三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及用途转让专利
申请号 : CN201110085320.8
文献号 : CN102206713B
文献日 : 2013-01-02
发明人 : 陈瑜 , 李兰娟 , 崔大伟
申请人 : 浙江大学
摘要 :
本发提供一种三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包含定量RT-PCR反应液、标准品、对照品，盒体设有容器孔，分别放置定量RT-PCR反应液管、札如病毒标准品管、星状病毒标准品管、腺病毒标准品管、阳性对照品管、阴性对照品管，其中定量RT-PCR反应液单管分装，矩阵排列，标准品为札如病毒、星状病毒和腺病毒基因标准品，对照品为阳性和阴性对照品。本发明试剂盒运用实时荧光定量RT-PCR技术，采用三种病毒特异引物和特异荧光探针，设计合理，通过一个PCR反应，可以从标本中检测出札如病毒、星状病毒和腺病毒，检测方法更简便、快速和准确。
权利要求 :
1.一种三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：定量RT-PCR反应液、札如病毒标准品、星状病毒标准品、腺病毒标准品、阳性对照品、阴性对照品，盒体（7）设有容器孔，分别放置荧光定量RT-PCR反应液管（1）、札如病毒标准品管（2）、星状病毒标准品管（3）、腺病毒标准品（4）、阳性对照品管（5）、阴性对照品管（6），其中荧光定量RT-PCR反应液管（1）包含RT-PCR反应缓冲液管、上下游引物同管装的三种病毒通用引物管、相应的三种荧光探针管和含RNA酶抑制剂、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶和耐热DNA聚合酶的酶混合物管，RT-PCR反应缓冲液管内含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，三重荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性荧光探针序列如下：上游引物札如病毒-FP:5’-CAACTATGACCAGGCTCTCGC-3’下游引物札如病毒-RP:5’-GCCCTCCATYTCRAACACTA-3’特异性探针札如病毒-P:5’-FAM-CTTGGTTYATAGGYGGTACA-BHQ1-3’上游引物星状病毒-FP:5’-AATACGGACGCAACAAACGTC-3’下游引物星状病毒-RP:5’-GTCCTGTGACACCCTGTTTCC-3’特异性探针星状病毒-P:5’-VIC-AGTCTAATCAACGTGTCCGTAACATTGTC-BHQ1-3’上游引物腺病毒-FP:5’-CCCTGCTTTATCTTCTTTTCGAAG-3’下游引物腺病毒-RP:5’-GAGAACGGTGTGCGCAGG-3’特异性探针腺病毒-P:5’-ROX-CACCAGCCACACCGCGGC-BHQ1-3’所述的札如病毒、星状病毒和腺病毒基因标准品序列如下：札如病毒标准品序列为：
CAACTATGAC CAGGCTCTCG CCACCTACGA ATCTTGGTTC ATAGGTGGTACAGGCCTGGT ACAAGGTAGC CCCAGTGAAG AGACCACCAA ATTAGTGTTTGAAATGGAG GGC
星状病毒标准品序列为：
AATACGGACG CAACAAACGT CAGTCTAATC AACGTGTCCG TAACATTGTCAATAAGCAAC TCAGGAAACA GGGTGTCACA GGAC腺病毒标准品序列为：
CCCTGCTTTA TCTTCTTTTC GAAGTCTTCG ACGTGGTCAG AGTGCACCAGCCACACCGCG GCGTCATCGA GGCCGTCTAC CTGCGCACAC CGTTCTC。
2.根据权利要求1所述的一种三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为高温高压灭菌的高压后焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为札如病毒、星状病毒和腺病毒的阳性质粒。
3.根据权利要求1所述的一种三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒保存于-20℃。
