抗淋巴囊肿病毒27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体及其制备方法

摘要

本发明公开了一种抗淋巴囊肿病毒27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞ALR，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No.C201128，保藏日期为：2011年4月25日的杂交瘤细胞分泌的。本发明的单克隆抗体在活细胞感染阻断实验中能与牙鲆鳃细胞膜上的LCDV27.8kDa受体蛋白特异性结合，阻止LCDV吸附于27.8kDa受体蛋白并与其结合进而感染FG细胞，因此本发明的单抗G具有阻断LCDV侵染FG细胞的功能。本发明的单抗G可以为弄清LCDV与宿主细胞相互作用关系及其感染机理提供重要工具，为寻找阻断LCDV感染的途径提供技术手段。

权利要求

1. 一种抗淋巴囊肿病毒27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞ALR，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：

CCTCC C201128，保藏日期为：2011年4月25日的杂交瘤细胞ALR分泌的。

说明书

抗淋巴囊肿病毒27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体及其制备

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种单克隆抗体及其制备方法，具体涉及一种抗淋巴囊肿病毒（lymphocystis disease virus，LCDV）27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体及其制备方法，属于分子免疫学和病毒学交叉技术领域。

背景技术

[0002] LCDV是一种具有囊膜的双链 DNA 病毒，属于虹彩病毒科（Iridoviridae）。该病毒在世界范围内可感染至少42科140种以上的海水、咸水和半咸水鱼类，造成野生、养殖及观赏鱼类的淋巴囊肿病。国内外已有的研究涉及LCDV的流行病学、病理学、分子生物学等方面，探明LCDV感染的分子机理、寻找预防和控制LCDV感染的有效方法和措施是目前研究的热点。病毒囊膜蛋白与宿主特异性细胞受体相结合，继而侵入并感染细胞是病毒感染宿主的主要途径，因此，研究LCDV宿主细胞上的病毒特异性受体蛋白，对研究LCDV感染的机理和寻找阻断LCDV感染的途径具有重要意义。我们之前的研究表明牙鲆鳃细胞（flounder gill，FG）表面分子量为27.8kDa蛋白是LCDV的受体蛋白之一，但该受体蛋白在LCDV感染中的作用与功能以及能否利用受体单抗阻断LCDV入侵尚未见报道。因此，制备LCDV受体蛋白的单克隆抗体，可以为弄清LCDV与宿主细胞相互作用关系及其感染机理提供重要工具，为寻找阻断LCDV感染的途径提供技术手段，对养殖鱼类淋巴囊肿病毒病的防治具有重要的理论与实践意义，也为制备LCDV亚单位疫苗及基因工程疫苗提供理论依据和技术基础。

发明内容

[0003] 本发明的一个目的是提供一种由杂交瘤细胞分泌的抗LCDV 27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体；本发明的另一个目的是提供一种抗LCDV 27.8kDa受体蛋白单克隆抗体的制备方法。

[0004] 本发明的目的是由以下技术方案实现的：一种抗LCDV 27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞ALR，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC C201128，保藏日期为：2011年4月25日的杂交瘤细胞分泌的。与所述的单克隆抗体发生特异性结合的抗原决定簇位于FG细胞表面的LCDV 27.8kDa受体蛋白上。

[0005] 在倒置显微镜下观察，生长状态良好的该杂交瘤细胞ALR，其外观饱满、浑圆、折光性强、细胞大小均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞有无限分裂增殖能力；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，其培养基由桃红色转变为黄色，其中含有该杂交瘤细胞分泌的抗LCDV 27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体。

[0006] 一种所述抗LCDV 27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：培养并收集FG细胞，经细胞裂解及差速离心得到FG细胞膜蛋白，利用电泳切胶回收提纯LCDV27.8kDa受体蛋白，以其为抗原免疫Balb/c小白鼠，采用细胞融合制备杂交瘤细胞，经过免疫学检测筛选方法，筛选出分泌抗LCDV 27.8kDa受体蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞ALR，收集杂交瘤细胞株ALR培养上清液，经纯化后即得到抗LCDV 27.8kDa受体蛋白单克隆抗体（单抗G），并采用该受体蛋白单克隆抗体的免疫学鉴定方法鉴定27.8kDa受体蛋白。

[0007] 所述的免疫学检测筛选方法是间接酶联免疫法和转印免疫印迹法。利用间接酶联免疫吸附法与转印免疫印迹法确定该单抗G能与FG细胞上的LCDV 27.8kDa受体蛋白结合。

