基于Livin的免疫刺激复合物及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN201110145897.3
文献号 : CN102210862B
文献日 : 2013-06-12
发明人 : 陈宏颉 , 王守森 , 郑兆聪 , 袁邦青 , 王如密 , 高进喜 , 赵琳
申请人 : 中国人民解放军南京军区福州总医院
摘要 :
本发明公开了一种基于Livin的免疫刺激复合物，由Livin和IgGFc段双基因共表达重组真核载体、CpG基序、皂苷QuilA、胆固醇和卵磷脂组成；其制备方法是在pH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液中加入终浓度为0.5mg/mL的Livin和IgGFc段双基因共表达重组真核载体、0.1mg/mL的CpG基序、1mg/mL的皂苷QuilA、0.1mg/mL的胆固醇和0.1mg/mL的卵磷脂，冰浴超声处理使溶液充分混匀并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为基于Livin基因的免疫刺激复合物；该免疫刺激复合物可以大幅度提高Livin的免疫原性，将其与树突状细胞共孵育，能够刺激树突状细胞成熟活化并发挥高效的抗原提呈能力，进而高效诱导CTL的细胞毒杀伤效应，有效抑制神经胶质瘤的生长，延长荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率，可用于制备抗神经胶质瘤的树突状细胞治疗性疫苗。
权利要求 :
1.基于Livin的免疫刺激复合物，其特征在于：由Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体、CpG基序、皂苷Quil A、胆固醇和卵磷脂组成；所述Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体是在真核表达载体pStar的内部核糖体进入位点的上游和下游分别插入Livin全长cDNA和IgG Fc段全长cDNA而构成；所述Livin全长cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述IgG Fc段全长cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体、CpG基序、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂的质量比为5∶1∶10∶1∶1。
2.权利要求1所述的基于Livin的免疫刺激复合物的制备方法，其特征在于：将Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体溶解于pH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液中，加入CpG基序、皂苷Quil A、胆固醇和卵磷脂，使每mL溶液中含有Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体0.5mg、CpG基序0.1mg、皂苷Quil A 1mg、胆固醇0.1mg和卵磷脂0.1mg，冰浴超声处理使溶液充分混匀并乳化，再用pH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液透析，所得微絮状物即为形成的基于Livin基因的免疫刺激复合物。
3.根据权利要求2所述的基于Livin的免疫刺激复合物的制备方法，其特征在于：所述Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体可采用以下方法构建：
a．Livin全长cDNA的克隆：提取神经胶质瘤细胞G422总RNA，逆转录得到cDNA，再以该cDNA为模板、采用核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的上、下游引物PCR扩增Livin全长cDNA，再将Livin全长cDNA克隆入pT-Easy载体，获得重组载体pT-Livin；
b．IgG Fc段全长cDNA的克隆：提取小鼠脾脏组织总RNA，逆转录得到cDNA，再以该cDNA为模板、采用核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的上、下游引物PCR扩增IgG Fc段全长cDNA，再将其克隆入pT-Easy载体，获得重组载体pT-Fc；
c．Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体的构建：自步骤a所得重组载体pT-Livin中用PstⅠ和EcoRⅠ双酶切出Livin全长cDNA，再与同样经PstⅠ和EcoRⅠ双酶切的真核表达载体pStar连接，获得重组载体pStar-Livin；自步骤b所得重组载体pT-Fc中用BamHⅠ和SalⅠ双酶切出IgG Fc段全长cDNA，再与同样经BamHⅠ和SalⅠ双酶切的重组载体pStar-Livin连接，即得Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体pStar-Livin-IRES-Fc。