说明书 :
三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及用途
技术领域
[0001] 本发明属生物技术领域，涉及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及一种三重（三种探针）实时荧光定量RT-PCR在一个反应管内同时检测胃肠炎腹泻患者的粪便样本中札如病毒、星状病毒和腺病毒核酸及检测方法，可应用于札如病毒、星状病毒和腺病毒引起暴发疫情的实验室应急检测。
背景技术
[0002] 腹泻病是世界范围内影响人类健康的常见病和多发病，特别是引起婴幼儿发病和死亡的主要原因之一。研究表明每年超过200万婴幼儿死于腹泻有关疾病及其并发症，其中超过80%的患者来于欠发达国家。虽然至少25 种不同的细菌和病原微生物能引起胃肠炎，但是超过 75% 的病例是由病毒所引的。随着分子生物检测技术的提高，由病毒感染引起的腹泻病越来越受到人们的关注。特别是秋冬季节婴幼儿腹泻80%以上由病毒引起。
[0003] 病毒性胃肠炎（又称病毒性腹泻），是一组由多种病毒引起的急性肠道传染病，临床特点是起病急、恶心、呕吐、腹痛、腹泻，排水样便或稀便，也可有发病或全身不适等症状，病程短，死亡率低。病毒性胃肠炎是引起全世界特别是发展中国家儿童发病和死亡的主要原因之一。轮状病毒（Rotavirus）、诺如病毒（Norovirus）、札如病毒（Human Calicivirus）、腺病毒（Adenovirus）40型和41型以及星状病毒（Astrovirus）被认为是急性胃肠炎的常见病原。
[0004] 轮状病毒是引起婴幼儿重症腹泻的主要病原。几乎每个儿童在5岁以前都感染过轮状病毒，初次感染通常引起急性腹泻，症状较重，全世界每年大约有1亿多的5岁以下儿童患轮状病毒腹泻，其中2500万儿童需要门诊治疗，200万儿童需要住院治疗，而且每年约有35万～59万儿童死于轮状病毒腹泻，82%的死亡儿童发生在发展中国家，目前轮状病毒的方法学研究比较成熟，如RT-PCR、ELISA和胶乳凝集分析等方法。
[0005] 人类星状病毒(Astrovirus，AstV)于1975年首次由Appleton等在急性胃肠炎患儿的粪便中用电镜观察到，此后，相继在猫、鸭、羊、猪等动物的粪便中也发现了该类病毒。尽管发现AstV较早，但对其致病作用及其地位未引起重视，尤其是与腹泻的关系在很长一段时间里认为其只会引起散发的、较轻微的腹泻。随着分子生物学技术的发展，对AstV的各项研究逐步深入，认识至UAstV的感染率、发病率均高出预期结果，尤其在婴幼儿人群中。一些国家的同类调查均发现AstV感染相当普遍，其致病性越来越不容忽视。现已证实，AstV是引起婴幼儿、老年人及免疫功能低下者腹泻的重要原因之一，AstV急性胃肠炎既可散发感染也可引起暴发流行，同时也是医源性感染的重要病原。星状病毒占儿童住院腹泻病例的2.5%-9%。
[0006] 20世纪50年代初，Rowe等在切除的儿童腺体细胞培养物的自发性退行性病变中，首次发现腺病毒(Adenovirus，AdV)，1975年Flewett等首次应用电镜技术，从急性胃肠炎患儿粪便中发现与婴幼儿胃肠炎直接相关的腺病毒。这些在电镜下观察到的大多数腺病毒，均不能在常规应用的腺病毒细胞培养系统中培养，这些腺病毒称之为肠道腺病毒(Enteric Adenovirus，EAdv)。肠道腺病毒是一种新的导致婴幼儿腹泻的主要病原,主要感染5岁以下的婴幼儿，特别是3岁以下的。腺病毒感染呈全球性分布，世界各地均有报道,暴发流行的报道亦多见。肠道腺病毒可通过人与人接触传播，也可通过粪-口途径和呼吸道传播。肠道腺病40/41型引起超过7.9%的儿童腹泻病例。国内没有暴发流行的报道，近年来北京、天津、郑州等地有少量散发报道。随着对AstV研究的不断深入，其流行病学意义日益受到重视。国外有关AstV感染的报道已经有很多，目前我国相关报道还比较少。要全面认识我国AstV感染的临床及流行病学特点，还有待进行深入研究。1995年程绪杰等首次在我国从腹泻患儿粪便中分离到肠道腺病毒。EAdv感染呈全球性分布，世界各地均有报道，暴发流行的报道亦多见。国内曹卫中等报道崇明县一起EAdv弓l起的感染性腹泻暴发。
