一种萝卜与苤蓝属间杂种胚离体培养的方法

摘要

一种萝卜与苤蓝属间杂种胚离体培养的方法，其特征在于按以下步骤依次组成：(1)材料准备、(2)播种、(3)杂交、(4)胚胎抢救，采用本发明的方法成功获得萝卜与苤蓝属间杂种胚，并培养出杂种胚幼苗，以利于得到育种新资源。

权利要求

1.一种萝卜与苤蓝属间杂种胚离体培养的方法，其特征在于按以下步骤依次组成：(1)材料准备：以萝卜雄不育系为母本，以苤蓝为父本；

(2)播种：萝卜和苤蓝种子播种在试验大棚里，对其进行常规田间管理；

(3)杂交方法：在母本抽薹后开花前进行单株隔离，防止与其他十字花科植株串粉；开花后取父本有粉花朵对母本进行重复授粉，挂牌标记杂交组合、花朵数和授粉时间；授粉后跟踪观察荚的生长发育，并测量杂种荚的长度和横径；

(4)胚胎抢救：

1)取材：采取授粉后4-7天的正常生长荚，连同果柄一同摘取，考虑到目的材料的含水量，非雨天在上午10:00以后采荚，雨天在下午14:00后取材；

2)材料处理：将材料置于烧杯中，加清水将材料清洗片刻，切除果柄备用；在超净工作台上将材料置于小烧杯中，用75％酒精浸泡30秒，再用0.1％的升汞浸泡8分钟，最后用无菌水冲洗3次，每次3分钟；

3)接种：将荚果置于灭菌牛皮纸上，剥出胚珠接种于诱导培养基上，其成分为MS+2，

4-D 2.0mg/l+KT 0.5mg/l+蔗糖3％+琼脂0.6％；

-1

4)培养：接种后的培养基置于温度25℃、光照时间16h·d 、光照强度2000～3000lx的培养室中进行培养，30天左右，诱导出胚性愈伤组织，然后将胚性愈伤组织转移到继代培养基上继代培养，继代培养基的成分为MS+2，4-D 2.0mg/l+KT 0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂0.6％，大约15天左右，将愈伤组织接种到分化培养基上，分化培养基的组成为MS+IAA0.5mg/l+KT 1.5mg/l+蔗糖3％+琼脂0.6％，待绿芽长到2-3cm时，转到生根培养基培养，生根培养基为1/2MS+NAA0.2mg/l+IAA0.5mg/l+蔗糖3％+琼脂0.6％；

5)炼苗：打开瓶口，在培养室炼苗2-3天，转到自然条件下炼苗2-3天；

6)移栽：洗去小苗表面的培养基，移栽到小盆里，成活后移栽到大田。

说明书

一种萝卜与苤蓝属间杂种胚离体培养的方法

技术领域

[0001] 本发明为植物组织培养快速繁殖领域，具体涉及一种萝卜与苤蓝属间杂种胚离体培养的方法。

背景技术

[0002] 萝卜(Raphanus sativus L.)是我国栽培的主要蔬菜作物之一，十字花科、萝卜属，一、二年生草本植物。原产我国，各地均有栽培，品种极多，常见有白皮萝卜、红皮萝卜、青皮萝卜等。根供食用，鲜食生食均可，种子含油42％，可用于制肥皂或作润滑油。种子、鲜根、叶均可入药，功能下气消积，生萝卜含淀粉酶，能助消化。苤蓝(Brassica oleracea var.carlorapa D.C.)又名球茎甘蓝，俗名擘蓝、玉蔓青。十字花科，芸薹属，一、二年生草本植物。其食用部分为肉质球茎，质脆嫩，可鲜食及腌制。苤蓝是甘蓝中能形成肉质茎的一个变种，与结球甘蓝相比，其食用部位不同。苤蓝依球茎的色泽可分为绿白色、绿色及紫色三种；依生长期的长短可分为小型的早熟种和大型的晚熟种。长江流域生长期较短，应栽培早、中熟品种。苤蓝适应性强易栽培，耐贮藏、运输。其生物学物征、特性、栽培管理技术，均与甘蓝相似。萝卜和苤蓝均为根用蔬菜，但两者的风味不同，到目前为止，还没有见两者远缘杂交研究方面的报道。为此，本发明对两者进行属间杂交，初步研究了杂交亲和性的表现，以及对杂种胚抢救培养方法进行探讨。

