为了测定糖化胺的样品前处理方法和糖化胺的测定方法

摘要

本发明提供以糖化胺为测定对象的样品的前处理方法，并以可能进行可信的优良糖化胺测定为目的。使果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)作用于样品中的糖化氨基酸而将其分解后，进一步使FAOD作用于前述样品中的测定对象糖化胺，通过测定其氧化还原反应而测定糖化胺的量。作用于糖化氨基酸的FAOD和作用于糖化胺的FAOD可以具有相同的底物特异性，也可以具有不同的底物特异性。当使用相同的FAOD时，在使FAOD作用于糖化氨基酸而将其分解后，通过蛋白酶使前述FAOD失活，同时分解前述糖化胺，进一步添加相同的FAOD使之作用，测定其氧化还原反应。

权利要求

1.一种糖化蛋白质的含量的测定方法，其通过用蛋白酶对样品中的糖化蛋白质进行处理，然后用果糖基氨基酸氧化酶即测定用FAOD对生成的糖化氨基酸和/或糖化肽进行处理，从而测定糖化蛋白质的含量，其特征在于，包含下述前处理工序：

在用蛋白酶对糖化蛋白质进行处理之前，通过使果糖基氨基酸氧化酶即分解用FAOD作用于所述样品中可能存在的非测定对象糖化物，从而对所述非测定对象糖化物进行分解处理，其中所述非测定对象糖化物指样品中存在的除测定对象糖化蛋白质以外的糖化氨基酸和糖化肽。

说明书

为了测定糖化胺的样品前处理方法和糖化胺的测定方法

[0001] 本申请是申请日为2002年10月9日、优先权日为2001年10月11日、中国专利申请号为02820191.4、发明名称为“为了测定糖化胺的样品前处理方法和糖化胺的测定方法”的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及为了测定糖化胺的样品前处理方法和糖化胺的测定方法。

背景技术

[0003] 以往，利用氧化还原反应测定样品中的测定对象的量已广泛实施，其也适用于生化分析、临床检查等中糖化胺(糖化蛋白质、糖化肽、糖化氨基酸等)的测定。

[0004] 特别地，血液中的糖化蛋白质，特别是其中的红细胞中的糖化血红蛋白反映机体血糖值的过去的历史，因此是糖尿病诊断、治疗等中的重要指标。例如，如下所示，用前述氧化还原反应，测定这种红细胞中的糖化蛋白质。

[0005] 首先，将红细胞溶血以制备样品，将果糖基氨基酸氧化酶(以下称为“FAOD”)加到此溶血样品中，其作用于糖化蛋白质的糖化部分，从而通过氧化还原反应生成过氧化氢。此过氧化氢量对应于前述糖化蛋白质量。然后，将过氧化物酶(以下称为“POD”)和通过氧化而显色的还原剂加到此样品中，从而以前述POD为催化剂在前述过氧化氢和前述还原剂之间发生氧化还原反应。通过前述反应使前述还原剂显色，通过测定这种显色而可以测定前述过氧化氢量，结果是，可以得知红细胞中的糖化蛋白质量。

发明内容

[0006] 但是，用这种氧化还原反应测定糖化蛋白质的方法有这样的问题，例如，生成比对应于样品中实际所含糖化蛋白质的过氧化氢更多的过氧化氢。而且，取决于患者，糖化蛋白质的测定值暂时急剧升高，从而无法进行可信的测定。因此，前述方法需要进一步提高测定精度。而且，不限于在用前述氧化还原反应的测定方法，例如，在用抗原抗体反应的糖化胺测定方法中也同样需要提高测定精度。

[0007] 因此，本发明的目的是提供用于测定糖化胺的样品前处理方法，借此使糖化胺的高度可信的测定成为可能。

[0008] 为了达成前述目的，本发明提供以糖化胺为测定对象的样品的前处理方法，所述方法包括使FAOD作用于前述样品中存在的除测定对象糖化胺以外的糖化氨基酸或糖化肽而分解之，以除去前述糖化氨基酸或糖化肽。

[0009] 前述“FAOD”是一般名称，其底物不限于糖化氨基酸，例如，其还作用于糖化肽。而且，在本发明中，“糖化肽”指FAOD起作用的长度的肽，例如，氨基酸残基数在2-6范围内的肽。因此，在本发明中，FAOD不起作用的长度的糖化肽和糖化蛋白质总称为“糖化蛋白质”。这样，作为测定对象的前述糖化胺，例如，包括糖化蛋白质、糖化肽和糖化氨基酸。