[0008] 所述的免疫学鉴定方法是间接免疫荧光法、胶体金标记免疫电镜法、阻断酶联免疫吸附法和活细胞感染阻断实验。间接免疫荧光法、胶体金标记免疫电镜法证实27.8kDa受体蛋白位于FG细胞膜上；阻断酶联免疫吸附法与活细胞感染阻断实验证明该单抗G可封闭FG细胞上LCDV的 27.8kDa受体，阻断LCDV的入侵。

[0009] 本发明研制的抗LCDV 27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体在活细胞感染阻断实验中能与FG细胞膜上的LCDV 27.8kDa受体蛋白特异性结合，阻止LCDV吸附于27.8kDa受体蛋白并与其结合进而感染FG细胞，因此本发明的单抗G具有阻断LCDV侵染FG细胞的功能。通过转印免疫印迹检测LCDV在FG细胞上的27.8kDa受体蛋白结合有该单抗G；经间接免疫荧光方法检测，该单抗G与FG细胞膜上的LCDV 27.8kDa受体蛋白特异性结合，在激光共聚焦显微镜下观察，FG细胞膜呈现明亮的点状绿色荧光，而细胞核区域没有荧光；胶体金标记免疫电镜同样证实LCDV 27.8kDa受体蛋白位于FG细胞膜上。本发明的单抗G可以为弄清LCDV与宿主细胞相互作用关系及其感染机理提供重要工具，为寻找阻断LCDV感染的途径提供技术手段。单抗G或经过改造的基因工程抗体很可能成为鱼类LCDV的治疗药物或疫苗，通过口服或注射等方式进入鱼体内，为预防或治疗鱼类淋巴囊肿病毒病起积极作用。

附图说明

[0010] 图1为抗原LCDV 27.8kDa受体蛋白纯化结果图。

[0011] 图2为单抗G的转印免疫印迹检测结果图。

[0012] 图3 为单抗G的间接免疫荧光检测结果图。

[0013] 图4 为单抗G胶体金标记免疫电镜结果图。

[0014] 图5为单抗G的活细胞阻断实验结果图。

[0015] 图6为单抗G的阻断酶联免疫吸附结果图。

[0016] 参见图1-图6。

[0017] 图1中：M是标准分子量蛋白的考马斯亮蓝染色结果；1表示提取的FG细胞膜蛋白的考马斯亮蓝染色结果；2表示提纯的27.8kDa受体蛋白考马斯亮蓝染色结果。

[0018] 图2中：M是标准分子量蛋白的考马斯亮蓝染色结果；1表示提取的FG细胞膜蛋白的考马斯亮蓝染色结果；2表示本发明的单抗仅与LCDV 27.8kDa受体蛋白发生反应；3表示阴性对照无反应。

[0019] 图3中：A显示单抗G与FG细胞膜上的LCDV 27.8kDa受体蛋白反应呈绿色荧光；B表示阴性对照无荧光。

[0020] 图4中：A显示完整的FG细胞；B,C是A的局部放大，可见胶体金粒子主要存在细胞膜上。

[0021] 图5表示FG细胞感染LCDV 5天后，单抗G阻断LCDV的效果。A是FG细胞与单抗G预孵育后，FG细胞感染LCDV的结果；B是FG细胞与骨髓瘤上清预孵育后，FG细胞感染LCDV的结果；C是正常细胞；*为细胞病变（CPE）。

[0022] 图6表示利用阻断酶联免疫法检测单抗G对LCDV的阻断效果。阳性对照表示FG细胞膜蛋白和骨髓瘤上清反应，再与LCDV反应，由酶联免疫吸附检测得到的OD值结果；G表示FG细胞膜蛋白和单抗G反应后再与LCDV反应，由酶联免疫吸附检测得到的OD值结果；阴性对照表示FG细胞膜蛋白和单抗G反应再与失活的LCDV反应，由酶联免疫吸附检测得到的OD值结果。

具体实施方式

[0023] 下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。

[0024] 本发明的抗LCDV 27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞ALR，保藏号为：CCTCC C201128的杂交瘤细胞分泌的。