4.权利要求1所述的基于Livin的免疫刺激复合物在制备抗神经胶质瘤的树突状细胞治疗性疫苗中的应用。
说明书 :
基于Livin的免疫刺激复合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，涉及一种免疫刺激复合物（immunostimulating complex, ISCOM），特别涉及一种基于Livin的免疫刺激复合物，还涉及该免疫刺激复合物的制备方法及其在制药领域的应用。
背景技术
[0002] 神经胶质瘤是人类中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，因其呈浸润性无限制增生、与正常组织无明显界限并富含血管，而具有高复发率和低治愈率，死亡率和致残率均很高。寻找新的有效治疗药物和方法以彻底攻克神经胶质瘤，一直是世界医学领域的主要课题之一。近年来，免疫学的不断发展为神经胶质瘤的治疗带来了新的手段和方法，免疫治疗已被视为继手术、放疗、化疗之后的第四种治疗模式。
[0003] CD8+ T细胞是机体免疫系统的主要组成部分，在针对病毒、细菌、真菌等病原性微生物以及恶性肿瘤等的免疫监视、免疫防御以及免疫治疗过程中发挥关键性作用。长期以来，中枢神经系统被认为是一个免疫特免区，然而中枢神经系统并非“免疫特赦器官”，其可以发生免疫反应，只是存在复杂的免疫反应条件。神经胶质瘤能够在机体内存在并逃逸免疫监视的主要原因在于：（1）神经胶质瘤细胞免疫原性弱；（2）神经胶质瘤细胞分泌大量的免疫抑制因子；（3）神经胶质瘤细胞存在主要组织相容性复合体（MHC）和共刺激分子B7的表达障碍。因此，诱导神经胶质瘤免疫的关键是将神经胶质瘤抗原有效呈递给效应细胞。
[0004] 树突状细胞（DC）是体内最强大的专职抗原递呈细胞，能够识别、捕获、加工、递呈抗原引发初始免疫反应，可分泌极化信号诱导Th0细胞向Th1细胞分化，还可通过“交叉激+活”途径激活CD8 T细胞。利用树突状细胞来改善抗原的免疫原性是治疗性疫苗设计的重要策略之一。
[0005] 细胞凋亡是由多因子介导的细胞主动死亡过程。肿瘤的形成和发展与细胞凋亡异常密切相关。Livin是近年来发现的凋亡抑制蛋白（IAPs）家族的重要成员。Livin基因位于人染色体20q13.3，全长4.6kb，包括7个外显子和6个内含子。Livin的N端包含一个串联的含有半胱氨酸/组氨酸的保守BIR（杆状病毒IAP重复序列）结构域，该结构域是参与抑制细胞凋亡作用的主要部位；C端包含一个环指结构域（RING结构域），该结构域不参与抑制细胞凋亡作用，但对Livin在细胞内的合理分布具有重要作用。研究显示，Livin能够抑制多种刺激剂包括病毒、感染、化学治疗药物、癌基因抑活药、生长因子撤除、TNF-a/Fas凋亡信号途径等触发的细胞凋亡，与神经胶质瘤的发生、发展及耐药密切相关。
[0006] 免疫球蛋白G（IgG）Fc段是抗体恒定区重要的结构域，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位。Fc段不仅能激活补体系统，而且能介导抗原抗体复合物通过Fc受体与抗原呈递细胞结合，并在受体的介导下促进抗原呈递细胞对外来抗原的吞噬，进而激发机体对特定抗原的细胞免疫反应。研究证明，在抗原呈递细胞中，通过Fc受体介导内吞的外来抗原，不仅可以大幅度促进MHCⅡ途径呈递抗原的活性而激活CD4+ T细胞，而且可以通过MHCⅠ交叉呈递抗原作用激活CD8+ T细胞。
[0007] 免疫刺激复合物是由抗原、皂苷Quil A、胆固醇及磷脂混合后自发形成的一种直径为30~40nm的球形笼状颗粒，具有免疫佐剂和抗原递呈的双重功能，可以大幅度提高抗原的免疫原性。文献报道，以免疫刺激复合物形式制得的DNA疫苗诱导的中和抗体水平和免疫保护力明显高于裸DNA，可能的机制是经免疫刺激复合物包裹的DNA能够免受体内核酸酶的降解，从而保证该DNA在机体内持续表达。另外，免疫刺激复合物的结构特性使其更易于定居在淋巴组织内，从而有利于抗原递呈细胞的吞噬。
[0008] 近年来研究还发现，普遍存在于细菌DNA中的含胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）基序的寡脱氧核苷酸（CpG ODN）具有特殊的免疫刺激效应，人工合成的含CpG基序的CpG ODN也具备相似的免疫调节特性，与蛋白类抗原联合应用可有效地诱导机体产生免疫应答，具有潜在的免疫佐剂效应。
[0009] 但迄今为止，国内外尚未见涉及Livin基因、IgG Fc段基因以及CpG基序的免疫刺激复合物的相关报道。
发明内容