[0010] 本发明的发明人进行了深入研究以提高测定精度，并最终发现以下的事实。即，在全血中，除本来存在测定对象糖化胺以外，还存在测定对象以外的游离糖化氨基酸和糖化肽，前述FAOD也对这种糖化氨基酸和糖化肽起作用。因此，如果如上述用FAOD进行糖化胺的测定，则不仅在测定对象糖化胺和FAOD之间发生氧化还原反应，而且在测定对象以外的糖化氨基酸、糖化肽和FAOD之间发生氧化还原反应，从而在表面上增加测定对象的测定值。而且，关于前述问题，即就同一患者的全血样品而言，即使在完全相同的条件下通过前述测定方法进行测定，从患者采血时间不同时测定值也显著变化，还发现了以下事实。即，这个问题是主要见于接受点滴等的患者的现象，作为点滴成分，例如，含有葡萄糖等糖类和各种氨基酸时，由这些外来成分形成糖化氨基酸，糖化氨基酸暂时增加，导致上述测定值变化。这种现象不仅存在于前述通过氧化还原反应的测定中，例如，在前述用抗原抗体反应的测定方法中也同样出现。因此，本发明的发明人发现，即使全血样品中存在正常的糖化氨基酸或糖化肽、暂时的外来糖化氨基酸或糖化肽等除测定对象以外的糖化物，如果如本发明那样预先对样品进行前处理，使分解用FAOD作用于除测定对象以外的糖化氨基酸、糖化肽，就可以抑制如前述的表面上的测定值升高。通过其可以提高测定精度，此外，例如，由于与是否接受点滴无关，采血可以在任何时间进行，因此可以减少患者的负担。因此，这样的样品前处理方法，例如，如果应用于前述的糖化血红蛋白的测定，则糖化血红蛋白作为糖尿病诊断指标的可靠性得以提高，从而成为临床医疗等领域中的有用方法。

[0011] 其次，本发明提供通过使FAOD作用于样品中的糖化胺，测定其氧化还原反应而测定糖化胺的量的方法，所述方法包括在前述氧化还原反应之前，预先用前述本发明的前处理方法处理前述样品而分解前述样品中存在的除糖化胺以外的糖化氨基酸或糖化肽，以除去前述糖化氨基酸或糖化肽。

[0012] 由于如前述的理由，可以通过这种测定方法提高测定精度。在下文中，在本发明中，用于分解前述糖化氨基酸、糖化肽的FAOD称为“分解用FAOD”，而用于作用于前述糖化胺的FAOD称为“测定用FAOD”。而且，存在的除测定对象糖化胺以外的糖化氨基酸和糖化肽在下文中称为“非测定对象糖化物”。

[0013] 本发明的测定方法，例如，可以是使用对前述非测定对象糖化物和前述测定对象糖化胺具有不同底物特异性的FAOD的第一测定方法，和使用相同的FAOD的第二测定方法。

[0014] 在FAOD中，如后述，例如，存在作用于α-氨基的糖化部分的FAOD，作用于赖氨酸、精氨酸等氨基酸残基的侧链氨基的糖化部分的FAOD，和作用于前述两者的糖化部分的FAOD，它们的底物特异性取决于FAOD的种类而不同。因此，在糖化胺的测定中，通过使FAOD作用于前述α-氨基的糖化部分、前述侧链氨基的糖化部分或两者的糖化部分，可能测定其量。

[0015] 在本发明的第一测定方法中，优选作用于前述非测定对象糖化物的分解用FAOD和作用于测定对象糖化胺的测定用FAOD具有不同的底物特异性。由此，用分解用FAOD分解前述非测定对象糖化物的糖化部分，而糖化胺的未经前述分解用FAOD作用的糖化部分然后受到具有不同底物特异性的测定用FAOD的作用，因此，可以不受前述非测定对象糖化物的影响，从而提高测定精度。

[0016] 具体而言，例如，如果非测定对象的α-氨基被糖化，而测定对象糖化胺的α-氨基糖化部分和侧链氨基被糖化，则优选前述分解用FAOD是特异性作用于糖化α-氨基的酶，而前述测定用FAOD是特异性作用于糖化α-氨基和糖化氨基酸残基侧链的酶。由于前述测定用FAOD作用于α-氨基糖化部分和侧链氨基糖化部分二者，因此如果是以往的方法，它还作用于如前述的α-氨基被糖化的非测定对象糖化物。但是，在本发明中，由于预先用特异性作用于前述糖化α-氨基的分解用FAOD分解前述非测定对象糖化物的糖化部分，因此测定用FAOD不作用于它们，从而抑制了表面上的测定值增加，提高了精度。而且，由于测定用FAOD如前述作用于α-氨基糖化部分和侧链氨基糖化部分二者，通过分解用FAOD分解糖化胺的α-氨基糖化部分，因此测定用FAOD能够仅作用于糖化胺的侧链氨基糖化部分。因此，其特别地是以侧链氨基的糖化量为特征的糖化胺的测定中的有用方法。这种糖化胺的实例是ε-糖化赖氨酸和糖化白蛋白等。

[0017] 当使用这种不同的FAOD时，优选在使FAOD作用于前述非测定对象糖化物之前或之后，用蛋白酶分解糖化胺，并使测定用FAOD作用于这种糖化胺分解物，从而进行前述氧化还原反应。分解糖化胺是因为，当测定对象为糖化蛋白质时，FAOD难以作用于前述糖化蛋白质，而作用于如前述的糖化肽和糖化氨基酸，并且，对前述糖化氨基酸的作用比对前述糖化肽的作用更为容易。而且，蛋白酶处理的顺序不受非测定对象糖化物的分解处理前后的限制的原因是，由于测定用FAOD可以作用于不同于如前述的分解用FAOD的糖化部分，因此糖化胺本身的测定不受影响。而且，当测定对象是糖化肽时，因为如果分解成更短的糖化肽或糖化氨基酸，则FAOD更容易地作用，因此优选进行蛋白酶处理。