[0007] 人类杯状病毒包括诺如病毒（Norovirus）和札如病毒（Sapovirus），是引起非菌性急性胃肠炎暴发的主要病因，也是仅次于轮状病毒引起婴幼儿急性腹泻的常见病原之一。诺如病毒可在所有年龄段、不同场所(幼儿园、学校、餐馆、夏令营、医院、护婴室、养老院、航海舰队和部队单位等)引起暴发。由于该病毒传染性很强，常可导致突发性公共卫生事件，美国已将其列为乙类生物恐怖因子。美国、日本、法国等国都爆发流行过诺如病毒，该病毒引起了世界各国的高度重视，我国卫生部2007年特别制定了关于诺如病毒感染性腹泻的防治方案。1995年方肇寅等首次在我国婴幼儿腹泻粪便标本中检测到杯状病毒，自此以后我国北京、广州等地区陆续报导检出杯状病毒。近年来的研究显示我国儿童中不仅有诺如感染，也有札如感染。札如病毒的检出率虽然低于诺如病毒，但已有的研究显示它已呈全球性分布，常引起暴发流行。国外对于札如病毒的研究较早，1977年在日本札幌通过电镜进行检测被发现以来，美国、英国、加拿大、日本、肯尼亚、南非和我国等世界大部分国家和地区陆续进行了流行病学研究，证明了札如病毒在世界范围内普遍存在，并提示它已成为腹泻散发病例和引起暴发疫情的重要病原。
[0008] 病毒性腹泻在世界范围内的影响不容忽视，婴幼儿病毒性腹泻给世界各国带来沉重的经济和社会负担。由于婴幼儿年龄太小，无法很好的与医生和父母进行交流，因此对腹泻的婴幼儿患者进行快速的诊断显得尤为重要。
[0009] 鉴于包括人轮状病毒、札如病毒、腺病毒、星状病毒和诺如病毒在公共卫生中的重要性与日俱增，所以在腹泻监测工作中同时要进行多种腹泻病毒的检测，费时费力而且浪费临床标本与试剂。病毒培养相对PCR方法比较费时费力且花费较大，且札如病毒和诺如病毒目前世界上还没有建立成熟的的培养方法。在目前由于轮状病毒和诺如病毒的检测方法研究的相对比较多而且比较成熟，而札如病毒、腺病毒、星状病毒的方法研究比较少，特别是多重荧光定量PCR的方法。
[0010] 随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，特别是最近几年兴起的荧光定量PCR技术，该方法具有准确性高、重现性好等特点，已广泛用于基因表达研究、病原体检测、SNP分析及基因分型等诸多领域。该方法采用完全闭管检测，省去了对PCR产物后处理，避免了交叉污染，结果判断由计算机完成，简化了操作步骤，并加强了结果的可靠性。随着荧光定量技术、仪器以及材料科学的发展，荧光定量技术不仅仅在定量上发挥它的优势，而且运用TaqMan或TaqMan－MGB探针的5`末端标记上不同的荧光染料（FAM、HEX等）技术可以进行基因分型、基因突变检测和SNP分析等方面研究。因此建立关于札如病毒、腺病毒、星状病毒的多重荧光定量RT-PCR的分子生物学快速、特异、准确、灵敏的基因诊断方法与诊断试剂盒尤为重要。
发明内容
[0011] 本发明目的是提供一种三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包含定量RT-PCR反应液、札如病毒标准品、星状病毒标准品、腺病毒标准品、对照品，盒体7设有容器孔，分别放置定量RT-PCR反应液管、札如病毒标准品管、星状病毒标准品管、腺病毒标准品管、阳性对照品管、阴性对照品管。
[0012] 其中荧光定量RT-PCR反应液管包含RT-PCR反应缓冲液管（含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等）、三种病毒通用引物管（上下游引物同管装）、相应的三种荧光探针管和酶混合物管（含RNA酶抑制剂、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶和耐热DNA聚合酶等）。
[0013] 三重荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性荧光探针序列如下：
[0014] 上游引物札如病毒-FP: 5’- CAACTATGACCAGGCTCTCGC-3’
[0015] 下游引物札如病毒-RP: 5’- GCCCTCCATYTCRAACACTA-3’
[0016] 特异性探针札如病毒-P: 5’- FAM - CTTGGTTYATAGGYGGTACA -BHQ1-3’[0017] 上游引物星状病毒-FP: 5’-AATACGGACGCAACAAACGTC-3’
[0018] 下游引物星状病毒-RP: 5’-GTCCTGTGACACCCTGTTTCC-3’
