一种大豆胞囊线虫抗性基因及其应用

摘要

本发明公开了一种大豆胞囊线虫抗性基因及其应用。本发明提供的cDNA片段(SRC-J-6)，来源于大豆(Glycine max(L.)Merrill.)品种L-10，其核苷酸序列如以下1)-4)任一所示，1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；2)在严格条件下与SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列能够杂交且能够表达的DNA分子；3)与1)中所述核苷酸序列具有90％以上同源性，且能够表达的mRNA分子；4)与1)中所述核苷酸序列具有90％以上同源性，且能够表达的DNA分子。将本发明公开的基因转化植物组织后，能显著提高转基因大豆对胞囊线虫的抗性。本发明公开的大豆胞囊线虫抗性基因具有重要意义，不仅能有效指导常规育种，而且还可以为大豆的转基因育种事业提供优良的基因资源，在大豆生产中具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种大豆胞囊线虫抗性基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、含有权利要求1所述核苷酸序列的重组载体。

3、根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述载体为用于克隆的pMD18-T载体、用于表达的pGFPGUS、pBI121、pCAMBIA载体、用于RNAi的pJawoh18载体中任一一种。

4、含有权利要求1所述核苷酸序列的转基因细胞系或重组菌。

5、扩增权利要求1所述核苷酸序列所用的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示。

6、权利要求1所述核苷酸序列在抗大豆胞囊线虫中的应用。

说明书

一种大豆胞囊线虫抗性基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种大豆胞囊线虫抗性基因及其应用，属于含有编码蛋白的RNA或DNA的化合物库领域。

背景技术

[0002] 在我国，尤其是在我国东北地区，由于滥垦、滥牧、滥砍滥伐等现象的日益加剧，使得耕地沙化、干旱及盐碱地的面积逐年增加。据报道，全国盐碱地面积逾5亿亩，黑龙江省重度盐碱地面积为1600万亩(《盐碱地改造与有机产业发展论坛》，2010)。由于大豆胞囊线虫喜干旱、碱性的土壤环境(湿度60％，pH：8.0)，因此土地沙化、干旱及盐碱地面积的扩大造成了大豆胞囊线虫危害的日益严重。

[0003] 大豆胞囊线虫是危害世界大豆生产的主要病虫害之一，也是危害我国大豆生产的主要病虫害。具有为害面积广泛、为害程度严重，致病性强的特点，土壤一经感染这类病虫害极难根除，目前选育具有良好适应性的抗性品种是防治大豆胞囊线虫最经济有效的措施。而对抗病基因的研究是抗性品种选育的基础。

[0004] 因此克隆大豆胞囊线虫抗性基因具有重要意义。目前，已经确定的大豆胞囊线虫抗性位点约有100多个，但是根据这些位点克隆的基因却鲜有报道。随着大豆基因组测序的完成，采用生物信息学的方法进行基因的挖掘已经成为可能，另外，无论是来自单子叶植物的还是双子叶植物的抗性基因，在结构上都有一些保守性，这为抗病基因的挖掘提供了便利条件。

[0005] 大豆胞囊线虫对大豆的侵染具有特异性，因此，挖掘到的候选基因无法在拟南芥等模式植物中验证其抗性，而大豆又是公认的难以转化的植物，因此，找到一种能够快速进行抗性候选基因功能验证的方法迫在眉睫。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种大豆胞囊线虫抗性基因。

[0007] 所述大豆胞囊线虫抗性核苷酸序列如以下1)-4)任一所示，

[0008] 1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

[0009] 2)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列能够杂交且能够表达的DNA分子；

[0010] 3)与1)中所述核苷酸序列具有90％以上同源性，且能够表达的mRNA分子；

[0011] 4)与1)中所述核苷酸序列具有90％以上同源性，且能够表达的DNA分子。

[0012] 所述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

[0013] 含有以上任一所述核苷酸序列的重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

[0014] 所述重组载体为将上述编码基因插入pGFPGUS获得的重组载体。

[0015] 扩增以上任一所述核苷酸序列的引物对也属于本发明的保护范围。

[0016] 扩增权利要求1所述核苷酸序列所用的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示。

[0017] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种大豆胞囊线虫抗性基因应用的方法。

[0018] 所述基因片段在不含有此基因的植物组织中的表达应用也是本发明保护的范围。

[0019] 所述植物组织为根、茎、叶、花或种子。

[0020] 所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

[0021] 所述单子叶植物为烟草，所述双子叶植物为拟南芥及任何栽培或者野生大豆。

[0022] 所述表达为过表达。

[0023] 所述表达和/或所述过表达是通过含有大豆胞囊线虫胞囊、虫卵、幼虫的试验土样及溶液在温室条件下进行表达。

[0024] 所述幼虫为二龄幼虫，所述土样为将病土和无菌细沙以3∶1的比例均匀混合制备的试验病土，所述溶液为每毫升至少含有400个虫卵的悬浮液，所述温室条件为：光照模式：day/night＝16h/8h；温度模式：day/night＝28℃/25℃。