[0018] 在本发明中，除非特别指出，“非测定对象糖化物糖化氨基酸和糖化肽”指在分解处理前样品中包含的物质，例如，它不包括测定对象糖化蛋白质和糖化肽的分解物。

[0019] 接着，作为本发明的第二测定方法，优选在使分解用FAOD作用于非测定对象糖化物之后，用蛋白酶分解测定对象糖化胺，接着加入与前述分解用FAOD相同的FAOD，使之作用于前述蛋白酶分解物，从而进行前述氧化还原反应。这种方法，例如，在被测定对象糖化物为糖化氨基酸，而测定对象糖化胺为糖化蛋白质或糖化肽时有用。

[0020] 具体而言，优选通过前述蛋白酶使前述分解用FAOD失活。如上述，FAOD具有难以作用于糖化蛋白质，且作用于糖化氨基酸比作用于糖化肽更容易的性质。因此，当非测定对象糖化物为糖化氨基酸时，例如，即使添加分解用FAOD，从酶的反应速度论而言，在分解糖化氨基酸的处理时间内，它也不作用于糖化蛋白质，并且几乎不作用于糖化肽。但是，如果在随后的蛋白酶处理期间前述分解用FAOD的活性残存，则与蛋白酶处理并行，前述分解用FAOD可能作用于通过蛋白酶得到的糖化蛋白质分解物(糖化肽或糖化氨基酸)或糖化肽分解物(较短的糖化肽或糖化氨基酸)。因此，当随后添加测定用FAOD时，前述糖化蛋白质分解物等的一部分已经成为受到分解用FAOD的作用的状态，反而有测定精度下降的危险。但是，如果通过如前述那样用于分解糖化蛋白质等的蛋白酶处理使同时残存的前述分解用FAOD失活，则由蛋白酶处理得到的糖化蛋白质分解物等保持与前述分解用FAOD未反应的原样，可以与随后添加的测定用FAOD反应。因此，测定精度得到提高。

[0021] 此外，例如，也可以测定对象为糖化蛋白质，而非测定对象糖化物为糖化肽。这是因为，当使分解用FAOD作用于糖化肽时，在作用期间它不作用于糖化蛋白质。

[0022] 另一方面，即使没有如前述那样通过蛋白酶处理使分解用FAOD失活，例如，还可以通过调节前述分解用FAOD的添加量和测定用FAOD的添加量实现高精度的测定。在这种情况下，例如，前述分解用FAOD(A)与测定用FAOD(B)的添加比例(活性比A∶B)优选在A∶B＝1∶10-1∶50000的范围内。当存在这样的添加比例时，即使在进行蛋白酶处理期间前述分解用FAOD残存，从酶的反应速度论而言，不用说糖化蛋白质，与非测定对象糖化物糖化氨基酸相比，对测定糖化胺糖化肽的作用更难。此外，在非测定对象糖化物为糖化肽，而测定糖化胺为糖化蛋白质时也是一样的。

[0023] 在本发明的测定方法中，作为前述蛋白酶，例如，可以使用选自金属蛋白酶、菠罗蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶和氨基肽酶的至少一种蛋白酶，但没有特别的限制。

[0024] 当测定对象为如下述的糖化血红蛋白时，前述蛋白酶为选择性分解糖化血红蛋白的蛋白酶，并优选为选自金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来源于猪胰腺的胰蛋白酶和来源于枯草杆菌的蛋白酶的至少一种蛋白酶，更优选为金属蛋白酶和来源于枯草杆菌的蛋白酶，特别优选为金属蛋白酶。如果使这种蛋白酶作用，则因为分解除糖化血红蛋白以外的糖化蛋白质困难，因而FAOD作用于前述其他糖化蛋白质困难，使仅测定糖化血红蛋白成为可能。

[0025] 在本发明中，对测定样品没有特别的限制，例如，本发明的测定方法可以应用于全血、血浆、血清、血细胞、尿和脊髓液等生物样品、果汁等饮料、酱油、沙司等食品。其中，例如，对全血、血浆、血清、血细胞等的血液样品和其他生物样品有用。

[0026] 而且，例如，即使前述全血样品包含外来的糖化氨基酸等，也可以高精度地测定。例如，如前述外来糖化氨基酸是暂时的，在它包含在全血中时仍对糖化蛋白质等的测定值有显著影响。但是，通过本发明，可以避免这种影响。

[0027] 虽然对前述全血样品没有特别的限制，但本发明的测定方法，例如，对从点滴后的患者采集的全血样品有用。这是因为，特别是在点滴后的样品中，由于形成的外来糖化氨基酸而导致测定值的变化。

[0028] 在本发明的测定方法中，作为测定对象，只要利用氧化还原反应，对其没有特别的限制。例如，可以是全血中成分、红细胞中成分、血浆中成分、血清中成分、尿成分、脊髓液成分等，优选为红细胞中成分。例如，当测定前述红细胞成分时，可以使全血本身溶血，将其作为样品，或者可以从全血中分离红细胞，并将前述红细胞溶血，将其作为样品。

[0029] 在本发明的测定方法中，作为前述测定对象糖化胺，包括如前述的糖化蛋白质、糖化肽和糖化氨基酸等。具体而言，例如，可以是糖化血红蛋白、糖化白蛋白等糖化蛋白质。例如，当测定红细胞成分糖化血红蛋白时，可以将全血本身溶血，将其作为样品，或者从全血中分离红细胞，并将前述红细胞溶血，将其作为样品。

