一种用于乙型肝炎病毒基因分型的检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种用于乙型肝炎病毒基因分型的检测试剂盒及检测方法，试剂盒包括用于PCR扩增乙型肝炎病毒基因S区和PreS2区的引物对、表面固定有分型检测探针和对照探针的固相检测阵列、包含DNA聚合酶和反应底物的固相载体上核酸扩增反应体系和显色试剂。本发明通过以基因芯片为基础，PCR反应技术为原理的高通量、高特异性、快速、且易于推广的检测方法，将检测探针固定在检测阵列上，与PCR扩增的待测基因片段进行杂交，当目的片段被固相载体上的探针识别后，能够进行核酸序列的合成延长，使得被生物素标记的扩增片段固定在检测阵列上而不被洗脱，进而显色显示，一次就可以检测出待检测乙肝病毒的基因型。

权利要求

1.一种用于乙型肝炎病毒基因分型的检测试剂盒，其特征在于，包括用于PCR扩增乙型肝炎病毒基因S区和PreS2区的引物对、表面固定有分型检测探针和对照探针的固相检测阵列、包含DNA聚合酶和反应底物的固相载体上核酸扩增反应体系和显色试剂；

所述的引物对的5`端增加生物素标记；

所述的分型检测探针包括针对A型、B型、C型、D型、E型、F型、G型和H型乙型肝炎病毒基因型的检测探针，其中针对检测突变多态性的位点设置在探针5`端5nt之后，并在检测探针5`端进行减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰；

所述的显色试剂包括含亲和素-碱性磷酸酶的亲和反应液和含NBT/BCIP的显色反应液；

针对A型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2；

针对B型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4；

针对C型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6；

针对D型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:8；

针对E型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:10；

针对F型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:12；

针对G型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14；

针对H型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:16；

所述的对照探针包括阴性对照探针和阳性对照探针，其所设计的序列均与待检测的序列无互补性，阳性对照探针的5`端还被生物素标记。

2.如权利要求1所述的用于乙型肝炎病毒基因分型的检测试剂盒，其特征在于，所述的进行减少空间位阻的序列延长修饰是在分型检测探针5`端进行polyT、polyC或polyT+polyC的延长修饰；

所述的固相检测阵列的载体为硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片，分型检测探针5`端的辅助固定修饰为在分型检测探针5`最末端添加氨基、巯基、羟基或醛基。

3.如权利要求1所述的用于乙型肝炎病毒基因分型的检测试剂盒，其特征在于，所述的亲和反应液组成为1mL ddH2O和2μl亲和素-碱性磷酸酶液；显色反应液组成为1mL显色缓冲液、6.5μlNBT和3.5μl BCIP。

4.一种基于权利要求1所述的检测试剂盒的乙型肝炎病毒基因分型的非疾病的诊断的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以包含待测乙型肝炎病毒基因组的DNA为模板，以引物对为扩增引物，进行多个循环的PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2）将PCR扩增产物进行变性处理后，置于固相载体上核酸扩增反应体系中，然后再加入固相检测阵列，进行固相核酸扩增反应；其反应程序为：A：在不低于探针Tm值5℃的温度下退火至少10s；B：72℃延伸至少10s；A-B循环数大于1；最后72℃延伸至少3min；

所述的固相检测阵列在使用前还在体积浓度为2%～5%的BSA中37℃封闭至少

15min；

3）固相核酸扩增完成后，取出固相检测阵列放入洗脱液中离心洗脱，去除非特异核酸的结合：取出固相检测阵列首先放入洗脱液A中，转速至少30rpm离心洗脱至少1min；

用亲和反应液覆盖固相检测阵列并进行孵育：然后将固相检测阵列覆盖亲和反应液后

37℃孵育至少10min后，再依次放入洗脱液A、洗脱液B中，转速至少30rpm离心洗脱至少

1min；

再次洗脱后用ddH2O冲洗，最后覆盖包含NBT和BCIP的显色反应液进行显色，直至看到显色斑点后用ddH2O终止反应；

所述的洗脱液A的组成为100mmol/L pH=7.5的Tris-Cl、300mmol/L NaCl和4mmol/L MgCl2；洗脱液B的组成为100mmol/L pH=9.5的Tris-Cl、300mmol/L NaCl和4mmol/L MgCl2；

4）显色斑点所对应的分型结果即为所检测的乙型肝炎病毒的基因型，根据显色斑点与分型检测探针所针对的基因型，判定乙型肝炎病毒的基因型。

5.如权利要求4所述的乙型肝炎病毒基因分型的非疾病的诊断的检测方法，其特征在于，所述的变性处理为热变性处理：95℃以上至少放置5min，再在0℃至少放置3min；

或者，所述的变性处理为碱变性处理：将质量浓度10%的NaOH溶液与PCR扩增产物按照1:10～20的体积比混合，放置至少3min。

说明书

一种用于乙型肝炎病毒基因分型的检测试剂盒及检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于医学检验领域，涉及乙型肝炎病毒基因的分型检测，特别涉及一种用于乙型肝炎病毒基因分型的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