[0025] 表达分析结果显示，该基因在抗病亲本中特异表达，而在感病亲本中不表达，且在抗病亲本的根部的表达量明显高于叶片中的表达量。

[0026] 将本发明中的基因序列与CaMV 35S启动子连接在一起后采用发根农杆菌侵染大豆子叶节的方法，诱导感大豆胞囊线虫的品种产生毛状根，并在其诱导的过程中将目的基因转入毛状根中。将转基因阳性植株进行接种鉴定。实验证明，在接种15天后，转基因阳性根内的雌虫数明显少于对照植株根内的雌虫数；接种30天后，转基因阳性毛状根表面的胞囊数目也少于对照，且与对照相比，叶片无明显的发病症状。表明该基因在大豆对胞囊线虫的抗性中起一定的作用。

[0027] 在我国，尤其是在我国东北地区，由于滥垦、滥牧、滥砍滥伐等现象的日益加剧，使得耕地沙化、干旱及盐碱地的面积逐年增加。由于大豆胞囊线虫喜干旱、碱性的土壤环境(湿度60％，pH：8.0)，因此土地沙化、干旱及盐碱地面积的扩大造成了大豆胞囊病害的日益严重。因此克隆大豆胞囊线虫抗性基因具有重要意义，不仅能有效指导常规育种，而且还可以为大豆的转基因育种事业提供优良的基因资源。因此，将本发明的基因在常规育种工作中导入到感大豆胞囊线虫的品种中，可获得对大豆胞囊线虫具有抗性的大豆新品种，在大豆生产中具有广阔的应用前景。

附图说明

[0028] 图1Gml6上抗病基因簇内基因扩增产物电泳结果示意图

[0029] 1：SRC-J-1；2：SRC-J-2；3：SRC-J-3；4：SRC-J-4；

[0030] 5：SRC-J-5；6：SRC-J-6；M：Marker DL2000

[0031] 图2SRC-J-6蛋白结构的InterProScan分析示意图

[0032] 图3SRC-J-6半定量RT-PCR结果示意图

[0033] 1：黑农37叶子2：黑农37根部3：L-10叶子4：L-10根部

[0034] 图4SRC-J-6转基因植株的PCR鉴定示意图

[0035] 1-8：植株2、3、5、7、9、10、16、CK；M1：DL2000marker

[0036] 图5为发状根品红染色示意图

[0037] a：植株10；b：植株16；c：阴性对照；d：空白对照

具体实施方式

[0038] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0039] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0040] DNA片段回收采用博大泰克公司回收试剂盒，并按其说明书进行操作。

[0041] 所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂，试剂均为国产分析纯，引物由上海生工公司合成。Ependorf梯度式PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司。

[0042] 植物材料：

[0043] 大豆(Glycine max(L.)Merrill.)抗胞囊线虫品种‘L-10’，记载在王梓贞，大豆胞囊线虫非小种特异性抗性品种的抗性评价与农艺性状相关分析，[J].大豆科学，2009，(04).中，公众可从东北农业大学获得。

[0044] 大豆(Glycine max(L.)Merrill.)感胞囊线虫品种‘黑农37’，记载在王彬如，高产大豆新品种黑农37选育与推广，[J].黑龙江农业科学，1993，(01).中。

[0045] 以感病品种黑农37和本实验室选育的非特异抗性品系L-10为亲本，构建的140个F2:6和F2:7的重组自交系材料，记载在王梓贞，大豆胞囊线虫非小种特异性抗性品种的抗性评价与农艺性状相关分析，[J].大豆科学，2009，(04).中，公众可从东北农业大学获得。

[0046] 大豆(Glycine max(L.)Merrill.)具有高转化效率的品种‘东农50’，记载在段莹莹，农杆菌介导的大豆子叶节和下胚轴转化方法的比较及优化，[J].大豆科学，2010，(04).中，公众可从东北农业大学获得。

[0047] 发根农杆菌K599菌株(保存编号：ACCC10060)，由澳大利亚的Allen Kerr分离，并由中国农业科学院作物科学研究所提供，记载在Cho H J，High efficiencyinduction of soybean hairy roots and progagation of the soybean cyst nematode.Planta，2000，210：195-204.中。