[0019] 特异性探针星状病毒-P : 5’ -VIC -AGTCTAATCAACGTGTCCGTAACATTGTC-BHQ1-3’[0020] 上游引物腺病毒-FP: 5’-CCCTGCTTTATCTTCTTTTCGAAG-3’
[0021] 下游引物腺病毒-RP: 5’-GAGAACGGTGTGCGCAGG-3’
[0022] 特异性探针腺病毒-P : 5’ -ROX -CACCAGCCACACCGCGGC-BHQ1-3’[0023] 上述标准品包括札如病毒、星状病毒和腺病毒基因标准品，其序列如下：
[0024] 札如病毒标准品序列为：
[0025] CAACTATGAC CAGGCTCTCG CCACCTACGA ATCTTGGTTC ATAGGTGGTA CAGGCCTGGT ACAAGGTAGC CCCAGTGAAG AGACCACCAA ATTAGTGTTT GAAATGGAG GGC
[0026] 星状病毒标准品序列为：
[0027] aatacggacg caacaaacgt cagtctaatc aacgtgtccg taacattgtc aataagcaac tcaggaaaca gggtgtcaca ggac
[0028] 腺病毒标准品序列为：
[0029] CCCTGCTTTA TCTTCTTTTC GAAGTCTTCG ACGTGGTCAG AGTGCACCAG CCACACCGCG GCGTCATCGA GGCCGTCTAC CTGCGCACAC CGTTCTC
[0030] 阴性对照为高温高压灭菌的高压后DEPC（焦碳酸二乙酯）处理水，阳性对照为札如病毒、星状病毒和腺病毒的阳性质粒样品。
[0031] 本发明提供的定量试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
[0032] 本发明的另一个目的是提供所述的三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒在检测札如病毒、星状病毒和肠道腺病毒中的应用。
[0033] 本发明试剂盒的使用方法：
[0034] 每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为1×102－7
1×10 拷贝/ml。
1×10 拷贝/ml。
[0035] 粪便样品核酸RNA/DNA提取: 该取0.2克或200ul粪便样本加到EP管中，加入1.5ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次10秒，然后静置10分钟，以8000转/分钟离心5分钟，吸取200ul-400ul上清加到EP管中，采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或Geneaid 公司的Viral Nucleic Acid Extraction Kit II试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取，取5ul已抽提的待测样品核酸RNA/DNA为模板。
[0036] 核酸的检测：取5ul已抽提的待测样品核酸RNA/DNA为模板，RT-PCR 缓冲液为一步法RT-PCR（one stepRT-PCR） 缓冲液，其终浓度为1×，是指缓冲液各组分在反应体系中的终浓度与1×one step RT-PCR缓冲液中各组分的浓度相同。通常采用反应体系1/2体积的2×one stepRT-PCR缓冲液。1×one step RT-PCR Master Mix缓冲液的组成参见上海辉睿生物科技有限公司的一步法RT-PCR标准混合液（one step RT-PCR Master Mix），编号（Code）：HR-RT04-100。
[0037] 反应总体积为50 ，其中2×One Step RT-PCR Reaction Buffer 25 ul，Enzyme Mix 5 ul，三种引物(20μmol/L)各1 ，三种探针(20μmol/L) 各1 , 模板RNA/DNA 2~5 ，DEPC水补足50 。）在三色（或以上）荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为：反应条件为50℃ 30min，95℃ 5min进行逆转录，然后95℃ 10s，55℃ 40s，在55℃进行三重荧光检测，共进行45个循环。
