表达抑制小麦SBEIIa的发卡RNA的DNA分子及其应用

摘要

本发明公开了一种表达抑制小麦SBEIIa的发卡RNA的DNA分子及其应用。本发明提供一种RNA分子，其核苷酸序列为序列表中的序列4。还提供一种表达所述RNA的DNA分子，其核苷酸序列为序列表中的序列5。本发明的实验证明，利用RNAi技术得到插入小麦籽粒SBEIIa基因片段正向和反向的RNA干扰载体，转入小麦中，在不影响小麦营养生长和抗逆性的前提下提高小麦籽粒淀粉的直链淀粉含量，改良小麦淀粉的品质。

权利要求

1.一种RNA分子，其核苷酸序列为序列表中的序列4。

2.一种表达权利要求1所述RNA的DNA分子，其核苷酸序列为序列表中的序列5。

3.含有权利要求2所述DNA分子的重组菌。

4.含有权利要求2所述DNA分子的表达盒。

5.含有权利要求2所述DNA分子的重组表达载体。

6.权利要求1所述的RNA分子或权利要求2所述的DNA分子在改良小麦淀粉的品质中的应用；

所述小麦淀粉的品质通过小麦籽粒直链淀粉含量体现。

7.一种培育直链淀粉含量高的转基因植物的方法，是将目的植物中的SBEIIa基因功能丧失，得到转基因植物；

所述将目的植物中的SBEIIa基因功能丧失是通过将权利要求2所述DNA分子导入目的植物中实现的；

权利要求2所述DNA分子通过权利要求5所述的重组表达载体导入；

所述目的植物为小麦；

所述SBEIIa基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

说明书

表达抑制小麦SBEIIa的发卡RNA的DNA分子及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种表达抑制小麦SBEIIa的发卡RNA的DNA分子及其应用。

背景技术

[0002] 直链淀粉含量一般占普通小麦淀粉的25％左右，占小麦面粉的12～16％左右。直链淀粉特有的分子结构导致了其特有的理化性质、加工性能和应用价值：如1)由于直链淀粉成膜性好，是生产可食用食品包装材料、胶片等的重要原料；2)由于直链淀粉属于抗消化淀粉(resistant starch)，不易被肠道酶降解消化，食用后人体血糖水平不会有大幅度升高，用于制备对糖尿病人专用食品，解决病人饥饿感；对于肥胖症、胆结石病、肠机能失调和结肠癌等具有良好的保健预防作用；作为低热量的功能性食品，可促进矿物质吸收、降低胆固醇和控制体重；3)还是生产环保型可降解薄膜、工业酒精的必要材料，用途十分广泛。 [0003] 从(小麦、玉米、马铃薯等)普通淀粉中提取直链淀粉成本很高。因此，我国直链淀粉主要依靠进口。由于1)我国小麦的90％以上是用来制备传统面食品，小麦面粉的延展性等加工品质优于其他作物面粉，这样，高含量直链淀粉的小麦面粉，适于直接制作糖尿病人的各种面食品、保健食品，从而在享受食品原有美味时得到健康和营养；2)调整小麦品种结构，解决小麦产量相对过剩问题(指优质、专用小麦不足，而劣质、普通小麦过剩)；因此，培育高含量直链淀粉的小麦品种具有重要意义。但是国内目前尚无筛选到高直链淀粉的小麦变异材料，国外仅有日本报道筛选到淀粉合成酶(SGP-1)突变体(其直链淀粉含量也只达到37％左右)，限制了高直链淀粉小麦的品种培育。

[0004] 近几年来，农业生物技术的飞速发展为利用遗传工程的手段开展小麦淀粉的遗传改良开辟了广阔的前景。董云洲(1993)、Gerhard等(2000)和Rahman等(1994)、李加瑞等(2005)分别研究了遗传操纵改变马铃薯和小麦淀粉合成途径的影响，从而改变淀粉组成和结构。