[0025] 实施例1：

[0026] 所述的分泌抗LCDV 27.8kDa受体蛋白的一株杂交瘤细胞ALR，其制备方法如下：

[0027] 一、抗原的制备

[0028] （1）FG细胞膜蛋白的抽提：

[0029] 利用75cm2培养瓶大量培养FG细胞，将FG细胞用PBS清洗两遍，用预冷的细胞刮将贴壁生长的细胞从底面刮离，PBS重悬，500g 4℃离心10min；取FG细胞沉淀用预冷的NP-40细胞裂解液(250 mM 蔗糖，20 mM Tris-HC1 pH8.0，137 mM NaC1，10% 甘油，l% NP-40，及各种蛋白酶抑制剂：1mM PMSF，2 mM EDTA，10 mM NaF，2μg／mL Aprotinin和5μg／mL Leupetin)重悬，超声波冰浴破碎，设定时间为3 min，其中2s开，6s关，39%的振幅；破碎后的细胞悬液经1,000 4℃离心10 min，去除细胞碎片和细胞核；将上清稀释4倍，10,000g 4℃离心10 min去除溶酶体和线粒体；取上清于100,000g 4℃离心20 min，沉淀用PBS重悬，为提取的FG细胞膜蛋白。

[0030] （2）27.8kDa受体蛋白的提纯：

[0031] 将步骤（1）提纯的FG细胞膜蛋白加入等体积含十二烷基磺酸钠的样品缓冲液，在沸水中煮3-5min后，加入电泳仪（Mini-PROTEAN Ⅱ，Bio-Rad）上样孔中，电泳。取出电泳后的凝胶放在CuCl2可逆染色液（CuCl2 2H2O 5.11克溶于100ml双蒸水中）中染色，切下27.8kDa蛋白条带，脱色、洗脱、透析、冷冻干燥后，以PBS溶解并调整蛋白浓度至1mg/ml，分装50μl/管，冻存于-80℃（图1）。

[0032] 二、免疫小鼠

[0033] 以步骤一提纯的27.8kDa受体蛋白为抗原，免疫Balb/c小鼠，免疫共分4次，前2次免疫间隔为2周，腹腔注射；后2次免疫间隔为1周，为尾静脉注射：

[0034] 第1次，基础免疫，提纯的27.8kDa受体蛋白与福氏完全佐剂等体积混匀，每只注射100μl；

[0035] 第2次，加强免疫，提纯的27.8kDa受体蛋白与福氏不完全佐剂等体积混匀，每只注射100μl；

[0036] 第3-4次，加强免疫，每只注射提纯的27.8kDa受体蛋白注射50μl。

[0037] 三、细胞融合

[0038] （1）脱颈椎处死免疫小鼠，无菌取出脾脏和胸腺后，分别过100目网筛，用RPMI-1640溶液吹打形成单细胞悬液；

[0039] （2）分别将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液1000rpm离心3min，弃去上清液，脾细胞沉淀用RPMI-1640溶液重悬，胸腺细胞沉淀用含有1%HAT的RPMI-1640 (含10%胎牛血清)选择性细胞培养液重悬。

[0040] （3）取3×107个处于对数生长期的P3-X63-Ag8U1骨髓瘤细胞，1000rpm离心3min，去上清液后，用RPMI-1640溶液重悬；

[0041] （4）将脾细胞悬液与瘤细胞悬液混合均匀后，1000rpm离心3min，完全吸去上清液，轻弹离心管底，使两种细胞沉淀充分混匀成糊状；用吸管吸取预温到37℃的PEG溶液lml，缓缓滴加到离心管内；然后在37℃水浴静置5min；

[0042] （5）继续滴加已经预温到37℃的RPMI-1640溶液15m1，使PEG稀释而失去作用；

[0043] （6）补加RPMI-1640溶液至40ml，经1000rpm离心3min，弃去上清液；

[0044] （7） 将沉淀的细胞用3ml37℃的RPMI-1640(含10%胎牛血清)细胞培养液重悬，冻存2ml；

[0045] （8）将剩下的1ml细胞悬液加入(2)制成的胸腺细胞悬液，混合均匀后滴加到96孔培养板中；

[0046] （9）将培养板放入37℃，CO2浓度为4.5%的培养箱中培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，大约两周后，取杂交瘤细胞培养上清液检测。

[0047] 四、筛选和克隆

[0048] (1）初步筛选：融合后，待杂交瘤细胞群长到96孔培养板的孔底面积1/3时开始检测，采用间接酶联免疫技术筛选阳性杂交瘤细胞。

[0049] ① 包被抗原：将提纯的27.8kDa受体蛋白用碳酸盐包被液（pH 9.6）1:10稀释，加入96孔酶标板中（50µl/孔），4℃包被过夜；

[0050] ② 吸出包被液，用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤，每次5min，洗3次；