[0038] 荧光定量结果报告：①札如病毒、星状病毒和肠道腺病毒探针各自CT值（threshold cycle,每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数）均等于40.0的标本为阴性，②札如病毒、星状病毒和肠道腺病毒各探针CT值≤35的标本，检测结果为该相应病毒的核酸为阳性，则待测样品含有札如病毒、星状病毒和腺病毒，如其中一个出现荧光检测结果呈阳性，则待检样本中含有阳性荧光对应的靶病毒。③CT值在35～40之间为灰值区域，重做后大于37值为阴性。根据所获得的标准曲线,计算待测标本各革兰阴、阳性菌量值(拷贝数/ml)。
[0039] 本发明的有益之处是：运用实时荧光定量RT-PCR技术，采用三种病毒（札如病毒、星状病毒和腺病毒）特异引物和特异荧光探针，开发研制用于札如病毒、星状病毒和腺病毒三重荧光定量检测试剂盒。该发明是通过一个PCR反应，可以从标本中检测出札如病毒、星状病毒和腺病毒的存在，比传统的普通PCR和单重荧光定量PCR方法更简便、快速和准确，而且对检测的病毒进行实时准确定量，对临床上疑似病毒性感染的患儿提供早期明确诊断，区分阳性病毒感染及感染的滴度数量水平，以便早期及时制定治疗方案，减少死亡率及后遗症。
附图说明
[0040] 图1是试剂盒结构示意图。
[0041] 图2是三个标本混合同时进行三重RT-PCR检测的实例。
[0042] 图3为荧光RT-PCR法检测札如病毒的灵敏度，6至1（从左到右）依次为：10000000、1000000、100000、10000、1000、100copy。
[0043] 图4 为札如病毒标准品荧光定量RT-PCR标准曲线。
[0044] 图5为荧光RT-PCR法检测星状病毒的灵敏度；5至1（从左到右）依次为：1000000、100000、10000、1000、100copy。
[0045] 图6 为星状病毒标准品荧光定量RT-PCR标准曲线。
[0046] 图7为荧光RT-PCR法检测腺病毒的灵敏度；5至1（从左到右）依次为：1000000、100000、10000、1000、100copy。
[0047] 图8 为腺病毒标准品荧光定量RT-PCR标准曲线。
具体实施方式
[0048] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0049] 实施例1
[0050] 参见图1，一种三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包含：定量RT-PCR反应液、札如病毒标准品、星状病毒标准品、腺病毒标准品、阳性对照品、阴性对照品，盒体7设有容器孔，分别放置定量RT-PCR反应液管1、札如病毒标准品管2、星状病毒标准品管3、腺病毒标准品4、阳性对照品管5、阴性对照品管6，其中定量RT-PCR反应液单管分装，矩阵排列，标准品为札如病毒、星状病毒和腺病毒基因标准品，其中荧光定量RT-PCR反应液包含RT-PCR反应缓冲液（含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等）3管（标记为 ）、三种病毒通用引物（上下游引物同管装）为3管（标记为 ）、相应的三种荧光探针为3管（标记为 ）、酶混合物（含RNA酶抑制剂、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶和耐热DNA聚合酶等）为3管（标记为 ）。
[0051] 实施例2
[0052] 1 材料与方法
[0053] 病毒株与临床标本：
[0054] 肠道腺病毒40/41、星状病毒和札如病毒的阳性核酸（均通过基因测序鉴定）来源于浙江大学医学院附属第一医院。临床样本来源于患者的粪便标本，样本采集后带冰运送到实验室。
[0055] 1.2 引物与探针
[0056] 从美国的NCBI基因库上下载了世界各地的札如病毒、星状病毒、腺病毒基因序列。对其进行了同源性比较，在对应病毒基因组的保守基因区设计特异性引物与Taqman探针，序列如下：
[0057] 上游引物札如病毒-FP: 5’- CAACTATGACCAGGCTCTCGC-3’
[0058] 下游引物札如病毒-RP: 5’- GCCCTCCATYTCRAACACTA-3’
[0059] 特异性探针札如病毒-P: 5’- FAM - CTTGGTTYATAGGYGGTACA -BHQ1-3’[0060] 上游引物星状病毒-FP: 5’-AATACGGACGCAACAAACGTC-3’