[0005] 淀粉分支酶(SBE)水解长链非还原性末端α-1，4-糖苷键，切下一寡糖片段，再将该片段转移到淀粉糖链中一个葡萄糖残基上，生成α-1，6-糖苷键，形成支链淀粉的分支结构，分支可以在淀粉合成酶作用下继续延伸。Burton等(1995)将分离得到的豌豆SBEa和SBEb的cDNA，同玉米、水稻、马铃薯等的SBE序列比较后，将SBE分为两大类：SBEI和SBEII。SBEI作用的底物是直链淀粉，它能使较长的糖苷键转移到直链淀粉上；而SBEII作用的底物是支链淀粉，能使较短的糖苷键转移到支链淀粉上(Taketa 等，1993；Morell等，1997)。在小麦胚乳发育过程中，SBEII的表达高峰要早于SBEI，SBEII在花后5d开始表达，花后10d就能达到最高；而SBEI在花后10d开始表达，5d后表达才达到最高(Morell等，1997；Kent，2002)。Gao(1997)、Safford(1998)和Regina(2004)分别对玉米、马铃薯和小麦研究之后发现中，SBEI酶活降低并不会影响直链淀粉的含量。

[0006] 在玉米、水稻、小麦等作物中编码SBEIIa和SBEIIb的cDNA已被克隆、定位。在不同作物中，SbeIIa和SbeIIb相对表达水平在不同组织器官中有所不同。在单子叶植物中，SBEIIa表达于胚、叶和其他等营养组织中，SBEIIb则专一表达于胚和胚乳中(Fisher，Gao，1997)。在玉米，SbeIIa在营养组织中表达水平较高，在胚乳中有少量表达，SbeIIb只在胚乳中高水平表达(Gao，1997)。

发明内容

[0007] 本发明的一个目的是提供一种RNA分子。

[0008] 本发明提供的RNA分子，其核苷酸序列为序列表中的序列4。

[0009] 本发明的另一个目的是提供一种表达所述RNA的DNA分子。

[0010] 本发明提供的DNA分子，其核苷酸序列为序列表中的序列5。

[0011] 所述DNA分子，由A、B和C三个片段依次连接组成，所述A片段的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述C片段与所述A片段反向互补；所述B片段的核苷酸序列为序列表中的序列2。

[0012] 含有所述DNA分子的重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒也是本发明保护的范围。

[0013] 所述重组表达载体为将所述DNA分子插入pBAC47P载体的XmaI酶切位点得到的载体

[0014] 扩增所述DNA分子全长及其任意片段的引物对也是本发明保护的范围，其中所述DNA分子中的A片段的引物对中的一条引物为序列表中的序列4，另一条引物为序列表中的序列5。

[0015] 所述的RNA或所述DNA分子在改良小麦淀粉的品质中的应用也是本发明保护的范围；所述小麦淀粉的品质为通过小麦籽粒直链淀粉含量体现。

[0016] 本发明的第三个目的是提供一种培育高直链淀粉含量的转基因植物方法。 [0017] 本发明提供的方法，是将目的植物中的SBEIIa基因功能丧失，得到转基因植物，所述转基因植物的籽粒中的直链淀粉含量高于所述目的植物。

[0018] 所述将目的植物中的SBEIIa基因功能丧失是通过将权利要求2所述DNA分子导入目的植物中实现的。

[0019] 所述DNA分子通过所述的重组表达载体导入；

[0020] 所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物为小麦； [0021] 所述SBEIIa基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

[0022] 本发明的实验证明，利用RNAi技术得到插入小麦籽粒SbeIIa基因片段正向和反向的RNA干扰载体，转入小麦中，在不影响小麦营养生长和抗逆性的前提下提高小麦籽粒淀粉的直链淀粉含量，改良小麦淀粉的品质。因此，对扩大小麦淀粉在食品和非食品工业中的应用，具有重要的理论和实践意义。本研究将为小麦淀粉改良、品质育种提供理论依据、实验方法和育种材料，对我国小麦品质改良和优质品种选育具有重要意义。 附图说明

[0023] 图1为小麦灌浆中期籽粒总RNA

[0024] 图2为RT-PCR获得SbeIIa片段(约1kb)

[0025] 图3为表达载体pBAC47P+sbeIR结构示意图

[0026] 图4为T0代转基因植株Intron引物PCR检测结果

[0027] 图5为T0代转基因植株SBEIIa引物PCR检测结果

[0028] 图6为T0代转SbeIIa基因植株PCR-Southern分析

[0029] 图7为T1代转基因小麦半定量RT-PCR分析

[0030] 图8为T1代转基因小麦株系半定量RT-PCR分析结果

[0031] 图9为T5代转基因小麦株系面粉中直链淀粉的百分含量

具体实施方式

[0032] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 [0034] 实施例1、RNA干扰载体的获得