[0010] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于Livin的免疫刺激复合物，可以大幅度提高Livin的免疫原性，促进抗原递呈细胞对其的吞噬，进而高效诱导Livin特异性的T细胞免疫应答。
[0011] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0012] 基于Livin的免疫刺激复合物，由Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体、CpG基序、皂苷Quil A、胆固醇和卵磷脂组成。
[0013] 进一步，所述Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体是在真核表达载体pStar的内部核糖体进入位点（IRES）的上游和下游分别插入Livin全长cDNA和IgG Fc段全长cDNA而构成。
[0014] 进一步，所述Livin全长cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述IgG Fc段全长cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0015] 进一步，所述Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体、CpG基序、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂的质量比为5∶1∶10∶1∶1。
[0016] 本发明的目的之二在于提供一种所述基于Livin的免疫刺激复合物的制备方法。
[0017] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0018] 所述基于Livin的免疫刺激复合物的制备方法，是将Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体溶解于pH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入CpG基序、皂苷Quil A、胆固醇和卵磷脂，使每mL溶液中含有Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体0.5mg、CpG基序0.1mg、皂苷Quil A 1mg、胆固醇0.1mg和卵磷脂0.1mg，冰浴超声处理使溶液充分混匀并乳化，再用pH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液透析，所得微絮状物即为形成的基于Livin基因的免疫刺激复合物。
[0019] 进一步，所述Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体可采用以下方法构建：
[0020] a．Livin全长cDNA的克隆：提取神经胶质瘤细胞G422总RNA，逆转录得到cDNA，再以该cDNA为模板、采用核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的上、下游引物PCR扩增Livin全长cDNA，再将Livin全长cDNA克隆入pT-Easy载体，获得重组载体pT-Livin；
[0021] b．IgG Fc段全长cDNA的克隆：提取小鼠脾脏组织总RNA，逆转录得到cDNA，再以该cDNA为模板、采用核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的上、下游引物PCR扩增IgG Fc段全长cDNA，再将其克隆入pT-Easy载体，获得重组载体pT-Fc；
[0022] c．Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体的构建：自步骤a所得重组载体pT-Livin中用PstⅠ和EcoRⅠ双酶切出Livin全长cDNA，再与同样经PstⅠ和EcoRⅠ双酶切的真核表达载体pStar连接，获得重组载体pStar-Livin；自步骤b所得重组载体pT-Fc中用BamHⅠ和SalⅠ双酶切出IgG Fc段全长cDNA，再与同样经BamHⅠ和SalⅠ双酶切的重组载体pStar-Livin连接，即得Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体pStar-Livin-IRES-Fc。
[0023] 本发明的目的之三在于提供所述基于Livin的免疫刺激复合物在制药领域的应用。
[0024] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0025] 所述基于Livin的免疫刺激复合物在制备抗神经胶质瘤的树突状细胞治疗性疫苗中的应用。