[0061] 下游引物星状病毒-RP: 5’-GTCCTGTGACACCCTGTTTCC-3’
[0062] 特异性探针星状病毒-P : 5’ -VIC -AGTCTAATCAACGTGTCCGTAACATTGTC-BHQ1-3’[0063] 上游引物腺病毒-FP: 5’-CCCTGCTTTATCTTCTTTTCGAAG-3’
[0064] 下游引物腺病毒-RP: 5’-GAGAACGGTGTGCGCAGG-3’
[0065] 特异性探针腺病毒-P : 5’ -ROX -CACCAGCCACACCGCGGC-BHQ1-3’[0066] 引物和探针委托上海辉睿生物科技有限公司合成。
[0067] 1.3 病毒定量标准与病毒RNA的提取：
[0068] 病毒RNA的提取采用德国QIAGEN公司的Reansy Mini Kit，按试剂盒说明书提取，得到病毒RNA（102ng/μL），并根据TranscriptAidTM T7 High Yield Transcription Kit 的操作说明书将RNA进行逆转录，利用NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer 在260nm测量逆转录产物的浓度，从而确定RNA的拷贝数以备用。
[0069] 1.4 荧光RT-PCR反应体系和条件的优化：
[0070] 试剂盒：选用上海辉睿生物科技有限公司的one step RT-PCR Master Mix，Code：HR-RT04-100，按说明书操作，反应总体积为50 ，其中2×One Step RT-PCR Reaction Buffer 25 ul，Enzyme Mix 5 ul，三种引物(20μmol/L)各1 ，三种探针(20μmol/L) 各
1 , 模板RNA/DNA 2~5 ，DEPC水补足50 。）反应条件为50℃ 30min，95℃ 5min进行逆转录，然后95℃ 10s，55℃ 40s，在55℃进行三重荧光检测，共进行45个循环，结果判断：选择荧光检测模式FAM、VIC、ROX，荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从0.10～1.00μM，探针浓度从0.10～0.50μM，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值（ΔRn）选择最佳引物和探针浓度。
1 , 模板RNA/DNA 2~5 ，DEPC水补足50 。）反应条件为50℃ 30min，95℃ 5min进行逆转录，然后95℃ 10s，55℃ 40s，在55℃进行三重荧光检测，共进行45个循环，结果判断：选择荧光检测模式FAM、VIC、ROX，荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从0.10～1.00μM，探针浓度从0.10～0.50μM，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值（ΔRn）选择最佳引物和探针浓度。
[0071] 1.5 荧光RT-PCR特异性、敏感性和重复性试验
[0072] 选择肠道腺病毒、星状病毒和札如病毒的阳性核酸（均通过基因测序鉴定）和近期来源于源于近期浙江省腹泻患者的临床粪便标本，对上述临床样本提取核酸，用肠道腺病毒、星状病毒和札如病毒多重荧光RT-PCR方法进行检测，验证方法的特异性；对已标定拷8 8
贝数（Copies/ml）的肠道腺病毒（2×10Copies/ml）、星状病毒（2×10Copies/ml）和札如
8
病毒（2×10Copies/ml）分别稀释后，平行进行荧光RT-PCR与RT-PCR反应，比较其灵敏度。
此外，对每一个浓度的病毒稀释液作5次重复检测，得到的Ct值计算标准差，验证方法的重复性。
贝数（Copies/ml）的肠道腺病毒（2×10Copies/ml）、星状病毒（2×10Copies/ml）和札如
8
病毒（2×10Copies/ml）分别稀释后，平行进行荧光RT-PCR与RT-PCR反应，比较其灵敏度。
此外，对每一个浓度的病毒稀释液作5次重复检测，得到的Ct值计算标准差，验证方法的重复性。
[0073] 2 结果
[0074] 2.1 荧光RT-PCR反应体系及条件