[0035] 1、SbeIIa基因片段获得

[0036] 通过比较小麦SBE编码基因mRNA同源性，在GenBank查找小麦SbeIIa基因mRNA序列(GenBank NO.：Y11282，AF338431)，使用Primer5.0软件设计引物为： [0037] SBEIIa-s2：5’-CGAGATGGTGGCTTGAAGAA-3’

[0038] SBEIIa-a2：5’-ATGATCAAGCCTGCTGAATCC-3’

[0039] 采用Trizol RNA提取试剂盒(天根公司)提取授粉15d的“农大152”小麦(Triticum aestivum L，该材料在文献“常成，张海萍，尤明山，李保云，李卫华，刘广田。抗坏血酸对小麦面片色泽影响的研究。中国粮油学报，2006，21(6)：27-30”中公开过，公众可从中国农业大学获得)籽粒的总RNA(图1，其中1、2、3、4均为提取的RNA)，用M-MLV反转录试剂盒(Promega公司)按说明书的两步法进行反转录-PCR(RT-PCR)，得到980bp左右的PCR产物(图2，其中1、2均为PCR产物)。回收PCR产物，使用 pGEM-T Easy Vector System(Promega公司)按照说明书将该PCR产物连接到pGEM-TEasy载体上，将连接产物热击转化感受态EcoliDH5α，得到转化子，提取转化子的质粒，该质粒为将序列表中的序列1插入pGEM-T Easy中得到的载体，序列表中的序列1与GenBank的Y11282mRNA同源性达到98.9％，说明该PCR产物为小麦的SbeIIa基因，将该质粒命名为pTE-sbe。 [0040] 2、SbeIIa片段反向插入FAD2Intron1的下游

[0041] 用内切酶EcoRI同时酶切上述获得的pTE-sbe和pBSK-FAD2Int1，琼脂糖凝胶电泳后分别回收前者约1kb片段和后者的大片段，用T4DNA连接试剂盒(TakaRa公司)将这两片段连接得到连接产物，转化感受态E.coliDH5α菌株，得到转化子，提取转化子的质粒，用引物SBEIIa-s2和AtFAD2Int1F(5’-AGCAGATCTATCGTGAGCGG-3’)进行PCR扩增，扩增出约1.0KB(含有反向的SbeIIa基因片段和FAD2Intron1下游约100bp片段)的片段的质粒为阳性质粒，将该质粒送去测序，结果为将序列表中的序列1(SbeIIa基因片段)插入pBSK-FAD2Int1的EcoRI酶切位点得到的载体，且为反向插入pBSK-FAD2Int1的FAD2Intron1(FAD2Intron1的核苷酸序列为序列表中的序列2，与GenBank NO：AJ271841.1序列反向互补)下游，将该质粒命名为pBSK-FAD2I1-sbe。

[0042] pBSK-FAD2Int1按照如下方法制备：根据GenBank中的AJ271841.1序列设计引物FADI-5：5’-GGTA AATTCAGATC -3’(5’依次添加KpnI、Xma I和EcoR I酶切位点，保护碱基AGATC)和FADI-3：5’- CGGCCGCAAGCTT -3’(5’依次添加Sac I、Xma I和Not I酶切位点，保护碱基
AAGCTT)，以拟南芥Columbia生态型(Arabidopsis thaliana(L.)，该材料在文献“Zhongfu Ni，Eun-Deok Kim，Misook Ha，Erika Lackey，Jianxin Liu，Yirong Zhang，Qixin Sun，Z.Jeffrey Chen.Altered circadian rhythms regulate growth vigour in hybrids and allopolyploids.Nature，457(7227)：327-331(15January2009)中公开过，公众可从中国农业大学获得)的基因组DNA为模板进行PCR反应，得到的PCR产物通过Kpn I和Sac I双酶切后克隆到德国Stratagene公司的 II XR Predigested Vector，得
到pBSK-FAD2Int1。