发明内容

[0003] 本发明提供一种萝卜与苤蓝属间杂种胚离体培养的方法，获得萝卜与苤蓝属间杂种胚，获得杂种胚幼苗，以利于得到育种新资源。

[0004] 本发明采用的技术方案是：

[0005] 一种萝卜与苤蓝属间杂种胚离体培养的方法，其特征在于按以下步骤依次组成：

[0006] (1)材料准备：以萝卜雄性不育系为母本，以苤蓝为父本；

[0007] (2)播种：大头菜和苤蓝种子播种在试验大棚里，对其进行常规田间管理；

[0008] (3)杂交方法：在母本抽薹后开花前进行单株隔离，防止与其他十字花科植株串粉；开花后取父本有粉花朵对母本进行重复授粉，挂牌标记杂交组合、花朵数和授粉时间；授粉后跟踪观察荚的生长发育，并测量杂种荚的长度和横径；

[0009] (4)胚胎抢救：

[0010] 1)取材：考虑到目的材料的含水量，非雨天在上午10:00以后采荚，雨天一般在下午14:00后取材；

[0011] 2)材料处理：将材料置于烧杯中，加清水将材料清洗片刻，切除果柄备用。在超净工作台上将材料置于小烧杯中，用75％酒精浸泡30秒，再用0.1％的升汞浸泡8分钟，最后用无菌水冲洗3次，每次3分钟；

[0012] 3)接种：将荚果置于灭菌牛皮纸上，剥出胚珠接种于诱导培养基上；。

[0013] 4)培养：接种后的培养基置于温度25℃、光照时间16h.d-1、光照强度2000～3000lx的培养室中进行培养。30天左右，诱导出胚性愈伤组织。然后将胚性愈伤组织转移到继代培养基上继代培养。大约15天左右，将愈伤组织接种到分化培养基上。待绿芽长到
2-3cm时，转到生根培养基培养；

[0014] 5)炼苗：打开瓶口，在培养室炼苗2-3天，转到自然条件下炼苗2-3天；

[0015] 6)移栽：洗去小苗表面的培养基，移栽到小盆里，成活后移栽到大田；

[0016] 步骤(4)中为了增加花粉与柱头的亲和性，采用的是重复授粉法：连续授粉7天，并注意观察花粉与柱头的亲和性。

[0017] 步骤(4)种取材材料为采取授粉后3-7天的正常生长荚，连同果柄一同摘取。

[0018] 所述的培养基配方分别为：诱导培养基：MS+2，4-D 2.0mg/l+KT 0.5mg/l+蔗糖3％+琼脂0.6％；继代培养基：MS+2，4-D 2.0mg/l+KT 0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂0.6％；分化培养基：MS+IAA 0.5mg/l+KT 1.5mg/l+蔗糖3％+琼脂0.6％；生根培养基：
1/2MS+NAA0.2mg/l+IAA0.5mg/l+蔗糖3％+琼脂0.6％。

[0019] 本发明取得了以下有益效果：

[0020] (1)萝卜与苤蓝属间杂交未见报道，填补相关研究空白；

[0021] (2)确定了萝卜与苤蓝属间杂种胚胚抢救的最佳时间：萝卜与苤蓝杂交的杂交荚荚长快速生长期是在授粉后的第2至第5天，而横径快速生长期是在授粉后第2至第4天。杂种胚适宜的抢救期是在授粉后第6天、第7天进行；

[0022] (3)确定了杂种胚胚抢救的培养阶段和具体的培养基配方。

[0023] (4)采用本试验所提到的生芽和生根培养基能培育出成功的试管苗有利于种资资源的创新。

具体实施方式

[0024] 下面对本发明作一详细说明：

[0025] 实施例：

[0026] 1材料与方法

[0027] 1.1材料

[0028] 以萝卜DH303A雄性不育系(2n＝18)植株7株为母本，分别挂牌标记为A、B、C、D、E、F、G株，以苤蓝为父本。试验在湖北省农业科学院蔬菜科技研究中心基地完成。

[0029] 1.2方法

[0030] 1.2.1杂交方法

[0031] 在母本抽薹后开花前进行单株隔离，防止与其他十字花科植株串粉；开花后取父本有粉花朵对母本进行重复授粉，挂牌标记杂交组合、花朵数和授粉时间。授粉后跟踪观察荚的生长发育，并测量杂种荚的长度和横径。

[0032] 1.2.2杂种胚抢救

[0033] 由于远缘杂交中，杂种胚往往是败育的，需要对杂种胚胎进行胚抢救，需要在胚胎败育之前获取离体胚胎，根据观察所得经验，取3、4、5、6、7天的荚，进行胚胎抢救。其胚抢救的培养基如下：