[0026] 本发明的有益效果在于：本发明的基于Livin的免疫刺激复合物可以大幅度提高Livin的免疫原性，将其与树突状细胞共孵育，能够刺激树突状细胞成熟活化并发挥高效的抗原提呈能力，进而高效诱导CTL的细胞毒杀伤效应，有效抑制神经胶质瘤的生长，延长荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率，可用于制备抗神经胶质瘤的树突状细胞治疗性疫苗，在神经胶质瘤治疗领域有着良好的开发应用前景。
附图说明
[0027] 图1为PCR扩增Livin全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0028] 图2为PCR扩增IgG Fc段全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0029] 图3为透射电镜检测基于Livin的免疫复合物的结构。
[0030] 图4为光镜检测经本发明免疫刺激复合物刺激活化的树突状细胞的结构。
[0031] 图5为酶联免疫斑点（ELISPOT）法检测经本发明免疫刺激复合物刺激的树突状细胞激发T细胞分泌干扰素-γ（IFN-γ）的能力。
[0032] 图6为51Cr释放法检测经本发明免疫刺激复合物刺激的树突状细胞激发T细胞对胶质瘤细胞的特异性杀伤效应。
[0033] 图7为给予经本发明免疫刺激复合物刺激的树突状细胞的小鼠的肿瘤生长曲线。
[0034] 图8为给予经本发明免疫刺激复合物刺激的树突状细胞的小鼠的平均生存率。
具体实施方式
[0035] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0036] 实施例1、基于Livin的免疫刺激复合物的制备
[0037] 一、Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体的构建
[0038] 1、Livin全长cDNA的克隆
[0039] 根据GenBank登录的Livin基因序列（登录号为NM_001163247），设计并合成如下引物：上游引物F1：5’-aatctgcagatgttctcacctgcagacttatt-3’（SEQ ID No.3），下划线部分为PstⅠ酶切位点；下游引物R1：5’-tacgaattcggcttcacttccgtgtatgac-3’（SEQ ID No.4），下划线部分为EcoRⅠ酶切位点。用RPMI 1640培养基常规培养神经胶质瘤细胞7
G422，调节细胞密度为2×10 个/mL，收集细胞，PBS洗涤3次，用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，按照试剂盒说明书操作。将所得细胞总RNA逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板，采用引物F1和R1 PCR扩增Livin全长cDNA，PCR条件为：94℃预变性3分钟；然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸7分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳（图1）鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与载体p-T Easy连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证，将正确插入了Livin全长cDNA序列（SEQ ID No.1）的阳性克隆质粒命名为pT-Livin。
G422，调节细胞密度为2×10 个/mL，收集细胞，PBS洗涤3次，用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，按照试剂盒说明书操作。将所得细胞总RNA逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板，采用引物F1和R1 PCR扩增Livin全长cDNA，PCR条件为：94℃预变性3分钟；然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸7分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳（图1）鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与载体p-T Easy连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证，将正确插入了Livin全长cDNA序列（SEQ ID No.1）的阳性克隆质粒命名为pT-Livin。
[0040] 2、IgG Fc段全长cDNA的克隆
