4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-烷基)乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钠。

[0003] 培美曲塞二钠为多靶点叶酸拮抗剂，由美国礼来公司开发用于治疗肿瘤，联合顺铂可治疗无法手术的恶性胸膜间皮瘤，目前，培美曲塞二钠是世界上唯一治疗恶性胸膜间皮瘤(MPM)的药物，同时用于转移性非小细胞肺癌二线治疗。培美曲塞单药或联合化疗对多种肿瘤有明显的治疗作用，尤其对既往治疗失败的患者，培美曲塞二钠给他们带来了新的机会和希望。

[0004] 培美曲塞二钠的多种制备方法已在专利EP432677、EP589720、WO0011004、EP549886、CN1778797等中公开，但以上方法得到的培美曲塞二钠粗品纯度较低，尤其是有机杂质含量不符合药品注册的要求，不能直接用于培美曲塞二钠制剂的制备，因此需要对其进行纯化。

[0005] 目前公开的培美曲塞二钠纯化方法主要有两种：

[0006] 其一是有机溶剂/水的混合溶剂析晶法：

[0007] 易必新等(易必新，叶海等，培美曲塞二钠的合成.中国医药工业杂志.2006，37(12)：798-800)和朱高军等(朱高军，刘增路等，培美曲塞二钠的合成.中国医药工业杂志.2005，36(12)：727-729)均在文献中公开可采用乙醇-水对培美曲塞二钠进行重结晶纯化。

[0008] 此外，专利WO0114379和CN1406238涉及一种培美曲塞二钠七水合物的制备方法，公开了将包含培美曲塞二钠的水溶液加热至40～60℃，加入丙酮后降温至0～30℃析晶的方法。

[0009] 专利CN1778797公开了将包含培美曲塞二钠的水溶液加热至50℃，加入乙醇冷却至室温析晶的方法。

[0010] 专利CN1778802提及一种制备培美曲塞二钠三水合物的方法，也涉及将培美曲塞二钠从包含培美曲塞二钠、水和一种能与水混溶的有机溶剂中结晶出来的方法，该溶剂包括乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃、乙二醇二甲醚或它们的混合物，其中，加入乙醇的温度应不低于40℃。

[0011] 专利WO9916742、CN1271338和CN1475477涉及70℃下在含有培美曲塞二钠的水溶液中加入6～7倍量醇后降至室温析晶的方法。

[0012] 以上混合溶剂析晶法，一般结合于培美曲塞二钠合成方法之后，用于原料药粗品制备，或用于某种特定晶型粗品的制备，不能达到精制培美曲塞二钠原料药的目的，即使采用以上方法反复操作，仍会有部分有机杂质超过鉴定限度，高效液相色谱法测定结果显示，以上方法对强极性的有机杂质去除效果不佳，此外，混合溶剂析晶法过程采用加热步骤，将大大加剧产品的水解氧化，增加有机杂质的种类和含量。

[0013] 其二是盐析法：

[0014] CN101417998公开了一种培美曲塞二钠的盐析纯化方法，具体为向包含培美曲塞二钠的水溶液中加入一种或多种水溶性盐固体(或其水溶液)，使培美曲塞二钠晶体析出，该方法主要去除培美曲塞二钠原料中的水溶性杂质，且该方法不需加热，可解决加热导致的产品水解氧化的问题。

[0015] 但这种单纯盐析的方法亦存在不足，由于该方法是在水相体系中析晶，因此只能去除部分极性较强的水溶性杂质，难以除去极性小于培美曲塞二钠的有机杂质。采用此方法纯化后的培美曲塞二钠原料，仍有部分杂质含量超出药品注册要求的杂质限度，因此CN101417998A方法仍不能满足高纯度培美曲塞二钠原料的制备要求。

[0016] 国家食品药品监督管理局发布的《化学药物杂质研究的技术指导原则》指出，对于最大日剂量≤2g的原料药，有机杂质的鉴定限度为0.1％，如果有机杂质超出该限度，则应对超出鉴定限度的有机杂质进行结构鉴定，分析其危害性。此外，采用该化学原料药制成的药品，应与原研发企业的产品进行全面的质量对比研究，其有机杂质种类和含量均不得明显高于原研发企业。

[0017] 经测定，以上公开的方法均不能使原料药有机杂质控制在0.1％以下，且经以上方法纯化后的原料制成的制剂，单个有机杂质含量和总有机杂质数量和含量均远远高于原研发公司的进口制剂。此外，盐析法如条件控制不好，还容易引入大量无机盐杂质，不仅降低产品实际收率，还有可能影响产品稳定性。