附图说明

[0030] 图1是显示在本发明的测定方法的一个实施例中，通过用FAOD的测定方法得到的HbAlc量和通过自动分析装置得到的HbAlc量的相关关系。具体实施方案

[0031] 在本发明的测定方法中使用的FAOD优选是催化下式(1)所示的反应的FAOD，例如，可以是特异性作用于α-氨基被糖化的糖化胺的FAOD(以下称为“FAOD-α”)，特异性作用于氨基酸侧链的氨基被糖化的糖化胺的FAOD(以下称为“FAOD-S”)，和特异性作用于α-氨基被糖化的糖化胺和氨基酸的氨基被糖化的糖化胺二者的FAOD(以下称为“FAOD-αS”)。

[0032] R1-CO-CH2-NH-R2+H2O+O2→R1-CO-CHO+NH2-R2+H2O2…(1)

[0033] 在前述式(1)中，R1表示羟基或来源于糖化前的糖的残基(糖残基)。前述糖残基1
(R)在反应前的糖为醛糖时是醛糖残基，而在反应前的糖为酮糖时是酮糖残基。例如，当反应前的糖为葡萄糖时，通过阿马多里(Amadori)重排，反应后的结构为果糖结构，在这种情
1 1
况下，糖残基(R)变成葡萄糖残基(醛糖残基)。例如，这种糖残基(R)可以由下式表示：

[0034] -[CH(OH)]n-CH2OH

[0035] 其中n为0-6的整数。

[0036] 在前述式(1)中，对R2没有特别的限制，但是，在糖化胺为糖化氨基酸或糖化肽时，在α-氨基被糖化的情况下和在其以外的氨基(氨基酸侧链的氨基)被糖化的情况下是不同的。

[0037] 在前述式(1)中，当α-氨基被糖化时，R2是下式(2)所示的氨基酸残基或肽残基。在这种情况下，前述FAOD-α和FAOD-αS特异性地催化前述式(1)的反应。

[0038] -CHR3-CO-R4 …(2)

[0039] 在前述式(2)中，R3表示氨基酸侧链基，R4表示羟基、氨基酸残基或肽残基，例如，3
可以由下式(3)表示。在下式(3)中，n为0或0以上的整数，而R 表示与前述相同的氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可以全都相同，也可以不同。

[0040] -(NH-CR3H-CO)n-OH …(3)

[0041] 在前述式(1)中，当α-氨基以外的氨基被糖化(氨基酸侧链基被糖化)时，R2可以由下式(4)表示。在这种情况下，前述FAOD-S和FAOD-αS特异性地催化前述式(1)的反应。

[0042] -R5-CH(NH-R6)-CO-R7…(4)

[0043] 在前述式(4)中，R5表示氨基酸侧链基中糖化氨基以外的部分。例如，当糖化氨基5
酸为赖氨酸时，R 为

[0044] -CH2-CH2-CH2-CH2-

[0045] 例如，当糖化氨基酸为精氨酸时，R5为

[0046] CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-

[0047] 在前述式(4)中，R6表示氢、氨基酸残基或肽残基，例如，可以由下式(5)表示。在3
下式(5)中，n表示0或0以上的整数，R 表示与前述相同的氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可以全都相同，也可以不同。

[0048] -(CO-CR3H-NH)n-H …(5)

[0049] 在前述式(4)中，R7表示羟基、氨基酸残基或肽残基，例如，可以由下式(6)表示。3
在下式(6)中，n为0或0以上的整数，R 表示与前述相同的氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可以全都相同，也可以不同。

[0050] -(NH-CHR3-CO)n-OH …(6)

[0051] 特异性作用于前述糖化α-氨基的FAOD-α，例如，可以是市售的商品果糖基氨基酸氧化酶(FAOX-E)(キッコ一マン社制)和来源于青霉属的FAOD(特开平8-336386号公报)。特异性作用于前述糖化氨基酸侧链的FAOD-S，例如可以是来源于镰刀菌属的FAOD(日本生物工学会大会平成12年度“Fusarium oxysporum由来アミノ酸オキシダ一ゼの基質特異性の変换；藤原真紀等”)等。而且，特异性作用于前述糖化α-氨基和糖化氨基酸侧链基二者的FAOD-αS，例如，可以是市售的商品FOD(旭化成社制)、来源于赤霉属的FAOD(特开平8-154672号公报)、来源于镰刀菌属的FAOD(特开平7-289253号公报)和来源于曲霉属的FAOD(WO 99/20039)等。

[0052] 下面，将以用含有非测定对象糖化物糖化氨基酸的全血样品，测定来源于血细胞的糖化蛋白质为例说明本发明的测定方法。在本发明中，除非特别指出，“非测定对象糖化物糖化氨基酸”指测定前包含在样品中的物质，例如，不包括测定对象糖化蛋白质的蛋白酶分解物。

[0053] (第一实施方案)

[0054] 本实施方案是使用FAOD-α分解前述糖化氨基酸，并用FAOD-αS测定糖化蛋白质的前述第一测定方法的一个实例。

[0055] 首先，使全血溶血而制备溶血样品。对此溶血方法没有特别的限制，例如，可以使用用表面活性剂的方法、用超声波的方法、利用渗透压差的方法和用冷冻融解的方法。其中，由于操作的简便性等的理由，用表面活性剂的方法是优选的。