[0043] 3、SbeIIa片段正向插入FAD2 Intron1的上游

[0044] 用内切酶NotI同时酶切pTE-sbe和pBSK-FAD2I1-sbe，琼脂糖凝胶电泳后分别回收前者约1kb片段和后者的大片段，用T4DNA酶(TakaRa公司)将这两片段连接得到连接产物，转化感受态E.coli DH5α，得到转化子，提取质粒，用EcoRV酶切(由于该sbeIIa片段的0.735kb附近有一个EcoRV酶切位点，所以可用EcoRV酶切检测正义臂的插入方向：若正义臂与反义臂插入方向相同，则能得到2.1kb片段；若正义臂与反义臂插入方向相反，则能得到1.63kb片段)，其中，EcoRV酶切得到1.63kb片 段的质粒为将序列表中的序列
1(SbeIIa基因)插入pBSK-FAD2I1-sbe的NotI处得到的载体，且SbeIIa基因为正向插入pBSK-FAD2I1-sbe的FAD2Intron1上游，该质粒命名为pBSK-sbeIR。其中的正向插入的SbeIIa基因(序列1)、FAD2Intron1(序列2)和反向插入SbeIIa基因(序列1的反向互补链)组成了SbeIIa片段的发夹RNA的线性DNA(该DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列6，其表达的RNA的核苷酸序列为序列表中的序列6)。

[0045] 4、插入到1Dx5启动子及其增强子下游

[0046] 用内切酶XmaI同时酶切pBAC47P和pBSK-sbeIR(pBSK-sbeIR原来没有启动子)，琼脂糖凝胶电泳后分别回收前者3.5KB的大片段(含有1Dx5启动子及其增强子的片段的载体大片段，1Dx5启动子及其增强子得大小约为0.9KB，其核苷酸序列为序列3)和后者3.0kb(SbeIIa片段的发夹RNA的线性DNA)片段，用T4DNA连接酶将这两片段连接，连接产物转化感受态E.coli DH5α菌株，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，结果为将序列表中的序列1、序列2和序列1的反向互补序列组成的序列(SbeIIa片段的发夹RNA的线性DNA)插入pBAC47P的XmaI酶切位点得到的载体，将该载体命名为pBAC47P+sbeIR(图
3)，该载体含有由1Dx5启动子及其增强子(序列3)、正向插入的SbeIIa(序列1)、FAD2Intron1(序列2)和反向插入的SbeIIa(序列1的反向互补序列)组成的抑制发卡RNA的DNA分子，该DNA分子命名为sbeIR。

[0047] pBAC47P通过如下方法获得：以Promega公司的pSP72载体为出发载体，在HindIII和Sal I之间插入小麦高分子量谷蛋白亚基1Dx5的启动子及其含增强子序列(序列3)，在Kpn I和EcoR I之间插入NOS终止子(GenBank NO：AF485783.1)。pBAC47P质粒大小约3.5KB。NOS终止子来自于美国Clontech公司的pBI121载体。1Dx5启动子及其含增强子序列来源于植物表达载体pBPC30。植物表达载体pBPC30在文献“张晓东，梁荣奇，陈绪清，杨凤萍，张立全。优质HMW谷蛋白亚基转基因小麦的获得及其遗传稳定性和品质性状分析。科学通报，2003，48(5)：474-479”中公开过，公众可从中国农业大学获得。 [0048] 实施例2、转sbeIR小麦获得及功能鉴定

[0049] 一、转sbeIR小麦获得及鉴定

[0050] 受体：普通小麦品种保丰104(Triticum aestivum L)是中国农业科学院植物保护研究所白粉病组培育的天津审定的小麦推广品种，在文献“周益林，段霞瑜，盛宝钦，司权民。高产抗病冬小麦新品种——保丰104。麦类作物学报，2003，23(4)：147”中公开过，公众可从中国农业大学获得，以下简称野生型小麦。

[0051] 外植体：小麦幼胚诱导得到的愈伤组织；

[0052] 菌株：大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α；

[0053] 载体：由实施例1得到的pBAC47P+sbeIR，pBAC35SIH3(以Promega公司的pSP72载体为出发载体，在HindIII和Sal I之间插入CaMV 35S启动子(GenBank NO：AF485783.1)，在Kpn I和EcoR I之间插入NOS终止子(GenBank NO：AF485783.1)，在BamHI和Sac I酶切位点插入bar基因(GenBank NO：AF013602.1)。CaMV 35S启动子和NOS终止子来自于美国Clontech公司的pBI121载体。抗除草剂PPT的编码基因bar来源于植物表达载体pBPC30。

[0054] 培养基：

[0055] (a)幼胚愈伤诱导培养基MS+2，4-D 2mg/L pH5.8

[0056] (b)筛选培养基MS+Basta 0.2mL/L pH5.8

[0057] (c)分化培养基MS+IAA 1mg/L+反玉米素10mg/L+Basta 0.05mL/L pH5.8 [0058] (d)壮苗生根培养基MS+IAA 10mg/L+PBA 5mg/L，蔗糖80g/L，琼脂粉6g/L，pH5.8 [0059] 1、转sbeIR小麦获得