[0018] 综上所述，现有技术中缺乏一种优良方法，有效去除培美曲塞二钠原料药中的各种杂质，以满足药品注册对原料药杂质限度的要求。

[0019] 对以上文字引入的药品行业专用术语解释如下，其中：

[0020] 术语“化学原料药”是指由化学合成方法制备的，病人无法直接服用的，作为制药用的粉末、结晶等物质，包含活性成分和杂质两部分。

[0021] 术语“药品注册”是指各国药品监管机构依照法定程序，对拟上市销售药品的安全性、有效性、质量可控性等进行审查，并决定是否同意其上市销售的审批过程。

[0022] 术语“有机杂质”，包括工艺中引入的杂质和降解产物等，可能是已知的或未知的、挥发性的或不挥发性的。由于这类杂质的化学结构一般与活性成分类似或具有渊源关系，故通常又可称之为有关物质。

[0023] 术语“鉴定限度(Identification Threshold)”：超出此限度的杂质均应进行定性分析，确定其化学结构。

发明内容

[0024] 本发明针对目前培美曲塞二钠纯化方法中存在的盐析法及混合溶剂析晶法无法有效去除各种杂质以及加热导致降解杂质产生等问题进行了改进，发现利用盐析合并常温下有机溶剂/水混合溶剂析晶操作，可有效地去除培美曲塞二钠原料药中的杂质，使纯化产物符合药品注册对于杂质限度的一般要求。

[0025] 本发明是通过如下技术方案实现的：

[0026] 一种式I所示的培美曲塞二钠的纯化方法，

[0027]

[0028] 该方法包括以下步骤：

[0029] (1)将培美曲塞二钠粗品加入水中使之溶解，用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH值至7.5～8.5，再加入氯化钠溶液，搅拌，直至氯化钠溶液的浓度为8～20％，静置析晶；

[0030] (2)过滤，滤饼用8～20％的氯化钠溶液洗涤，抽干；

[0031] (3)滤饼加入水中使之溶解，加入一种或多种与水混溶的有机溶剂，搅拌，直至有机溶剂量达70～90％，静置析晶；

[0032] (4)过滤，用70～90％的步骤(3)所述有机溶剂洗涤，抽干，减压干燥。

[0033] 该纯化过程可以根据纯化效果重复进行。

[0034] 本发明的盐析纯化过程以及混合溶剂析晶纯化过程的先后顺序可以调换，即，先进行混合溶剂析晶纯化，后进行盐析纯化，也能达到本发明目的。

[0035] 需要指出的是，以上操作均在常温下进行，本专利中常温是相对加热而言的，指5～39℃。

[0036] 步骤(1)中pH值如果在7.5～8.5之间，则不需再进行调节。

[0037] 纯化步骤中的静置析晶时间宜在1～3小时内，不足1小时析晶不充分，收率下降，超过3小时水解加剧，杂质增加。

[0038] 以上纯化步骤中的氯化钠溶液浓度以重量百分含量表示，有机溶剂含量以体积百分含量表示。

[0039] 纯化步骤中的“培美曲塞二钠粗品”是指培美曲塞二钠含量在80～99.5％之间的混合物，但对于培美曲塞二钠含量低于80％的原料药，视情况重复以上操作也可实现纯化目的。

[0040] 纯化步骤中的“水”为注射用水。

[0041] 并非所有有机溶剂均能达到本发明目的，经发明人筛选，纯化步骤中的“与水混溶的有机溶剂”选自乙醇、乙腈和二甲基甲酰胺中的一种或多种。

[0042] 本专利采用高效液相色谱法和氯化物检查法综合评价纯化效果。

[0043] 其中，高效液相色谱法以产品收率、产品纯度、有机杂质数量和最大单一有机杂质含量作为评价指标，考察培美曲塞二钠含量及有机杂质含量。

[0044] 此外，氯化物检查法以氯化物含量为评价指标，考察盐析过程引入的氯化钠杂质是否超标。

[0045] 纯化过程中，步骤(1)的析晶条件是溶液中氯化钠浓度达到8～20％，在此范围内均可实现本发明的效果，优选10～14％，优选范围内，析出培美曲塞二钠的纯度最高，收率最高，杂质数量最少，最大单杂的含量最小。氯化钠浓度小于8％时，培美曲塞二钠析出不足，导致收率下降，氯化钠浓度大于20％时，氯化钠固体大量析出，产品纯度下降。