[0034] 诱导培养基：MS+2，4-D 2.0mg/l+KT 0.5mg/l+蔗糖3％+琼脂0.6％[0035] 继代培养基：MS+2，4-D 2.0mg/l+KT 0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂0.6％[0036] 分化培养基：MS+IAA 0.5mg/l+KT 1.5mg/l+蔗糖3％+琼脂0.6％

[0037] 生根培养基：1/2MS+NAA0.2mg/l+IAA0.5mg/l+蔗糖3％+琼脂0.6％[0038] 胚抢救过程：

[0039] 1)取材：考虑到目的材料的含水量，非雨天在上午10:00以后采荚，雨天一般在下午14:00后取材。采取授粉后3-7天的正常生长荚，连同果柄一同摘取。

[0040] 2)材料处理：将材料置于烧杯中，加清水将材料清洗片刻，切除果柄备用。在超净工作台上将材料置于小烧杯中，用75％酒精浸泡30秒，再用0.1％的升汞浸泡8分钟，最后用无菌水冲洗3次，每次3分钟。

[0041] 3)接种：将荚果置于灭菌牛皮纸上，剥出胚珠接种于诱导培养基上。

[0042] 4)培养：接种后的培养基置于温度25℃、光照时间16h.d-1、光照强度2000～3000lx的培养室中进行培养。30天左右，诱导出胚性愈伤组织。然后将胚性愈伤组织转移到继代培养基上继代培养。大约15天左右，将愈伤组织接种到分化培养基上。待绿芽长到
2-3cm时，转到生根培养基培养。

[0043] 5)炼苗。打开瓶口，在培养室炼苗2-3天，转到自然条件下炼苗2-3天。

[0044] 6)移栽。洗去小苗表面的培养基，移栽到小盆里，成活后移栽到大田。

[0045] 2结果与分析

[0046] 2.1萝卜×苤蓝杂交亲和性表现

[0047] 表1 萝卜×苤蓝杂交若干天后的结荚数＊

[0048]

[0049] ＊结荚数为除去胚珠败育的荚剩下的正常生长荚的统计数。

[0050] 将苤蓝的花粉授予萝卜的柱头上后，观察杂种荚的生长发育情况。授粉后第二天，花瓣和雄蕊脱落；第三天荚有膨大迹象，第四天可见荚较明显膨大；第五天荚明显膨大；第六天可见子房有微凸起；第七天部分荚在膨大部分有出现黄绿色，其它荚继续膨大；第八天，可见大部分黄荚。初步分析，黄绿荚的出现可能就是胚胎败育的开始，黄荚为完全败育荚；第九天，黄荚开始焉，并且数量增多。表1的结果说明，萝卜和苤蓝杂交后说明萝卜和苤蓝杂交的不亲和发生在胚珠的形成过程中。

[0051] 萝卜与苤蓝共杂交1739朵花，第二天结荚数为1651，占授粉花的95％，第三天的结荚率为88％。说明授粉和受精过程是亲和的，而且亲和性很高。同时也观察到从第3天开始出现胚败育，随时间的延长，败育率逐渐提高，到第9天，已有75％的胚败育。第10天，胚胎败育率达84％。第12天，杂交荚全部死亡，败育率达100％。

[0052] 2.2萝卜×苤蓝杂交荚生长速率

[0053] 表2 萝卜×苤蓝杂交荚生长速率统计

[0054]

[0055] 授粉后测量30个荚的长度和横径，取平均值(表2)，观察杂交荚的生长。荚长在第2天至第5天生长快，增长率在17.2％至33.8％期间，随后生长非常缓慢；荚的横径的快速生长期是在授粉后第2天至第4天，随后生长非常缓慢。速度趋于缓慢。至第7天，大部分荚开始败育，甚至生长趋于停止。

[0056] 2.3萝卜×苤蓝杂种胚培养成苗率

[0057] 表3 萝卜×苤蓝杂种胚培养成苗率

[0058]

[0059] 本次胚胎抢救试验按照授粉后荚生长时间梯度设置4组，每组4个重复，每个重复取目的材料即胚珠30粒。自然条件下，杂交荚生长期为4天的胚珠经离体培养，成苗率为3.3％；生长期为5天的胚珠经离体培养，成苗率为5％；生长期为6天的胚珠经离体培养，成苗率为5％；生长期为7天的胚珠经离体培养，成苗率为1.6％。因此，以第5天和第6天胚珠离体培养的成苗率较高。

[0060] 3结论

[0061] (1)萝卜与苤蓝杂交的杂交荚荚长快速生长期是在授粉后的第2至第5天，而横径快速生长期是在授粉后第2至第4天。杂种胚适宜的抢救期是在授粉后第6天、第7天进