[0056] 作为前述表面活性剂，例如，可以使用聚氧乙烯基对叔辛基苯基醚(Triton系表面活性剂等)、聚氧乙烯失水山梨糖醇烷基酯(Tween系表面活性剂等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij系表面活性剂等)等，具体而言，可以为商品Triton X-100、商品Tween-20、商品Brij35等。用前述表面活性剂处理的条件通常如下：当处理溶液中的血细胞浓度为1-10体积％时，加入表面活性剂以使前述处理溶液中的浓度为0.1-1重量％，并在室温下搅拌约5秒至
1分钟。

[0057] 在前述利用渗透压差时，例如，添加2-100倍于全血的体积的纯化水，以进行溶血。

[0058] 接着，对前述溶血样品进行蛋白酶处理。通过这种蛋白酶处理而分解糖化蛋白质使后述FAOD作用更容易。对前述蛋白酶的种类没有特别的限制，可以使用如上述的蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、氨基肽酶、木瓜蛋白酶、金属蛋白酶等。前述蛋白酶处理通常在缓冲液中进行，其处理条件根据使用的蛋白酶的种类、测定对象糖化蛋白质的种类和浓度等适宜地确定。

[0059] 当用胰蛋白酶作为蛋白酶处理前述样品时，例如，反应液中蛋白酶浓度为100-6000U/L，反应液中血细胞浓度为0.2-5体积％，反应温度为20-50℃，反应时间为10分钟至20小时，pH为6-9。这种处理通常在缓冲液中进行，对能够使用的缓冲液没有特别的限制，例如，可以是Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液等。

[0060] 接着，用催化前述式(1)的反应，具体为下式(7)的反应的FAOD-α处理前述经蛋白酶处理的溶血样品。

[0061] R1-CO-CH2-NH-CHR3-COOH+H2O+O2

[0062] →R1-CO-CHO+NH2-CHR3-COOH+H2O2…(7)

[0063] 在前述式(7)中，R1表示与前述相同的糖残基，R3表示与前述相同的氨基酸侧链。

[0064] 通过这种处理，将前述溶血样品中包含的α-氨基被糖化的糖化氨基酸，和前述糖化蛋白质分解物中的α-氨基的糖化部分分解。

[0065] 通过前述FAOD-α处理，糖化氨基酸中，侧链氨基被糖化的残存而不被分解。但是，考虑到这种侧链被糖化的氨基酸相对于全部糖化氨基酸的比例，及其相对于糖化蛋白质中具有糖化侧链氨基的糖化氨基酸的比例，残存的糖化氨基酸的影响是小的，测定精度得到充分提高。

[0066] 作为处理条件，例如，反应液中FAOD-α的浓度为10-5000U/L，反应液中血细胞的浓度为0.5-20体积％，反应温度为20-50℃，反应时间为1分钟至1小时，pH为6-9。这种处理通常在缓冲液中进行，可以使用与前述蛋白酶处理相同的缓冲液。

[0067] 接着，将经前述FAOD-α处理的前述溶血样品用FAOD-αS进一步处理。如上述，这种FAOD-αS作用于糖化α-氨基和糖化侧链氨基二者。但是，由于预先已用分解用FAOD-α处理糖化蛋白质分解物，因而可以使测定用FAOD-αS仅作用于糖化侧链氨基。

[0068] 这种FAOD-αS处理，与前述蛋白酶处理相同，优选在缓冲液中进行，对前述缓冲液没有特别的限制，可以使用与前述蛋白酶处理相同的缓冲液。

[0069] 作为处理条件，例如，反应液中的FAOD-αS浓度为10-30000U/L，反应液中的血细胞浓度为0.1-5体积％，反应温度为20-50℃，反应时间为1分钟至1小时，pH为6-9。

[0070] 接着，通过用POD和前述显色底物进一步的氧化还原反应而测定由前述FAOD-αS处理形成的过氧化氢。

[0071] 作为显色底物，例如，可以是N-(羧甲基氨基羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯基胺钠、邻亚苯基二胺(OPD)、Trinder试剂和4-氨基安替比林组合的底物。作为前述Trinder试剂，例如，可以是苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺和萘胺衍生物。而且，除前述氨基安替比林以外，也可以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。在这些显色底物中，特别优选如前述的N-(羧甲基氨基羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯基胺钠。

[0072] 前述氧化还原反应通常在缓冲液中进行。其条件根据前述形成的过氧化氢的浓度等而适宜地确定。通常，反应液中的POD浓度为10-100000IU/L，显色底物浓度为0.005-30mmol/L，反应温度为15-37℃，反应时间为0.1-30分钟，pH为5-9。而且，对前述缓冲液没有特别的限制，例如，可以使用与前述蛋白酶处理和FAOD处理等相同的缓冲液。

[0073] 在前述氧化还原反应中，例如，当使用前述显色底物时，可以通过用分光光度计测定前述反应液的显色程度(吸光度)来测定过氧化氢的量。然后，例如，可以用此过氧化氢浓度和校正曲线等求出样品中糖化蛋白质的量。在本实施方案中，根据氨基酸残基侧链氨基的糖化量测定糖化蛋白质的量。