[0048] 大豆胞囊线虫3号生理小种采集自伊春大豆连作地块。并由教育部大豆生物学重点实验室分离鉴定。记载在王梓贞，大豆胞囊线虫非小种特异性抗性品种的抗性评价与农艺性状相关分析，[J].大豆科学，2009，(04).中，公众可从东北农业大学获得NCPPB2659。

[0049] 大豆胞囊线虫14号生理小种采集自黑龙江省农科院大庆分院实验病圃，并由教育部大豆生物学重点实验室分离鉴定。记载在王梓贞，大豆胞囊线虫非小种特异性抗性品种的抗性评价与农艺性状相关分析，[J].大豆科学，2009，(04).中，公众可从东北农业大学获得。

[0050] pMD-18T vector，购自TAKARA公司。

[0051] 载 体pGFPGUS，记 载 在 Cho H J，High efficiency induction of soybean hairyroots and progagation ofthe soybean cyst nematode.Planta，2000，210：195-204.中。

[0052] 限制性内切酶和T4DNA连接酶等均购自TAKARA公司。

[0053] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0054] 实施例1大豆抗胞囊线虫基因核苷酸序列

[0055] 大豆胞囊线虫抗性核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或为下1)-3)任一所示，[0056] 1)在严格条件下与SEQ ID NO.1限定的核苷酸序列能够杂交且能够表达的DNA分子；

[0057] 2)与SEQ ID NO.1所述核苷酸序列具有90％以上同源性，且能够表达的mRNA分子；

[0058] 3)与SEQ ID NO.1所述核苷酸序列具有90％以上同源性，且能够表达的DNA分子。

[0059] 所述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

[0060] 扩增以上任一所述DNA片段的引物对也属于本发明的保护范围，例如：SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4。

[0061] SEQ ID NO.2属于与SEQ ID NO.1所述核苷酸序列具有90％以上同源性，且能够表达的DNA分子。

[0062] 实施例2大豆抗胞囊线虫基因的获得

[0063] 1.基因的克隆

[0064] 1)植物总RNA的提取及反转录：分别取接种线虫后12h的L-10、黑农37的根部及叶部组织，提取RNA，总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测，18S和28S RNA带型清晰可辨，紫外分光光度记检测OD260/OD280比值在1.9～2.0之间，说明RNA完整性好、纯度高。反转录反应TM参照promega ImProm-II (Promega)反转录试剂盒进行操作。

[0065] 2)抗病候选基因全长序列的克隆：分别以上述反转录的L-10、黑农37的根部及叶的cDNA为模板，用设计好的基因特异引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)并采用降落式PCR的方法克隆目的基因。反应的体系及程序如表1所示。待PCR反应结束后，每个样品各取8μL进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示，扩增长度与预期的产物长度一致。

[0066] 表1抗病候选基因PCR反应体系及程序

[0067]

[0068] 3)PCR产物的连接，转化和阳性克隆的鉴定及测序：按照上海华舜公司小剂量胶回收试剂盒说明进行PCR产物的纯化，而后，将回收片段连接到pMD18-TEasyVector，以每个单克隆的菌液为模板，采用与克隆所用相同的引物进行菌液PCR。反应条件与克隆基因相同。每个反应取出8ul进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物将PCR阳性克隆菌液，送往上海生工测序。

[0069] 2.大豆抗胞囊线虫候选基因序列的生物信息学分析

[0070] 利 用 http://www.expasy.ch/tools/protparam.html 分 析，表 明 基 因 簇内SRC-J-1为具有1048个氨基酸的多肽，理论等电点(pI)为6.02，估计分子量为117003.1Da；SRC-J-2为具有775个氨基酸的多肽，理论等电点(pI)为6.23，估计分子量为
83400.1Da。SRC-J-4为具有932个氨基酸的多肽，理论等电点(pI)为5.57，估计分子量为
103426.2Da。SRC-J-6为具有520个氨基酸的多肽，理论等电点(pI)为8.99，估计分子量为57363.0Da。

[0071] InterProScan分析表明，这4个基因都包含有LRR结构及SERINE/THREONINE激酶结构域(图2)。其中LRR结构与细胞外的信号识别有关，激酶结构与对下游的抗病响应成员具有激活的作用。