[0060] 选取开花后12～15d的野生型小麦幼穗剥取种子，消毒后剥取幼胚，盾片向上置于愈伤组织诱导培养基上，25±1℃暗培养3～5d诱导小麦愈伤组织，获得颜色鲜黄的愈伤组织。选择生长状态良好的愈伤组织块进行基因枪共转化(pBAC47P+sbeIR∶pBAC35SIH3＝3∶1(摩尔比，也即分子个数比))；转化后的愈伤25±1℃暗培养2～3d后移至筛选培养基上进行bar抗性筛选；筛选期间有抗性的愈伤组织块会长出新的愈伤，而无抗性的愈伤则变褐死掉；观察筛选1～2周之后，将生长状态良好、颜色鲜黄的的愈伤转移到分化培养基上使其分化，10d左右可见愈伤块上有分化的迹象，大约4～5周后可分化出幼苗，分单株转移到生根壮苗培养基中进行生根壮苗(5～7d可以观察到有根系长出，继续培养3～4周，直到根系生长繁茂、小麦绿苗足够壮实；炼苗2～3d后移栽至土壤中，获得166株T0代转sbeIR小麦苗。

[0061] 2、转sbeIR小麦的鉴定

[0062] 1)PCR鉴定

[0063] A、提取T0代转sbeIR小麦苗的基因组DNA，以FAD2Intron1片段上游引物IntronF和下游引物IntronR为引物，进行PCR扩增，引物：IntronF：5’-CCGCTCACGATAGATCTGCT-3’，IntronR：5’-GGTAACGATTCAAGAGAGTCTTC-3’，结果如图4所示，M：15000bp Marker；+：阳性对照pBAC47P+sbeIR；-：阴性对照(野生型小麦)；0：水对照；泳道1-11：为T0代转sbeIR小麦，若得到1.0KB片段则为阳性T0代转sbeIR小麦。

[0064] B、提取T0代转sbeIR小麦的基因组DNA，以SBEIIa-s2和SBEIIa-a2为引物进行扩增，结果如图5所示，其中，M：DL2000bp Marker；阳性对照pBAC47P+sbeIR；-：阴性对照(野生型小麦)；0：水对照；泳道1-6：为T0代转sbeIR小麦，若得到980bp 左右片段则为阳性T0代转sbeIR小麦。

[0065] 因此将经过上述FAD2 Intronl PCR(A)和SBEIIa PCR(B)鉴定均为阳性的记作PCR鉴定阳性T0代转sbeIR小麦。

[0066] 2)转基因植株的PCR-Southern blotting

[0067] 提取PCR鉴定阳性T0代转sbeIR小麦的基因组DNA，使用dNTP(其中放射性同位素标记dGTP)和上述A中的引物得到的1.0KB PCR产物为探针，结果如图6所示，+：阳性对照pBAC47P+sbeIR；0：水对照；泳道1-20：为PCR鉴定阳性T0代转sbeIR小麦，从图中看出，在1.0KB处出现杂交信号的为Southern鉴定阳性T0代转sbeIR小麦，阴性对照没有杂交带，进一步证明在部分转基因小麦植株的基因组中已经整合RNAi载体上的FAD2Intron1外源片段。

[0068] 将上述两种鉴定为阳性的转基因植株记作阳性T0代转sbeIR小麦，共得到24株阳性T0代转sbeIR小麦。

[0069] 从阳性T0代转sbeIR小麦收获种子，播种，获得T1代转sbeIR小麦，采用上述1)和2)的鉴定方法，得到30株阳性T1代转sbeIR小麦。

[0070] 3)转基因植株的RT-PCR鉴定

[0071] 提取30株阳性T1代转sbeIR小麦的RNA，反转录得到RNA，根据SbeIIa基因的cDNA序列设计基因特异性引物，进行RT-PCR，引物序列如下：

[0072] Sbe-2a-a2：5’-CGAGATGGTGGCTTGAAGAA-3’

[0073] Sbe-2a-s2：5’-ATGATCAAGCCTGCTGAATCC-3’

[0074] 同时，采用β-Actin为半定量PCR的内标基因，其引物序列如下：

[0075] β-Actin-F：5’-CAGCAACTGGGATGATATGG-3’