[0074] 通过添加的分解用FAOD-α形成的过氧化氢首先与血液样品(溶血样品)中存在的过氧化氢酶反应而消失，因此对通过FAOD-αS形成的来源于测定对象的过氧化氢的测定没有任何影响。此外，另一方面也可以通过添加过氧化氢酶而除去。当如前述通过过氧化氢酶除去时，为了防止后来进行的FAOD-αS处理形成的过氧化氢被除去，优选在加入FAOD-αS时加入过量的POD和显色底物。在这种情况下，相对于前述过氧化氢酶的添加量(U)，例如，优选添加5-100倍的活性(U)量的POD。

[0075] 前述过氧化氢量不仅可以用前述POD等酶法测定，而且例如，可以通过电方法测定。

[0076] 在此测定中，前述蛋白酶处理不限于如前述在前述分解用FAOD-α处理之前，例如，也可以在FAOD-α处理之后进行。如上述，进行前述蛋白酶处理以使FAOD可以容易地作用，但是由于进行前述FAOD-α处理是为了分解糖化氨基酸，因此即使在FAOD-α处理之前没有用蛋白酶分解糖化蛋白质，也可以充分地实现本发明的效果。

[0077] 例如，本实施方案的测定方法还适用于当非测定对象糖化物为α-氨基被糖化的糖化氨基酸，测定对象糖化胺为α-氨基被糖化的糖化蛋白质的时候。在这种情况下，即使分解用FAOD难以作用于糖化蛋白质，例如，残存的分解用FAOD也可能作用于由蛋白酶处理得到的蛋白酶分解物，因此，例如，优选如下述第二实施方案那样通过蛋白酶分解而使残存的FAOD失活，或者如第三实施方案那样调节分解用FAOD与测定用FAOD的添加比例。

[0078] (第二实施方案)

[0079] 本实施方案是将相同的FAOD用于非测定对象糖化物糖化氨基酸的分解和测定对象糖化蛋白质的测定的前述第二测定方法的一个实例。对FAOD没有特别的限制，例如可以使用FAOD-α、FAOD-S和FAOD-αS中的任一种。

[0080] 以与前述第一实施方案相同的方式制备溶血样品，并将分解用FAOD加到此溶血样品中。

[0081] 作为处理条件，例如，反应液中的FAOD浓度为10-5000U/L，反应液中的血细胞浓度为0.5-20体积％，反应温度为20-50℃，反应时间为1分钟至1小时，pH为6-9。这种处理通常在缓冲液中进行，可以使用与前述相同的缓冲液。

[0082] 接着，对经FAOD处理的样品进行蛋白酶处理。此蛋白酶处理的第一个目的，与前述相同，是分解来源于血细胞的糖化蛋白质，以使后面的步骤中进一步添加的测定用FAOD容易作用。第二个目的是通过消化使前述分解用FAOD失活。

[0083] 由于FAOD难以作用于糖化蛋白质，而容易作用于糖化氨基酸，因此在前述分解用FAOD处理中，样品中的糖化氨基酸先被分解。但是，当在这种分解用FAOD残存的状态下用蛋白酶处理前述糖化蛋白质时，有这样的问题，即残存的FAOD与糖化蛋白质分解物的糖化部分反应，从而不能正确地测定。因而，可以用蛋白酶使残存的FAOD失活，从而防止其与前述糖化蛋白质分解物反应。为此目的，需要使开始加入的分解用FAOD快速失活，并且添加能够只分解糖化蛋白质的蛋白酶。

[0084] 对前述蛋白酶没有特别的限制，可以使用与前述相同的蛋白酶。此前，其处理条件，例如，根据使用的蛋白酶的种类、糖化蛋白质的种类及其浓度、分解用FAOD的种类及其量等适宜地确定。

[0085] 蛋白酶处理的反应液中蛋白酶的添加量相对于分解用FAOD为100U/L而言，例如在1-1000000KU/L的范围内，优选在10-300000KU/L的范围内，更优选为100-100000KU/L的范围内。

[0086] 具体而言，当用胰蛋白酶作为蛋白酶处理前述样品时，例如，反应液中的蛋白酶浓度为1000-30000KU/L，反应液中的血细胞浓度为0.2-5体积％，反应液中的FAOD浓度为10-1000U/L，反应温度为20-50℃，反应时间为10分钟至20分钟，pH为6-9。

[0087] 接着，再次添加与分解用FAOD相同的FAOD作为测定用FAOD来处理通过前述蛋白酶处理得到的糖化蛋白质分解物。因为有通过前述蛋白酶而失活的可能性，因此加入足量的这种测定用FAOD是必要的。

[0088] 还优选这种测定用FAOD处理与前述相同在缓冲液中进行，对缓冲液没有特别的限制，可以使用与前述蛋白酶处理相同的缓冲液。

[0089] 测定用FAOD处理的反应溶液中测定用FAOD的添加量相对于蛋白酶为10000KU/L而言，例如，在10-1000000U/L的范围内，优选在100-200000U/L的范围内，更优选在500-50000U/L的范围内。

[0090] 作为具体的处理条件，例如，反应液中的FAOD浓度为500-20000U/L，反应液中的蛋白酶浓度为100-30000KU/L，反应液中的血细胞浓度为0.01-1体积％，反应温度为15-40℃，反应时间为1分钟至1小时，pH为6-9。

[0091] 根据本实施方案，即使在糖化氨基酸的分解和糖化蛋白质的测定中使用的FAOD相同，也可以不受前述糖化氨基酸的影响而以高精度测定。

[0092] (第三实施方案)