[0041] 根据GenBank登录的IgG Fc段基因序列（登录号为NM_000566），设计并合成如下引物：上游引物F2：5’-gatcggatccatgtggttcttgacaactct-3’（SEQ ID No.5），下划线部分为BamH Ⅰ酶切位点；下游引物R2：5’-acgcgtcgacctacttggccccctg-3’（SEQ ID No.6），下划线部分为SalⅠ酶切位点。用Trizol试剂盒提取小鼠脾脏组织总RNA，逆转录为cDNA，再以该总cDNA为模板，采用引物F2和R2 PCR扩增IgG Fc段全长cDNA，PCR条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳（图2）鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与载体pT-Easy连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证，将正确插入了IgG Fc段全长cDNA序列（SEQ ID No.2）的阳性克隆质粒命名为pT-Fc。
[0042] 3、Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体的构建
[0043] 真核表达载体pStar具有一个内部核糖体进入位点（IRES），在IRES的上、下游分别存在一个多克隆位点（MCS），能够同时表达两个目的蛋白。将重组载体pT-Livin用PstⅠ和EcoRⅠ双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经PstⅠ和EcoRⅠ双酶切的真核载体pStar连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，PstⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为重组载体pStar-Livin。将重组载体pT-FC用BamHⅠ和SalⅠ双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经BamHⅠ和SalⅠ双酶切的重组载体pStar-Livin连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pStar-Livin-IRES-FC，即得Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体。
[0044] 二、基于Livin的免疫刺激复合物的制备
[0045] 将Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体pStar-Livin-IRES-Fc溶解于pH为7.4的PBS中，加入CpG基序、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂，使每mL溶液中含有Livin和IgG Fc段双基因共表达重组真核载体0.5mg、CpG基序0.1mg、皂苷Quil A 1mg、胆固醇0.1mg和卵磷脂0.1mg，冰浴超声处理使溶液充分混匀并乳化，再用pH为7.4的PBS透析，所得微絮状物即为形成的基于Livin的免疫刺激复合物。
[0046] 将新鲜制备的基于Livin的免疫刺激复合物滴于200目铜网上，吸附3分钟，吸水纸吸干，晾干30秒，以质量体积分数为1%的水溶性醋酸铀负染30秒，吸水纸吸干，晾干30秒，用80kV透射电镜观察，结果显示，基于Livin的免疫刺激复合物呈大小均一的近圆形颗粒，绝大多数颗粒的长径小于25nm（图3）。
[0047] 实施例2、树突状细胞疫苗的制备
[0048] 在无菌条件下提取小鼠股骨骨髓细胞，用含有质量分数为10%的胎牛血清、100U/mL的青霉素和100U/mL的链霉素的RPMI 1640培养基吹打混匀，3小时后取贴壁细胞，加入终浓度为500U/mL的白介素4（IL-4）和终浓度为1000U/mL的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），置温度为37℃、CO2气体体积分数为5%的培养箱中培养，每3天半量更换1次培养液同时加入IL-4和GM-CSF，诱导树突状细胞生成。将0.1mg基于Livin的免疫刺激6
复合物与1×10 个树突状细胞于37℃共孵育24小时，活化的树突状细胞（图4）即为树突状细胞疫苗。
复合物与1×10 个树突状细胞于37℃共孵育24小时，活化的树突状细胞（图4）即为树突状细胞疫苗。
[0049] 实施例3、树突状细胞疫苗的抗神经胶质瘤活性检测
[0050] 一、体外抗神经胶质瘤活性检测
[0051] 将30只6~8周龄雌性昆明小鼠随机分为3组：实验组、对照组和空白组，每组106