[0051] ③ 每孔加入200µl 3%的牛血清白蛋白(PBS配)，37℃封闭1h；

[0052] ④ 同②法洗涤3次；

[0053] ⑤ 将杂交瘤细胞培养上清作为第一抗体按每孔50µl加入酶标板，37℃温箱孵育1h；

[0054] ⑥ 同②法洗涤3次；

[0055] ⑦ 碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig（1:4000稀释）作为第二抗体按每孔50µl加入酶标板，37℃温箱孵育1h；

[0056] ⑧ 同②法洗涤3次；然后每孔加入100µl 4-硝基酚磷酸盐（pNPP）应用液，暗处反应5－20min，每孔加入50µl 2M的NaOH，稳定3-5min即可用405nm工作波长测定OD值。

[0057] 测波长为405nm时各孔光吸收值，计算各实验孔与阴性对照光吸收值之比（P/N），当P/N≥2.1时该孔为阳性。

[0058] （2）克隆：采用有限稀释法对检测为阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆，步骤如下：

[0059] ① 脱颈椎处死小鼠，取胸腺，制成单细胞悬液；

[0060] ② 胸腺细胞悬液1000rpm离心3min，弃去上清,沉淀用10ml RPMI-1640(含10%胎牛血清)细胞培养液重悬；

[0061] ③ 取阳性孔的杂交瘤细胞约100个，加入10ml胸腺细胞悬液中；

[0062] ④ 细胞悬液用滴管吹打均匀，滴加到96孔培养板中，每孔100µl，平均每个孔约含有一个杂交瘤细胞；

[0063] ⑤ 培养板放入37℃ CO2培养箱中培养；

[0064] ⑥ 两周后按照本实施例步骤四（1）所述方法检测单个克隆孔的杂交瘤细胞培养液；

[0065] ⑦ 把所得阳性单个克隆孔的杂交瘤细胞按上述方法再克隆一次，以保证为抗体阳性单克隆。

[0066] 五、冻存

[0067] 取生长旺盛，形态良好的杂交瘤细胞，制成细胞悬液，200g离心5min，去上清，加6
冻存液（9份RPMI-1640培养基＋1份二甲亚砜），使最终细胞密度约为5×10 个/ml，将1ml细胞悬液装于2ml冻存管中，拧紧螺盖，然后将冻存管装入盛有棉花的小盒内，放于-80℃超低温冰箱内过夜（8-12小时）后，再浸入液氮内长期保存。本发明获得的生长旺盛，形态良好的杂交瘤细胞，其名称为：杂交瘤细胞ALR，保藏号为：CCTCC C201128，保藏日期为：2011年4月25日。

[0068] 实施例2：

[0069] 本发明单抗的间接酶联免疫法鉴定：

[0070] (1)包被抗原：将LCDV 27.8kDa受体蛋白用碳酸盐包被液（pH 9.6）1:10稀释，加入96孔酶标板中（50µl/孔），4℃包被过夜；

[0071] (2) 吸出包被液，用PBST洗涤，每次5min，洗3次；

[0072] (3) 每孔加入200µl 3%的牛血清白蛋白(PBS配) 37℃封闭1h；

[0073] (4) 同②法洗涤3次；

[0074] (5) 将上述筛选和克隆出的杂交瘤细胞培养上清作为第一抗体按每孔50µl加入酶标板，37℃温箱孵育1h；

[0075] (6) 同②法洗涤3次；

[0076] (7) 碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig（1:4000稀释）作为第二抗体按每孔50µl加入酶标板,37℃温箱孵育1h；

[0077] (8) 同②法洗涤3次；然后每孔加入100µl pNPP应用液，暗处反应5-20min，每孔加入50µl 2M的NaOH，稳定3-5min即可用405nm工作波长测定OD值。

[0078] 用包被PBS作为阴性对照，测波长为405nm时各孔光吸收值，计算阳性血清与PBS光吸收值之比（P/N），当P/N≥2.1时为阳性。

[0079] 结果：阳性：0.4311；阴性对照：0.0967。此结果证实本发明单抗能与27.8kDa受体蛋白发生特异性结合反应。

[0080] 实施例3:

[0081] 本发明单抗的转印免疫印迹法鉴定：

[0082] （1）十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳：

[0083] ①将FG细胞膜蛋白加入等比例含十二烷基磺酸钠的样品缓冲液，在沸水中煮3-5min；

[0084] ②将①处理过的样品加入上样孔中，每孔内加样品10µl，在恒流条件下，起始时用低电流(30-40mA)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电流（50-70mA），电泳至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取出凝胶；

[0085] ③剪取一块与电泳凝胶相同大小的硝酸纤维素膜(孔径0.22µm)以电转移缓冲液（电转移缓冲液：25mM Tris-Base，192mM甘氨酸，20%甲醇，pH 8.3）润湿，放在电泳后的凝胶上。在硝酸纤维素膜上剪掉一个角，以标志样品顺序的起始端。用润湿的滤纸支持,将第二块润湿的滤纸贴在凝胶片的另一面；按上述放置顺序，使胶块与硝酸纤维素膜及滤纸形成一套夹心的"三明治"；

[0086] ④将"凝胶三明治"置入盛有电转移缓冲液的电泳槽内，将硝酸纤维素膜面向阳极；电泳恒流200mA，通电5h；

[0087] ⑤转移完毕，取出硝酸纤维素膜。

[0088] （2）免疫印迹：

[0089] ①将硝酸纤维素膜用PBS洗10min，然后置3%的牛血清白蛋白溶液（PBS配）中封闭1h，37℃；

[0090] ②用PBST洗3次，每次5min；

[0091] ③将硝酸纤维素膜置于杂交瘤细胞培养上清中，37℃缓慢摇动1h；以骨髓瘤细胞培养上清孵育硝酸纤维素膜作为阴性对照；

[0092] ④同②法洗涤3次；

[0093] ⑤将硝酸纤维素膜加入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig抗体(1:4000稀释)中，37℃缓慢摇动1h；

[0094] ⑥同②法洗涤3次；

[0095] ⑦把硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶发色液（NBT-BCIP发色液）中发色，直到颜色清晰为止；

[0096] ⑧用去离子水洗涤，以终止反应。将硝酸纤维素膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。

[0097] 结果：本发明单抗与FG细胞膜蛋白上分子量为27.8kDa的蛋白发生特异性反应，而阴性对照无条带显示（图2）。

[0098] 实施例4：

[0099] 本发明单抗的间接免疫荧光检测：

[0100] （1）取正常培养FG细胞，胰蛋白酶消化后制成密度为106的单细胞悬液，滴一滴于干净的载玻片上，室温静置1h后，丙酮固定，-20℃保存备用；

[0101] （2）吸取杂交瘤细胞培养液，滴加在切片上，37℃湿盒中孵育45min；

[0102] （3）用PBST洗涤3次，每次5min；

[0103] （4）将异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠IgG抗体液滴加在切片上，37℃湿盒中避光孵育45min；

[0104] （5）取出载玻片，同步骤③洗涤；封片，用激光扫描共聚焦显微镜观察。

[0105] 结果：本发明单抗G与FG细胞膜上的27.8kDa受体蛋白特异性结合，在激光扫描共聚焦显微镜下观察，FG细胞膜呈现明亮的点状绿色荧光，FG细胞内的细胞核区域没有阳性荧光（图3）。

[0106] 实施例5：

[0107] 本发明单抗G的胶体金免疫电镜检测：

[0108] （1）电镜超薄切片的制备：

[0109] ①取正常培养FG细胞，胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，3000rpm离心5min，弃上清；