[0093] 本实施方案是将在非测定对象糖化物糖化氨基酸的分解和测定对象糖化蛋白质的测定中使用相同的FAOD的实例。但是，本实施方案不同于前述第二实施方案，它不总是必需要用蛋白酶将分解用FAOD失活。由于酶的底物特异性，根据蛋白酶和FAOD的组合，可能存在用蛋白酶难以使FAOD失活的情况。本实施方案的方法在这种情况下是有效的。如果首先加入的分解用FAOD与通过蛋白酶形成的糖化蛋白质分解物反应，则不能提高测定精度，因此，如下所述，调节FAOD的添加比例是重要的。

[0094] 首先，以与前述第一实施方案相同的方式制备溶血样品，并将分解用FAOD加到此溶血样品中。

[0095] 当难以用蛋白酶使分解用FAOD失活时，需要加入一定范围内的分解用FAOD，以使即使活性残存，在蛋白酶处理期间，其也不作用于所形成的糖化蛋白质分解物。由于FAOD具有难以作用于糖化蛋白质，而比作用于糖化肽更容易地作用于糖化氨基酸的性质，因此，例如，优选添加量和反应时间为仅作用于糖化氨基酸的程度。

[0096] 作为FAOD处理的条件，例如，反应液中的FAOD浓度为10-5000U/L，反应溶中的血细胞浓度为0.2-20体积％，反应温度为20-50℃，反应时间为1分钟至1小时，pH为6-9。这种处理通常在缓冲液中进行，可以使用与前述相同的缓冲液。

[0097] 接着，对前述经FAOD处理的样品进行蛋白酶处理。由于本实施方案，如前述那样，是蛋白酶难以作用于前述FAOD的情况的实例，因而对蛋白酶的添加量没有特别的限制。

[0098] 对前述蛋白酶没有特别的限制，可以使用与前述相同的蛋白酶。其处理条件，与前述相同，根据使用的蛋白酶的种类、测定对象糖化蛋白质的种类及其浓度、首先加入的FAOD的种类及其浓度，以及使用的蛋白酶对FAOD的底物特异性等来适宜地确定。

[0099] 符合本实施方案内的FAOD和蛋白酶的组合，例如，可以为商品FOD(旭化成社制)和商品トョチ一ム(东洋纺社制)的组合，以及前述来源于赤霉属的FAOD和商品蛋白酶K(ロッシュ社制)的组合。

[0100] 当用胰蛋白酶作为蛋白酶处理前述样品时，例如，反应液中的蛋白酶浓度为100-6000U/L，反应液中的血细胞浓度为0.2-5体积％，反应液中的FAOD浓度为0.1-100U/L，反应温度为20-50℃，反应时间为10分钟至20小时，pH为6-9。

[0101] 然后，向前述通过蛋白酶处理得到的分解物中再次加入相同的FAOD作为测定用FAOD。

[0102] 此测定用FAOD处理也优选与前述相同在缓冲液中进行，对前述缓冲液没有特别的限制，可以使用与前述蛋白酶处理相同的缓冲液。

[0103] 这样，在本实施方案中，分解用FAOD(A)与测定用FAOD(B)的添加比例(活性比A∶B)，例如，如前述那样，在1∶50000-1∶10的范围内，优选在1∶5000-1∶25的范围内，更优选在1∶500-1∶50的范围内。如此设定，与前述第二实施方案不同，前述分解用FAOD残存在反应液中，但是，由于这种残存的FAOD的反应速度非常低，因此在蛋白酶处理步骤中残存的FAOD作用于形成的糖化蛋白质分解物没有达到影响测定的程度。

[0104] 作为测定条件，例如，反应液中的FAOD浓度为500-20000U/L，反应液中的蛋白酶浓度为100-30000KU/L，反应液中的血细胞浓度为0.01-1体积％，反应温度为15-40℃，反应时间为1分钟至1小时，pH为6-9。

[0105] 实施例

[0106] (实施例1和比较例1)

[0107] 对患者实施含氨基酸和葡萄糖的点滴，在1小时后，采集血液。将该血液离心分离(1000g，10分钟)，分离血细胞和血浆，将0.006mL前述血细胞部分、0.006mL前述血浆部分和0.45mL下述溶血试剂A混合，以使前述血细胞溶血而制备溶血样品。

[0108] (溶血试剂A：pH 8.5)

[0109] 商品TAPS(同仁化学社制) 140mmol/L

[0110] 甘氨酰胺(ナカラィテスク社制) 60mmol/L

[0111] 聚氧乙烯月桂基醚(ナカラィテスク社制) 24g/L

[0112] 在25℃下将0.0023mL下述各种FAOD溶液(浓度200KU/L)加到前述溶血样品中，于37℃下培养40分钟。下述(1)来源于青霉属的FAOD特异性作用于糖化α-氨基，(2)来源于曲霉属的FAOD特异性作用于糖化α-氨基和糖化ε-氨基，(3)FAOX-E是特异性作用于糖化α-氨基的FAOD。

[0113] (使用的FAOD)

[0114] (1)来源于前述青霉属的FAOD(特开平8-336386公报)

[0115] (2)来源于前述曲霉属的FAOD(WO 99/20039)

[0116] (3)商品FAOX-E(キツコ一マン社制，下文相同)