[0046] 纯化过程中，步骤(3)的析晶条件是溶液中有机溶剂浓度达到70～90％，在此范围内均可实现本发明的效果，优选75～85％，优选条件下，析出培美曲塞二钠的纯度最高，收率最高，杂质数量最少，最大单杂的含量最小。有机溶剂含量小于70％，培美曲塞二钠析出不足，产品收率下降，有机溶剂含量大于90％，杂质含量增加，难以达到除杂要求。

[0047] 纯化步骤(1)中，加入水的量应使原料粗品完全溶解，加水量为原料粗品重量的6～10倍量范围内均可实现；为节约成本，加入的氯化钠溶液浓度应尽可能接近饱和浓度
26.5％，但采用的氯化钠溶液的浓度只要大于20％均可实现本发明；

[0048] 纯化步骤(2)中，洗涤用的氯化钠溶液的浓度，应与步骤(1)中加入氯化钠溶液之后形成的新的氯化钠溶液的浓度一致；

[0049] 纯化步骤(3)中，加入水的量应使滤饼完全溶解，加水量在滤饼重量的10～20倍量范围内均可实现本发明目的；为节约成本，加入的有机溶剂尽量采用无水或含水不超过5％的有机溶剂，但采用有机溶剂的浓度只要大于90％均可实现本发明；

[0050] 纯化步骤(4)中，洗涤用的有机溶剂的浓度，应与步骤(3)中加入有机溶剂之后形成的有机溶剂/水混合体系中有机溶剂的浓度一致。

[0051] 以市场购买某厂的培美曲塞二钠原料1(含量98.86％)说明发明效果，该原料的总杂质含量为1.14％，最大单个杂质含量0.18％(超出杂质鉴定限度(0.1％))，有机杂质总数为15个。对以该原料直接制备的注射用培美曲塞二钠和原研发公司进口的注射用培美曲塞二钠作比较，购买原料制成的制剂总杂质含量和最大单个杂质含量分别为0.84％和0.16％，均远远高于进口制剂(总杂质含量0.20％，最大单个杂质含量：0.06％)。

[0052] 我们采用本专利方法对以上原料进行了纯化精制，使得原料总杂质含量由1.14％降为0.23％，最大单个杂质含量由0.18％降为0.07％以下(符合0.1％的杂质鉴定限度)，有机杂质个数由15个下降为4个，稳定性考察表明纯化后比纯化前的原料更稳定，且制成注射用培美曲塞二钠制剂与原研发公司产品质量接近。

[0053] 按照多种现有技术方法，分别对以上原料进行纯化，原料总杂质可由1.14％下降到0.4～0.8％范围内，最大单个杂质由0.18％下降到0.11～0.16％范围内(仍不符合杂质鉴定限度要求)，有机杂质个数由15个下降到7～8个范围内。且以现有技术方法制成的注射用培美曲塞二钠制剂，其杂质含量及数量仍与原研发公司有较大差距。

[0054] 我们又从市场购得其它厂家原料2～5，纯化结果同样表明本发明可实现制备高纯度培美曲塞二钠的目的，但现有技术方法无法实现该目的。

[0055] 因此，本发明的效果在于可有效去除培美曲塞二钠原料粗品中的杂质，包括有机杂质和无机杂质，与现有技术的显著区别在于，采用本方法操作，有机杂质数量明显减少，可由纯化前的15个下降为纯化后的4个，最大单一有机杂质可控制在药品注册要求的鉴定限度0.1％以下，并可显著减少盐析法引入的无机杂质(氯化钠)，采用本发明方法精制的培美曲塞二钠原料药制成制剂与原研发公司进口产品质量接近，符合国家注册要求。此外，本发明方法成本低廉，操作简单，易于工业化。

附图说明

[0056] 图1：未纯化的粗品高效液相色谱图。

[0057] 图2：按对比例1纯化的高效液相色谱图。

[0058] 图3：按对比例3纯化的高效液相色谱图。

[0059] 图4：按对比例4纯化的高效液相色谱图。

[0060] 图5：本发明方法(实施例1)纯化的高效液相色谱图。

具体实施方式

[0061] 下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施例。

[0062] 实施例1

[0063] 室温下称取培美曲塞二钠原料1(含量98.86％)20g加8倍量水使溶解，加25％氯化钠溶液使氯化钠浓度达12％，搅拌，放置析晶2小时，过滤，滤饼用12％的氯化钠溶液洗涤，抽干，滤饼再加15倍量水溶解，加95％乙醇使含醇量达80％，搅拌后放置2小时析晶。过滤，滤饼用80％乙醇洗涤，抽干，减压干燥，得培美曲塞二钠。