[0110] ②沉淀用含2%戊二醛的PBS溶液4℃固定2h；

[0111] ③用1%锇酸固定30min；

[0112] ④乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋，干燥，制备超薄切片。

[0113] （2）免疫电镜

[0114] ①超薄切片后, 镍网捞片；

[0115] ②1%H2O2 处理30min,以暴露抗原，双蒸水清洗；

[0116] ③3%牛血清白蛋白（溶解于PBS）于37℃封闭45min；

[0117] ④PBST浸洗3次，每次5min；

[0118] ⑤加入杂交瘤细胞培养液，37℃孵育45min；

[0119] ⑥同④法洗涤3次；

[0120] ⑦加入15-nm的胶体金标记羊抗小鼠IgG，1：100稀释，37 ℃孵育45 min；

[0121] ⑧同④法洗涤3次；

[0122] ⑨双蒸水浸洗3次，晾干，然后2%的磷钨酸负染色1 min。

[0123] ⑩吸去残留染液，电镜观察，拍照。

[0124] 结果：胶体金粒子结合于FG细胞膜上，说明本发明单抗G可与FG细胞膜上的27.8kDa受体蛋白结合（图4）。

[0125] 实施例6：

[0126] 本发明制备的抗LCDV 27.8kDa受体蛋白的单抗，利用活细胞感染阻断法阻断LCDV对FG细胞感染的应用。

[0127] （1）将FG接种到96孔板中，每孔100µL，22℃，2% CO2培养，待细胞长成单层，用无菌PBS清洗1-2遍；

[0128] （2）将杂交瘤细胞培养液过滤后接种至单层细胞上，每孔40µL，22℃孵育4h（骨髓瘤细胞培养液为阳性对照）；

[0129] （3）吸出抗体，无菌PBS清洗3遍，每孔加入40µL 2-2病毒，22℃吸附1h；

[0130] （4）加入100µL含2%血清的细胞维持液，22℃，2% CO2培养。每天在倒置显微镜下观察细胞病变（CPE），并进行拍照。

[0131] 结果：在倒置显微镜下连续观察5d，与骨髓瘤细胞培养液孵育后再加入LCDV感染的FG细胞，在感染后2d出现明显细胞病变；与杂交瘤细胞培养液孵育后再感染LCDV的FG细胞，在感染后5d才出现少量的细胞病变；通过本发明单抗G阻断后，细胞出现病变的时间较晚，且病变程度明显降低，从而说明本发明单抗G可以有效阻断LCDV对FG细胞的感染（图5）。

[0132] 实施例7：

[0133] 本发明制备的抗LCDV 27.8kDa受体蛋白的单抗，利用阻断酶联免疫吸附法体外阻断LCDV与FG细胞膜蛋白的结合的应用。

[0134] （1）同实施例1中一（1），制备FG细胞膜蛋白；

[0135] （2）包被抗原：将FG细胞膜蛋白用碳酸盐包被液（pH 9.6）1:10稀释，加入96孔酶标板中（50µl/孔），4℃包被过夜；

[0136] （3）吸出包被液，用PBST洗涤，每次5min，洗3次；

[0137] （4）每孔加入200µl 3%的牛血清白蛋白(PBS配) 37℃封闭1h；

[0138] （5）同（3）法洗涤3次；

[0139] （6）每孔加入100µl杂交瘤培养上清, 37℃温箱孵育1h（骨髓瘤细胞培养液为阳性对照）；

[0140] （7）同（3）法洗涤3次；

[0141] （8）每孔加入50µl提纯的LCDV（15µg/孔），PBS代替LCDV为阴性对照，22℃孵育4h；

[0142] （9）同（3）法洗涤3次；

[0143] （10）每孔加入100µl兔抗LCDV抗体，1:1000稀释，37℃温箱孵育1h；

[0144] （11）同（3）法洗涤3次；

[0145] （12）碱性磷酸酶标记的羊抗兔Ig（1:1000稀释）按每孔100µl加入至酶标板，37℃温箱孵育1h；

[0146] （13）同（3）法洗涤3次；然后每孔加入100µl pNPP应用液，暗处反应5－20min，每孔加入50µl 2M的NaOH，稳定3－5min即可用405nm工作波长测定OD值；

[0147] （14）按照阻断率=（OD阳性对照-OD实验组）/OD阳性对照×100%计算阻断率，当抑制率大于50%时为阳性结果。

[0148] 结果：阳性：0.4247；单抗G：0.1434；阴性：0.0883；阻断率为66.2%。此结果证实本发明单抗G具有阻断病毒结合受体蛋白的能力（图6）。

[0149] 活细胞感染阻断法和阻断酶联免疫吸附法证明本发明的单抗G可以在活细胞内或细胞外阻断LCDV与27.8kDa受体蛋白的结合，进而阻断LCDV对细胞的入侵。因此，本发明的单抗G可以作为弄清LCDV与宿主细胞相互作用关系及其感染机理的重要工具，也为寻找阻断LCDV感染的途径提供了技术手段。单抗G或经过改造的基因工程抗体可成为鱼类LCDV的治疗药物或疫苗，通过口服或注射等方式进入鱼体内，为预防或治疗鱼类淋巴囊肿病毒病起积极作用。

[0150] 本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，都没有超出本发明的保护范围。