只。各组于每只小鼠背侧尾根部皮下注射树突状细胞1×10 个（实验组为实施例2制备的树突状细胞疫苗即经本发明免疫刺激复合物刺激的树突状细胞，对照组为经空白免疫刺激复合物刺激的树突状细胞，空白组为未刺激的树突状细胞），之后每间隔1周以同样方法加强免疫1次，共免疫3次。末次免疫后1周，断颈处死各组小鼠，无菌条件下取脾脏，用100目筛网碾磨，收集细胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，
6
用含有质量分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基调节细胞密度为1×10/mL，作为效应细胞。
只。各组于每只小鼠背侧尾根部皮下注射树突状细胞1×10 个（实验组为实施例2制备的树突状细胞疫苗即经本发明免疫刺激复合物刺激的树突状细胞，对照组为经空白免疫刺激复合物刺激的树突状细胞，空白组为未刺激的树突状细胞），之后每间隔1周以同样方法加强免疫1次，共免疫3次。末次免疫后1周，断颈处死各组小鼠，无菌条件下取脾脏，用100目筛网碾磨，收集细胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，
6
用含有质量分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基调节细胞密度为1×10/mL，作为效应细胞。
[0052] 1、ELISPOT法检测树突状细胞疫苗激发CTL分泌IFN-γ的能力
[0053] 采用ELISPOT检测试剂盒进行检测。在96孔培养板中，每孔加入体积分数为70%的乙醇100μL，室温放置10分钟，PBS洗涤，再加入IFN-γ捕获抗体（稀释度为1∶100）100μL，温度4℃孵育过夜，PBS洗涤，再加入质量分数为2%的脱脂奶粉溶液100μL，室温封闭2小时，PBS洗涤，再加入效应细胞100μL，温度37℃孵育48小时，PBST（即含有质量分数为0.1%的吐温20的PBS）洗涤，再加入生物素标记的抗IFN-γ抗体（稀释度为1∶100）
100μL，温度37℃孵育1.5小时，PBST洗涤，再加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶（稀释度为1∶5000）100μL，温度37℃孵育1小时，PBST洗涤，拍干培养板，再加入即用型BCIP/NBT底物反应液100μL，室温避光显色2~10分钟至斑点形成，用蒸馏水终止反应，干燥后检
5
测斑点数。各组斑点数以3个复孔的均值表示。结果见图5，实验组的斑点数为270个/10
5 5
细胞，明显高于其它2组（对照组为30个/10 细胞，空白组为10个/10 细胞），说明实施例
2制得的树突状疫苗即经本发明免疫刺激复合物刺激的树突状细胞能够有效激发CTL分泌IFN-γ。
100μL，温度37℃孵育1.5小时，PBST洗涤，再加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶（稀释度为1∶5000）100μL，温度37℃孵育1小时，PBST洗涤，拍干培养板，再加入即用型BCIP/NBT底物反应液100μL，室温避光显色2~10分钟至斑点形成，用蒸馏水终止反应，干燥后检
5
测斑点数。各组斑点数以3个复孔的均值表示。结果见图5，实验组的斑点数为270个/10
5 5
细胞，明显高于其它2组（对照组为30个/10 细胞，空白组为10个/10 细胞），说明实施例
2制得的树突状疫苗即经本发明免疫刺激复合物刺激的树突状细胞能够有效激发CTL分泌IFN-γ。
[0054] 2、51Cr释放法检测树突状细胞疫苗激发CTL对胶质瘤细胞的特异性杀伤效应[0055] 将神经胶质瘤细胞G422用含有质量分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基体外培养，收集细胞，离心洗涤2次后，用含有质量分数为10%的胎牛血清的RPMI1640培养6 51
基调节细胞密度为1×10/mL，取1mL置10mL血清瓶中，加入100μCi Na CrO4，温度37℃孵
51
育90分钟，充分洗涤细胞除去未结合的 Cr，再用含有质量分数为10%的胎牛血清的RPMI
5
1640培养基调整细胞密度为1×10/mL，作为靶细胞。在96孔U型板中，分别按效靶比（E/T）为100∶1、50∶1和25∶1加入效应细胞和靶细胞，每种效靶比设3个复孔，同时设最大释放组（用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞）和最小释放组（用含有质量分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基替代效应细胞）。将上述96孔板500r/min离心30秒，温度37℃孵育4小时，1000r/min离心10分钟，各孔取上清液100μL，用γ计数器测定每分钟放射活性（cpm值）并计算杀伤率：杀伤率(%)=[(实验组cpm均值-最小释放组cpm均值)/(最大释放组cpm均值-最小释放组cpm均值)]×100%，杀伤率大于15%判为特异性杀伤。结果见图6，实验组在各效靶比对神经胶质瘤细胞G422均有特异性杀伤作用，且随着效靶比增大，特异性杀伤作用逐渐增强，当E/T为 100∶1时，杀伤率为52%，而对照组和空白组对神经胶质瘤细胞G422无特异性杀伤作用，说明实施例2制得的树突状疫苗即经本发明免疫刺激复合物刺激的树突状细胞能够有效激发CTL产生对神经胶质瘤细胞G422的特异性杀伤效应。