[0064] 实施例2

[0065] 室温下将实施例1减压干燥前的湿品用15倍量水溶解，加25％氯化钠溶液使氯化钠浓度达12％，搅拌，析晶放置2小时，过滤，滤饼用12％的氯化钠溶液洗涤，抽干，滤饼再加15倍量水溶解，加95％乙醇使含醇量达80％，搅拌后放置2小时析晶。过滤，滤饼用80％乙醇洗涤，抽干，减压干燥，得培美曲塞二钠。

[0066] 实施例3

[0067] 室温下称取培美曲塞二钠原料1(含量98.86％)20g加8倍量水使溶解，加25％氯化钠溶液使氯化钠浓度达10％，搅拌，放置析晶2小时，过滤，滤饼用10％的氯化钠溶液洗涤，抽干，滤饼再加15倍量水溶解，加95％乙醇使含醇量达75％，放置2小时析晶。过滤，滤饼用75％乙醇洗涤，抽干，减压干燥，得培美曲塞二钠。

[0068] 实施例4

[0069] 室温下称取培美曲塞二钠原料1(含量98.86％)20g加8倍量水使溶解，加25％氯化钠溶液使氯化钠浓度达14％，搅拌，放置析晶2小时，过滤，滤饼用14％的氯化钠溶液洗涤，抽干，滤饼再加15倍量水溶解，加95％乙醇使含醇量达85％，放置2小时析晶。过滤，滤饼用85％乙醇洗涤，抽干，减压干燥，得培美曲塞二钠。

[0070] 实施例5

[0071] 室温下称取培美曲塞二钠原料1(含量98.86％)20g加8倍量水使溶解，加25％氯化钠溶液使氯化钠浓度达8％，搅拌，放置析晶2小时，过滤，滤饼用8％的氯化钠洗涤，抽干，滤饼再加15倍量水溶解，加95％乙醇使含醇量达70％，放置2小时析晶。过滤，滤饼用70％乙醇洗涤，抽干，减压干燥，得培美曲塞二钠。

[0072] 实施例6

[0073] 室温下称取培美曲塞二钠原料1(含量98.86％)20g加8倍量水使溶解，加25％氯化钠溶液使氯化钠浓度达20％进行盐析，放置2小时析晶，过滤，滤饼用20％的氯化钠洗涤，抽干，滤饼再加15倍量水溶解，加95％乙醇使含醇量达90％，放置2小时析晶。过滤，滤饼用90％乙醇洗涤，抽干，减压干燥，得培美曲塞二钠。

[0074] 对比例1

[0075] 采用CN101417998的专利中的实施例1的操作进行纯化。具体操作为：在20～30℃下，将培美曲塞二钠原料1(含量98.86％)20.0g加入25％饱和的氯化钠水溶液200g，用氢氧化钠溶液调pH11～12溶清，搅拌下加入半饱和的氯化钠水溶液200g，加毕用盐酸溶液回调pH至8左右，继续在在20～30℃下搅拌1～2小时，过滤，滤饼用适量的含水乙醇洗涤，干燥即得培美曲塞二钠。

[0076] 对比例2

[0077] 取上述对比例1中盐析后的纯化产品10.0g，按照对比例1的操作进行第2次盐析，加入的25％饱和氯化钠水溶液和半饱和的氯化钠水溶液用量减半，其它操作方法同对比例1，即得培美曲塞二钠。

[0078] 对比例3

[0079] 室温下称取培美曲塞二钠原料1(含量98.86％)20g加8倍量水使溶解，加95％乙醇使含醇量达80％，放置2小时析晶。过滤，滤饼用80％乙醇洗涤，抽干，减压干燥，得培美曲塞二钠。

[0080] 对比例4

[0081] 取上述对比例1中盐析法干燥前的湿品30.5g(相当于盐析纯化产品10.0g)，加水15倍量溶解，再加入95％的乙醇使含醇量达80％，加热至45℃溶清，静置，降温至室温下析晶2小时。过滤，滤饼用80％乙醇洗涤，干燥，得培美曲塞二钠。

[0082] 对比例5

[0083] 按照CN101417998的专利的技术方案，设计以下纯化过程，具体操作为：在20～30℃下，将培美曲塞二钠原料1(含量98.86％)20.0g加入25％饱和的氯化钠水溶液200g中，用氢氧化钠溶液调pH11～12溶清，搅拌下加入半饱和的氯化钠水溶液200g和无水乙醇250g，加毕用盐酸溶液回调pH至8左右，继续在在20～30℃下搅拌1～2小时，过滤，滤饼用适量的含水乙醇洗涤，干燥即得。测定纯度。