[0072] 3.半定量RT-PCR分析候选基因的表达

[0073] 以大豆β-Actin为内参，采用半定量RT-PCR的方法检测大豆β-Actin基因在抗线虫品种L-10与感线虫品种黑农37的根与叶组织中的表达情况，结果表明，SRC-J-6只在抗线虫品种L-10中表达，而在感线虫品种黑农37中不表达，且在L-10根中的表达量高于叶片中的表达量(图3)。其他几个基因在两亲本间的表达差异不明显或无差别。这说明此基因在不同材料中的表达存在差异且具有组织表达特异性，这也暗示了SRC-J-6可能在大豆胞囊线虫的抗性中发挥一定的作用。

[0074] 实施例3大豆抗胞囊线虫基因功能验证

[0075] 1、植物表达载体的构建

[0076] 克隆SRC-J-6基因序列到载体pGFPGUS，构建过量表达载体pGFPGUS-SRC-J-6，具体引物序列如表2所示：

[0077] 表2.SRC-J-6扩增引物序列

[0078]

[0079] 目的基因扩增、PCR产物的纯化，连接，转化和阳性克隆的鉴定及测序同上。带有目的基因的pMD18-T-SRC-J-6重组质粒和与之相连的pGFPGUS空载体分别用Xba I和Sac I双酶切，电泳鉴定，并用胶回收试剂盒回收1.6kb左右SRC-J-6片断和载体13kb左右的大片段。得到的小片段与pGFPGUS载体大片段连接，得到连接产物。将该连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行卡那霉素抗性筛选，将得到的转化子在摇床37℃培养过夜，提取质粒按照，再通过Xba I和Sac I双酶切，验证质粒是否构建成功，挑取阳性质粒。

[0080] 2、发根农杆菌转化及阳性克隆鉴定

[0081] 通过冻融法转化发根农杆菌K599，具体方法如下：

[0082] ①取2μL(少于50ng)纯化的质粒DNA，加入到含有100μL根癌农杆菌感受态细胞的离心管中，轻轻混匀；

[0083] ②冰浴30min，于液氮中速冻2min，迅速置37℃水浴热激5min，再迅速冰浴2min；

[0084] ③加入500μL YEP无抗生素的液体培养基于28℃，100rpm轻轻振荡培养3～5h复苏；

[0085] ④用移液器将菌液移至YEP固体培养基(50mg/L Kan)表面，均匀涂布于整个平板；

[0086] ⑤28℃倒置培养1～2d，直至长出合适大小的菌落，取单菌落用碱法提取质粒，进行PCR检测及酶切鉴定，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明能切出目的片段，可以用其进行下一步转化实验。

[0087] 3、发根农杆菌介导法转化大豆子叶节

[0088] 发根农杆菌介导的大豆子叶节转化程序：

[0089] 1)大豆种子萌发：将大豆品种东农50用氯气消毒16小时，播种于蛭石中，于光照培养箱中培养，光照模式为day/night＝16h/8h，温度模式为day/night＝28℃/25℃；湿度为75％。

[0090] 2)发根农杆菌的培养：从YEP平板(KanR)上挑取含有pGFPGUS重组质粒的农杆菌单菌落，接种于5mL YEP(50mg/L Kan)液体培养基中，28℃220rpm振荡培养过夜；取2mL培养物，加入到50mLYEP(50mg/LKan)液体培养基中，28℃培养至OD600为1～1.2；将50mL培养物于5000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，用等体积50mL无菌去离子水重悬菌体。

[0091] 3)发根农杆菌的侵染：取1天苗用于侵染。将种子刚刚萌发长出只是表面，且子叶仍然显露出黄色(大约播种3天后)定义为0天；用1ml的注射器吸取用无菌去离子水重悬的菌体，在子叶节处注射。用针头小心刺穿，不要将子叶碰掉，用注射器推出几滴菌液，并用沾有菌液的针头在伤口处来回几次，使菌液在伤口处分布均匀；用无菌滤纸吸干多余的菌液，将侵染后的植株置于培养箱中培养，培养条件同萌发条件。

[0092] 4)不定根的诱导及移栽：侵染后约7天左右，将子叶节处根状物突起的植株从蛭石中取出，在蒸馏水中沿突起下部约1cm处剪断，将地上部分插入装有无菌水的三角瓶中，诱导生根；待根长出后，每条根剪取约1em，放于装有GUS染色剂的1.5ml EP管中，37℃避光孵育，每条根三次重复。GUS染色剂成分如下：

[0093] 100mmol/L KH2PO4，PH7.0；0.5mmol/L K4[Fe(CN)6]；0.5mmol/L K3[Fe(CN)6]；0.1％Triton X-100；0.5mg/ml X-Gluc[X-glucuronide，Molecular probe]。