[0076] β-Actin-R：5’-ATTTCGCTTTCAGCAGTGGT-3’

[0077] 结果如图7所示，其中，泳道1-6：为阳性T1代转sbeIR小麦株系4-4-1、4-4-2、4-4-3、4-4-8、4-4-11、4-4-19；泳道7：野生型小麦，可以看出，阳性T1代转sbeIR小麦株系和野生型均得到1.0KB的产物，说明SbeIIa基因均有表达，但丰度不同。

[0078] 用AlphaImager 5500图像分析软件分析半定量电泳的胶图，分别提取软件分析结果中的内参β-Actin和目的基因SbeIIa的Area值，然后两者相比，得到转基因株系和阴性对照(野生型小麦保丰104)之间SbeIIa基因的相对表达量，实验重复三次，结果取平均值，结果如图8所示：4-4-1、4-4-2、4-4-3、4-4-8、4-4-11、4-4-19分别为阳性T1代转sbeIR小麦，CK为野生型小麦保丰104(将其SbeIIa基因表达量定为1.00)，可以看出， [0079] 4-4-1的SbeIIa基因相对表达量为0.97±0.105；

[0080] 4-4-2的SbeIIa基因相对表达量为1.02±0.298；

[0081] 4-4-3的SbeIIa基因相对表达量为1.11±0.581；

[0082] 4-4-8的SbeIIa基因相对表达量为0.83±0.347；

[0083] 4-4-11的SbeIIa基因相对表达量为0.47±0.313；

[0084] 4-4-19的SbeIIa基因相对表达量为0.77±0.383；

[0085] 从图中可看出，4-4-2、4-4-3的SbeIIa基因表达微高于对照非转基因(野生型小麦保丰104)，4-4-1的SbeIIa表达略微低于对照，4-4-8、4-4-11、4-4-19的SbeIIa基因表达明显低于对照非转基因植株，可以说明RNAi表达构件对转基因植株4-4-1、4-4-8、4-4-11、4-4-19的SbeIIa基因有不同程度的抑制作用。

[0086] 从阳性T1代转sbeIR小麦上收获种子，播种，继续传代，直到得到T5代转sbeIR小麦株系。采用上述方法进行鉴定，得到224个阳性T5代转sbeIR小麦株系。

[0087] 二、转sbeIR小麦的功能鉴定

[0088] 1、直链淀粉含量测定的原理

[0089] 淀粉与碘形成碘-淀粉复合物，并具有特殊的颜色反应。支链淀粉与碘形成棕红色复合物，支链淀粉与碘形成深蓝色复合物。在淀粉总量不变的条件下，将这两种淀粉分散液按不同比例混合，在一定波长和酸度下与碘作用，生成由紫红到深蓝一系列颜色，代表其不同直连淀粉与支链淀粉含量比例，根据吸光度与直链淀粉含量成线性关系，测定直链淀粉的含量。

[0090] 2、仪器、设备

[0091] 1)粉碎机(实验用旋风磨)。

[0092] 2)DPCZ-II型直链淀粉测定仪。

[0093] 3)分析天平：(感量为0.0001g)。

[0094] 4)玻璃仪器：100mL容量瓶，玻璃棒，吸管，移液管(10mL，5mL，1mL)。 [0095] 3、试剂配制

[0096] 1)氢氧化钠(GB629-77)分析纯，准确标定的1mol/L的NaOH溶液；

[0097] 称取4g氢氧化钠固体，溶入100mL的蒸馏水中，放入塑料瓶中。

[0098] 2)醋酸(GB676-78)分析纯，准确标定的1mol/L的HAC溶液；

[0099] 用纯醋酸6mL，用蒸馏水稀释至100mL。

[0100] 3)碘储备液及碘试剂：

[0101] 称2g碘(分析纯)和20g碘化钾(分析纯)用蒸馏水溶解并稀释至100mL，即为点储备液。取10mL碘储备液稀释至100mL，即为碘试剂。

[0102] 4)氢氧化钠分析纯，准确标定的0.09mol/L的NaOH溶液；

[0103] 取9mL 1mol/L的NaOH溶液，用蒸馏水稀释至100mL，即为0.09mol/L的NaOH溶液。

[0104] 5)直链淀粉标准溶液

[0105] 称取重量0.1000g纯度为95％的马铃薯直链淀粉(哈尔滨农业部谷物及制品质检中心，Potato Amylose-1.0)，放入100mL容量瓶中，加入1mL无水乙醇润湿样品，再加入9mL 1mol/L的氢氧化钠溶液于沸水浴中加热10min，迅速冷却后，用水定容至100mL。 [0106] 6)大米支链淀粉标准溶液