基调节细胞密度为1×10/mL，取1mL置10mL血清瓶中，加入100μCi Na CrO4，温度37℃孵
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育90分钟，充分洗涤细胞除去未结合的 Cr，再用含有质量分数为10%的胎牛血清的RPMI
5
1640培养基调整细胞密度为1×10/mL，作为靶细胞。在96孔U型板中，分别按效靶比（E/T）为100∶1、50∶1和25∶1加入效应细胞和靶细胞，每种效靶比设3个复孔，同时设最大释放组（用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞）和最小释放组（用含有质量分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基替代效应细胞）。将上述96孔板500r/min离心30秒，温度37℃孵育4小时，1000r/min离心10分钟，各孔取上清液100μL，用γ计数器测定每分钟放射活性（cpm值）并计算杀伤率：杀伤率(%)=[(实验组cpm均值-最小释放组cpm均值)/(最大释放组cpm均值-最小释放组cpm均值)]×100%，杀伤率大于15%判为特异性杀伤。结果见图6，实验组在各效靶比对神经胶质瘤细胞G422均有特异性杀伤作用，且随着效靶比增大，特异性杀伤作用逐渐增强，当E/T为 100∶1时，杀伤率为52%，而对照组和空白组对神经胶质瘤细胞G422无特异性杀伤作用，说明实施例2制得的树突状疫苗即经本发明免疫刺激复合物刺激的树突状细胞能够有效激发CTL产生对神经胶质瘤细胞G422的特异性杀伤效应。
[0056] 二、体内抗神经胶质瘤活性检测
[0057] 将30只6~8周龄雌性昆明小鼠随机分为3组：实验组、对照组和空白组，每组106
只。各组于每只小鼠背侧尾根部皮下注射树突状细胞1×10 个（实验组为实施例2制备的树突状细胞疫苗即经本发明免疫刺激复合物刺激的树突状细胞，对照组为经空白免疫刺激复合物刺激的树突状细胞，空白组为未刺激的树突状细胞），之后每间隔1周以同样方法加
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强免疫1次，共免疫3次。在第一次免疫前3天，于各组小鼠背部皮下接种1×10 个神经胶质瘤细胞G422，观察60天内各组小鼠的生存率和肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。各组小
3
鼠的肿瘤生长曲线见图7，第30天时对照组小鼠肿瘤体积达到4000mm，而实验组小鼠肿瘤
3
生长缓慢，肿瘤体积仅为500mm。各组小鼠的平均生存率见图8，对照组小鼠于30天内全部死亡，而实验组小鼠60天的生存率为50%。说明实施例2制得的树突状疫苗即经本发明免疫刺激复合物刺激的树突状细胞能够有效抑制神经胶质瘤的生长，延长荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率。
只。各组于每只小鼠背侧尾根部皮下注射树突状细胞1×10 个（实验组为实施例2制备的树突状细胞疫苗即经本发明免疫刺激复合物刺激的树突状细胞，对照组为经空白免疫刺激复合物刺激的树突状细胞，空白组为未刺激的树突状细胞），之后每间隔1周以同样方法加
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强免疫1次，共免疫3次。在第一次免疫前3天，于各组小鼠背部皮下接种1×10 个神经胶质瘤细胞G422，观察60天内各组小鼠的生存率和肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。各组小
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鼠的肿瘤生长曲线见图7，第30天时对照组小鼠肿瘤体积达到4000mm，而实验组小鼠肿瘤
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生长缓慢，肿瘤体积仅为500mm。各组小鼠的平均生存率见图8，对照组小鼠于30天内全部死亡，而实验组小鼠60天的生存率为50%。说明实施例2制得的树突状疫苗即经本发明免疫刺激复合物刺激的树突状细胞能够有效抑制神经胶质瘤的生长，延长荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率。
[0058] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。