[0117] 接着，往0.01mL前述添加了FAOD的溶血样品中加入0.01mL纯化水，并进一步加入0.065mL下述蛋白酶试剂，于37℃下培养5分钟。然后加入0.045mL下述显色试剂，于37℃下培养3分钟，用测定装置(商品JCA BM-8，日本电子社制)测定反应液的吸光度(波长751nm)。作为比较例，除将纯化水而不是前述各种FAOD加到前述溶血样品中以外，以与前述实施例相同的方式进行测定。而且，作为对照，除了向前述血浆中而不是前述血球中加入纯化水以外，以与前述实施例相同的方式进行测定。其结果如下表1所示。

[0118] (蛋白酶试剂：pH 6.5)

[0119]

[0120] (显色试剂)

[0121]

[0122] 表1

[0123]

[0124] 如前述表1所示，由于在比较例1中，血浆中所含的糖化氨基酸还与显色试剂中所含的FAOD反应，因而测定的血细胞中的糖化蛋白质的吸光度比对照的高。相反，由于在实施例1中，预先用FAOD处理血浆中的糖化氨基酸，因而可以精确地测定前述糖化蛋白质，与对照的相关性也高。这是因为，显色试剂中包含的FAOD可以仅作用于来源于血细胞的糖化蛋白质分解物。

[0125] (实施例2和比较例2)

[0126] 以与前述实施例1相同的方式采集点滴后的血液，并使其静置。然后回收已自然沉淀的血细胞，并将0.01mL这种血细胞部分与0.3

[0127] mL下述溶血试剂B混合而制备溶血样品。用前述自动分析装置分析此溶血样品的Hb浓度和HbAlc浓度。由于通过自然沉淀而回收前述血细胞，因而前述血细胞部分包含血浆成分。

[0128] (溶血试剂B：pH 8.5)

[0129]

[0130] 往0.01mL前述溶血样品中加入0.01mL纯化水和0.065mL前述蛋白酶试剂，于37℃下培养。从培养开始起4.5分钟后测定571nm的吸光度，将其作为表示Hb浓度的吸光度。然后在从培养开始起5分钟后，加入0.045mL与实施例1相同的显色试剂，在37℃下培养3分钟，用前述自动分析装置测定进一步反应3分钟后的751nm的吸光度，将其作为表示HbAlc浓度的吸光度。

[0131] 然后，将测定的吸光度分别代入预先作成的表示Hb浓度(g/L)或HbAlc浓度(g/L)与吸光度之间的关系的校正曲线，求出HbAlc浓度和Hb浓度，从下式算出HbAlc％。

[0132] HbAlc(％)＝(HbAlc浓度/Hb浓度)×100

[0133] 如以下所示作成前述校正曲线。首先，用自动测定仪(商品HA-8150：ア一クレィ株式会社)测定HbAlc浓度和Hb浓度已知的各种浓度的标准液的HbAlc浓度和Hb浓度。另一方面，关于前述标准液，通过与前述实施例相同的测定方法测定与Hb浓度和HbAlc浓度相当的吸光度。然后，根据由前述自动测定仪得到的测定值和前述吸光度作成一次回归式，将其作为校正曲线。

[0134] 作为比较例2，除了将不含商品FAOX-E的前述溶血试剂A而不是前述溶血试剂B加到前述血细胞中以外，以与前述实施例2相同的方式进行测定。

[0135] 而且，作为对照，向0.05mL通过自然沉淀而回收的前述血细胞部分中加入2.5mL下述自动测定仪HA-8150专用稀释液以进行溶血，将所得物作为溶血样品。然后，用前述自动测定仪(商品HA-8150：ア一クレィ株式会社)测定这种溶血样品的HbAlc浓度。

[0136] 以上的结果如图1所示。该图显示通过酶法测定的实施例2和比较例2的HbAlc(％)与对照的通过自动分析得到的HbAlc(％)的关系。在该图中，实施例的相关式为“y＝1.079x-0.409”，相关系数为“0.967”，比较例的相关式为“y＝1.124x-0.559”，相关系数为“0.931”。

[0137] 如图1所示，在实施例2中，通过开始的FAOD处理(溶血试剂B中的FAOD)而分解血浆中包含的外来糖化氨基酸，通过样品中的过氧化氢酶而除去由这种处理产生的过氧化氢。因此，在通过后来加入的FAOD的氧化还原反应中，仅产生来源于血细胞的糖化蛋白质的过氧化氢，与未添加血浆通过自动分析测定的对照的值非常接近，其相关系数(0.967)也非常高。另一方面，在比较例2中，由于血浆中包含的糖化氨基酸也与作用于糖化蛋白质的FAOD反应，因此，产生的过氧化氢的量也比由糖化蛋白质生成的过氧化氢的量多。因此，比较例的HbAlc(％)也比对照的HbAlc(％)高，与实施例2相比，与对照的相关关系也低(相关系数0.931)。

[0138] 工业实用性

[0139] 如以上，由于本发明的样品前处理方法可以将样品中包含的非测定对象糖化物糖化肽、糖化氨基酸分解除去，因此，对经这样的前处理的样品进行糖化胺的测定，前述非测定对象糖化物的影响得以避免，从而实现优良的测定精度。因此，例如，当采血前接受点滴的患者的血液包含暂时的外来糖化氨基酸等的时候，其影响可以得以避免。将这样的方法，例如，用于测定红细胞中的糖化血红蛋白，测定精度比以往的方法提高，进一步增加了其作为糖尿病诊断等的指标物质的重要性。