[0107] 称取重量0.1000g纯度为83.4％的大米支链淀粉(哈尔滨农业部谷物及制品质检中心，Rice Amylopectin-1.0)，放入100mL容量瓶中，加入1mL无水乙醇润湿样品，再加入9mL 1mol/L的氢氧化钠溶液于沸水浴中加热10min，迅速冷却后，用水定容至100mL。 [0108] 7)待测样品溶液

[0109] 待测样品用80目筛子筛过后，称取待测样品0.1000g，放入100mL容量瓶中，加入1mL无水乙醇湿润样品，再加入9mL 1mol/L的氢氧化钠溶液于沸水浴中加热10min，迅速冷却后，用水定容至100mL。

[0110] 4、测定步骤

[0111] 1)分别取如下编号的阳性T5代转sbeIR小麦株系的100粒种子，加入适量水湿润，在自封袋中封口存放大约24小时：B143、B187、B085、B108、B179、B186、B024、B114、B109、B134、B315、B088、B062、B189。以野生型小麦(CK)为对照。

[0112] 2)用旋风磨磨面，每个样品磨3次，过80目筛，将所得面粉装入新的自封袋中，备用，即得到粗淀粉样品。

[0113] 3)基线校准

[0114] 取一个100ml的容量瓶，加入0.09mol/L的NaOH溶液5ml放入100ml的容量瓶中作为空白，然后依次加入50mL蒸馏水、1mL 1mol/L的醋酸、1mL碘试剂，用蒸馏水定容至100mL后显色10min。作为DPCZ-2型直链淀粉测定仪的基线校准溶液。

[0115] 4)混合校准曲线绘制

[0116] 基线校准完毕，绘制混合校准曲线(标准工作曲线)

[0117] 取6个100mL容量瓶，分别加入1mg/mL马铃薯直链淀粉标准溶液0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mL，再依次加入大米支链淀粉标准溶液5、4.75、4.50、4.00、3.50、3.00mL，总量为5mL。另取1个100mL的容量瓶，加入0.09mol/L的NaOH溶液5mL做空白。然后于各瓶中依次加入约50mL水、1mL 1mol/L的醋酸及1mL碘试剂。用水定容后显色10min。 [0118] 用DPCZ-2型直链淀粉测定仪进行测量，由系统软件绘制并给出标准工作曲线。 [0119] 5)待测样品测量

[0120] (1)样品分散：称取0.1000g粗淀粉样品于100mL容量瓶中，加1mL无水乙醇，充分润湿样品，再加入9mL 1mol/L的氢氧化钠溶液于沸水浴中分散10min，迅速冷却，用水 定容。

[0121] (2)脱脂：取20mL分散液于50mL具备刻度试管中，加入7-10mL石油醚，间歇摇动10min，静止15min，分层后用连接在水泵上的吸管抽吸，吸去上部石油醚层，重复以上操作
2-3次。

[0122] (3)取待测样品溶液5mL，放入100mL容量瓶中。依次加入50mL蒸馏水、1mL 1mol/L的醋酸、1mL碘试剂。用蒸馏水定容至100mL后显色10min。用DPCZ-2型直链淀粉测定仪进行测定其直链淀粉含量。

[0123] 结果如表1和图9所示，图9中，CK为野生型小麦“保丰104”，其余为编号为B143、B187、B085、B108、B179、B186、B024、B114、B109、B134、B315、B088、B062、B189、B024的阳性T5代转sbeIR小麦。

[0124] 表1转sbeIR株系面粉中直链淀粉的百分含量

[0125]

[0126] 表2显著性检测分析

[0127]

[0128] F0.05(14，28)＝2.31 F0.01(14，28)＝3.34

[0129] PLSD法，S＝sqrt(2MSe/r)＝sqrt(0.114869333)＝0.3389

[0130] PLSD0.05＝2.048×0.3389＝0.694

[0131] PLSD0.01＝2.763×0.3389＝0.936

[0132] 从上述结果可以看出，B109比野生型显著提高，B134、B315、B088、B062、B189这5个株系比野生型(对照)的直链淀粉含量极显著提高。说明该sbeIR构件可以提高小麦籽粒中直链淀粉的含量。