[0075] 选用上海辉睿生物科技有限公司的one step RT-PCR Master Mix，Code：HR-RT04-100，按说明书操作，反应总体积为50 ，其中2×One Step RT-PCR Reaction Buffer 25 ul，Enzyme Mix 5 ul，三种引物(20μmol/L)各1 ，三种探针(20μmol/L) 各
1 , 模板RNA/DNA 2~5 ，DEPC水补足50 。）。用Rotor-Gene6000荧光检测系统进行检测，反应参数为：反应条件为50℃ 30min，95℃ 5min进行逆转录，然后95℃ 10s，55℃
40s，在55℃进行三重荧光检测，共进行45个循环，可获得最低Ct值和最高荧光强度。
1 , 模板RNA/DNA 2~5 ，DEPC水补足50 。）。用Rotor-Gene6000荧光检测系统进行检测，反应参数为：反应条件为50℃ 30min，95℃ 5min进行逆转录，然后95℃ 10s，55℃
40s，在55℃进行三重荧光检测，共进行45个循环，可获得最低Ct值和最高荧光强度。
[0076] 2.2特异性试验
[0077] 本发明建立的多重荧光 RT-PCR方法对肠道腺病毒、星状病毒和札如病毒具有较好的特异性，近期采集的甲腹泻患者的粪便标本也检测出阳性反应。而与其他肠道病毒如轮状病毒、诺如病毒（I型和II型）、肠道病毒EV71和CoxA16病毒等均无交叉反应，结果参见图2, 图中A为札如病毒样品、B为腺病毒样品、C为星状病毒样品。
[0078] 2.3 敏感性试验
[0079] 对肠道腺病毒、星状病毒和札如病毒，对已标定拷贝数（Copies/ml）的肠道腺病毒8 7 7
（2×10Copies/ml）、星状病毒（2×10Copies/ml）和札如病毒（4×10Copies/ml）分别稀释
100000、10000、1000、100、10倍后，用荧光RT-PCR方法进行检测，结果荧光RT-PCR方法检测敏感性，肠道腺病毒为2×10 Copies/ml，结果参见图3，其标准曲线参见图4；星状病毒为
2×10 Copies/ml，结果参见图5，其标准曲线参见图6；札如病毒为4×10 Copies/ml，结果参见图7，其标准曲线参见图8。
（2×10Copies/ml）、星状病毒（2×10Copies/ml）和札如病毒（4×10Copies/ml）分别稀释
100000、10000、1000、100、10倍后，用荧光RT-PCR方法进行检测，结果荧光RT-PCR方法检测敏感性，肠道腺病毒为2×10 Copies/ml，结果参见图3，其标准曲线参见图4；星状病毒为
2×10 Copies/ml，结果参见图5，其标准曲线参见图6；札如病毒为4×10 Copies/ml，结果参见图7，其标准曲线参见图8。
[0080] 2.4 重复性试验
[0081] 分别取终浓度为肠道腺病毒（2×107Copies/ml）、星状病毒（2×107Copies/ml）和7
札如病毒（2×10Copies/ml）为混合后按10倍梯度稀释成3个不同的浓度，对每一个浓度的样本作5个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.10～0.31之间，具有较好的重复性（表1）。
札如病毒（2×10Copies/ml）为混合后按10倍梯度稀释成3个不同的浓度，对每一个浓度的样本作5个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.10～0.31之间，具有较好的重复性（表1）。
[0082] 表1 荧光RT-PCR法检测肠道病毒的重复性试验
[0083]。
[0084] 2.5临床样本的检测
[0085] 采用“十一五”重大专项-传染病病原监测技术平台的腹泻症候群调查表，对2009年7月到2010年12月从浙江大学医学院附属第一医院收集的门诊2020份腹泻标本（每日排便3次或以上、且大便呈稀便、水样便、粘脓便或脓血便等性状有改变）。从收集的腹泻临床样本中直接提取病毒RNA和DNA，用本发明肠道病毒荧光RT-PCR方法和普通RT-PCR方法同时检测肠道病毒核酸，结果肠道病毒荧光RT-PCR方法检测出肠道病毒核酸阳性82份(腺病毒22份、星状病毒25份、札如病毒35份)，普通RT-PCR法检测出肠道病毒核酸阳性66份(腺病毒18份、星状病毒20份、札如病毒28份)，本发明肠道病毒荧光RT-PCR方法比普通RT-PCR法检测肠道病毒的阳性率高。本发明肠道病毒荧光RT-PCR方法用于临床样本检测的验证在4个平行实验室进行，均获得了满意的结果。