[0094] 检测结果表明：8株转SRC-J-6基因植株呈GUS阳性；提取GUS反应阳性的发状根的DNA，采用PCR的方法检测转基因阳性根，反应条件及所用引物与半定量RT-PCR中相同。检测结果显示：2株转SRC-J-6基因植株呈PCR阳性(编号为10、16)(图4)。

[0095] 4、转基因植株的接种鉴定

[0096] 将检测带有转基因阳性根的植株及阴性对照、空白对照分别移栽入含有大豆胞囊线虫3号生理小种的基质中，15天后取根洗净，经漂白、染色后在20×光学显微镜下计数，每株取10个根进行重复(图5)，具体方法如下：

[0097] 1)土壤胞囊密度的测定：将称好的100g胞囊土样放在20目的滤筛上，用稍急的水流冲刷土样，胞囊会顺水流流到60目的滤筛上，当20目的滤筛上无土样，即可停止。

[0098] 2)将60目滤筛上收集的胞囊及杂质冲入烧杯中，静止20min，倾到烧杯中的上清液或悬浊液在滤纸上，经滤纸过滤后，记数皿数出胞囊数目，做记录，重复三次，取平均值。Riggs等提出的每100g土样胞囊密度40个以上胞囊数是比较合适的实验土样。

[0099] 3)准备实验土壤：土壤湿度是影响大豆胞囊线虫发育的重要因素，过高的土壤湿度会使得土壤中氧气供给不足，抑制大豆胞囊线虫的孵化，导致大豆胞囊线虫的死亡。将实验土样与蛭石按照3∶1的比例进行混合，这样不仅能使土壤变得松软，有利于根的生长，而且蛭石的保水性较好，一般可坚持15天不用浇水，在保障大豆胞囊线虫正常孵化的同时也保证了大豆植株的正常生长

[0100] 4)鉴定植株的种植：将所有植株种植在一个塑料盒子里，不仅能保证条件均匀一致，很能大大减少人工及对植株的损伤。按照前后、左右间距5em种植，每种株系种5粒，每个盒子中都要种植对照品种Lee68，已减少不同试验条件所引起的误差。待出苗后挂牌，留下生长状态一致的三株苗。数据的获得：大约播种15d后将植株整株取出，注意根的保护[0101] 5)将根部的残土冲洗干净，浸泡于浓度为3％的安替福民(NaOCl)水溶液中4min，期间搅拌2次。

[0102] 6)流水冲洗根部30-45s，并在蒸馏水中浸泡15min将根浸泡于酸性品红染色液中，加热煮沸30s，冷却至室温。

[0103] 7)将根组织压片，在20×的光学显微镜下计数，并量取用于计数的根组织的长度，计算单位长度的根组织内的雌虫数目。

[0104] 染色液的配置方法：

[0105] ①母液，0.35g品红+25ml醋酸+75ml去离子水；

[0106] ②工作液，20ml母液+580ml去离子水。

[0107] 结果表明，10号植株根内的平均雌虫数为4.3个/cm，16号植株根内的平均雌虫数为5个/cm。转pGFPGUS阴性对照根内的平均雌虫数为7.2个/cm。非转基因东农50空白对照植株根内的平均雌虫数为6.5个/cm。对所得的数据进行Duncan’s多重极差检验，根据数据可知，共有3种范围：2、3、4；自由度为36。查表获得在0.01、0.05显著水平下范围为2、3、4；自由度为36时的SSR值并据此计算相应的最小显著极差值LSR(表3)。

[0108] 表3Duncan’s多重极差检验的5％和1％SSR值表

[0109]

[0110] 将四组数据的平均数的两两之差与表中的LSR值进行比较，可对相应的总体平均数的差异做出判断(表4)。

[0111] 表4.Duncan’s多重极差检验的结果

[0112]* **

[0113] 注：和 分别表示显著性水平为P＝0.05和0.01；ns表示差异不显著，1：阴性对照；2：空白对照；3：16号；4：10号.

[0114] 通过上表结果，我们得知：10号植株根内的平均雌虫数与阴性对照根内的平均雌虫数及空白对照植株根内的平均雌虫数存在极显著差异，与16号植株根内的平均雌虫数差异不显著；16号植株根内的平均雌虫数与阴性对照根内的平均雌虫数存在极显著差异，与空白对照植株根内的平均雌虫数存在显著差异。从而证实了SRC-J-6基因对大豆胞囊线虫的抗性确实有明显的贡献。