[0084] 实施例7

[0085] 对上述实施例1～6以及对比例1～5的纯化效果，以高效液相色谱(HPLC)法对产品含量及有机杂质含量进行检测，以氯化物检查法检查氯化钠含量。

[0086] (1)高效液相色谱法：

[0087] 仪器条件：安捷伦高效液相色谱仪，以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱，紫外检测器。

[0088] 色谱条件：乙腈-乙酸缓冲液(取冰醋酸1.7ml加水稀释至1000ml，用50％氢氧化钠溶液调节pH5.5)(3∶97)为流动相A，乙腈-乙酸缓冲液(12.5∶87.5)为流动相B，梯度洗脱。

[0089] (2)氯化物检查法：取受试物0.2g，依法检查(中国药典2010版附录VIIIA)，与标准氯化钠溶液10ml制成的对照液比较，不得更浓(0.05％)。

[0090] 结果见下表：

[0091]

[0092] 以上检测结果显示，实施例1～6均可明显减少HPLC法检测出的有机杂质个数，效果明显优于对比例1～5，并可使最大单一有机杂质的含量控制在药品注册要求的鉴定限度0.1％以下，且能避免引入氯化钠杂质，符合原料药纯化工艺基本要求，说明采用本发明方法可有效控制杂质个数及含量。

[0093] 对比例1～2也可显著减少有机杂质数量，但最大单一有机杂质含量不符合药品注册要求的鉴定限度，此外，由于对比例没有优化盐析条件，容易引入大量无机杂质(如氯化钠等)，导致产品纯度下降，无机杂质含量难以从高效液相色谱的测定结果中反映出来，但氯化物检查结果可体现对比例1～2此方面缺陷。

[0094] 对比例3为仅采用乙醇水混合溶剂析晶法对培美曲塞二钠粗品进行纯化，结果显示按照对比例3操作不能有效除去部分极性小于培美曲塞二钠的有机杂质，结果不符合要求。

[0095] 对比例4除在混合溶剂析晶过程中进行加热操作以外，其他步骤均采用与本发明相同的操作，结果显示对比例3可显著增加产品中的有关物质含量，导致最大单一杂质超标，说明纯化过程加热不利于产品质量稳定。

[0096] 按照CN101417998技术方案设计的对比例5表明，盐析过程加入乙醇，只能促进培美曲塞二钠析出，增加收率，不能显著减少杂质含量。

[0097] 实施例8

[0098] 采用市场购买的，不同厂家的，纯度分别为80.26％(原料2)、87.35％(原料3)、95.28％(原料4)和99.55％(原料5)的培美曲塞二钠原料粗品，按照实施例1操作进行纯化后，分别进行检测，检测方法同实施例7，结果如下：

[0099]

[0100] 以上结果表明，本发明对于含量在80～99.5％范围内的培美曲塞二钠粗品均有纯化作用，可以达到本发明所述的使杂质含量控制在药品注册的鉴定限度要求之内的效果。

[0101] 实施例9～14

[0102] 按实施例1的操作，仅将其中的乙醇用以下溶剂替换，分别进行纯化，按实施例7的高效液相色谱法测定结果如下：

[0103]

[0104] 以上结果表明，乙腈或二甲基甲酰胺替代乙醇，也可达到理想的纯化效果，考虑纯化效果、收率和成本的综合结果，优选乙醇。

[0105] 实施例15

[0106] 在5℃下称取培美曲塞二钠原料1(含量98.86％)20g加8倍量水使溶解，加25％氯化钠溶液使氯化钠浓度达20％，搅拌，放置析晶2小时，过滤，滤饼用20％的氯化钠溶液洗涤，抽干，滤饼再加15倍量水溶解，加95％乙醇使含醇量达90％，搅拌后放置2小时析晶。过滤，滤饼用90％乙醇洗涤，抽干，减压干燥，得培美曲塞二钠。

[0107] 按实施例7的高效液相色谱法测定，纯化后有机杂质5个，最大单杂0.09％。

[0108] 实施例16

[0109] 在39℃下称取培美曲塞二钠原料1(含量98.86％)20g加8倍量水使溶解，加25％氯化钠溶液使氯化钠浓度达20％，搅拌，放置析晶2小时，过滤，滤饼用20％的氯化钠溶液洗涤，抽干，滤饼再加15倍量水溶解，加95％乙醇使含醇量达90％，搅拌后放置2小时析晶。过滤，滤饼用90％乙醇洗涤，抽干，减压干燥，得培美曲塞二钠。

[0110] 按实施例7的高效液相色谱法测定，纯化后有机杂质5个，最大单杂0.10％。

[0111] 以上实施例15～16说明，本发明可在5～39℃范围内实现。