[0002] 乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率高，我国的乙型肝炎肝炎病毒携带者和患者共计约9300万，其中1/3出现肝损害的临床表现。目前我国有乙肝患者3000万。被HBV感染后，能逐渐演变为更为严重的肝病，如肝硬化、肝癌等，由此导致的死亡人数每年达50万。

[0003] 近年来的研究表明由基因突变导致的不同的HBV基因型，呈地理区域性分布，且不同基因型致病性不同，基因型与乙型肝炎病情的进展、临床表现、治疗耐药、预后有密切的关系。然而目前缺乏有效而准确的检测方法来对HBV进行早期的检测与分型，这种技术上的缺失给HBV的早期治疗和术后检查带来了许多不便。

[0004] 目前的乙型肝炎分型方法有很多，主要是针对基因突变所引起的差别的检查。当前的分型方法包括全基因测序、表面抗原基因(S基因)序列分析、聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)基因分型、单克隆抗体酶联免疫吸附试验基因分型法、特异性引物-PCR法、PCR微板核酸杂交-ELISA法、线性探针分析(LiPA)基因分型法、实时定量PCR一解链曲线分析(Real-time PCR and melting curve analysis)。但是这些方法对于医疗系统而言，都存在着不同程度的难以普及性、成本昂贵以及周期长的问题。

[0005] 所以，在目前的医疗系统中，对乙型肝炎患者常规下仅作感染性检查，极少采用分型检测，对该病的早期诊断、预后检查以及个体化用药均甚为不利。

[0006] 基因芯片作为近年出现的兼具快速和通量高优点的检测工具，结合了测序原理，是通过在固相载体上固定具针对性的核酸探针或蛋白质，进而与检测组分杂交结合，后引入发光信号（如荧光、生物素、放射性同位素等）进行分析检测来分析样品。但目前核酸杂交芯片配备设备复杂、昂贵，加之同时存在假阴性、假阳性率，故核酸分子基因芯片的质量控制难以被掌握。

[0007] 固相PCR技术是利用PCR原理，在固相载体上如毛细管、硅胶片、磁珠、玻璃片上等固定修饰的特异性引物进行PCR反应，其特点是反应简单，准确性高。但就实际操作而言，对于引物修饰及固定需要较为复杂的化学处理，如在硅胶片或毛细管上不仅需要对载体表面处理，同时需要对探针或引物进行修饰，以及同固相载体的配套的PCR仪器并不能推广应用，这样不仅使得制作程序复杂，同时引起实验重复性降低，导致常规固相PCR只能在实验室环境下完成科研工作。

发明内容

[0008] 本发明解决的技术问题在于提供一种用于乙型肝炎病毒基因分型的检测试剂盒及检测方法，以基因芯片为基础进行通量检测，实现了高特异性且快速的对乙型肝炎病毒的基因分型和突变检测。

[0009] 本发明是通过以下技术方案来实现：

[0010] 一种用于乙型肝炎病毒基因分型的检测试剂盒，包括用于PCR扩增乙型肝炎病毒基因S区和PreS2区的引物对、表面固定有分型检测探针和对照探针的固相检测阵列、包含DNA聚合酶和反应底物的固相载体上核酸扩增反应体系和显色试剂；

[0011] 所述的引物对的5`端增加生物素标记；

[0012] 所述的分型检测探针包括针对一个或多个基因型乙型肝炎病毒的检测探针，其长度为15～25nt，其中针对检测突变多态性的位点设置在探针5`端5nt之后，并在检测探针5`端进行减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰；

[0013] 所述的显色试剂包括含亲和素-碱性磷酸酶的亲和反应液和含NBT/BCIP的显色反应液。

[0014] 所述的扩增引物所扩增的片段长度不超过1000bp；在检测探针上还加入PNA、LNA或硫基提高检测特异性的修饰。

[0015] 针对A型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2；

[0016] 针对B型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4；

[0017] 针对C型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6；

[0018] 针对D型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:8；

[0019] 针对E型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:10；

[0020] 针对F型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:12；

[0021] 针对G型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14；

[0022] 针对H型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:16。

[0023] 所述的对照探针包括阴性对照探针和阳性对照探针，其所设计的序列均与待检测的序列无互补性，阳性对照探针的5`端还被生物素标记。

[0024] 所述的进行减少空间位阻的序列延长修饰是在分型检测探针5`端进行polyT、polyC、polyT+polyC或spacer6～15C序列的延长修饰；

[0025] 所述的固相检测阵列的载体为硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片，分型检测探针5`端的辅助固定修饰为在分型检测探针5`最末端添加氨基、巯基、羟基或醛基。

[0026] 所述的亲和素反应液组成为1mL ddH2O和2μl亲和素-碱性磷酸酶液；显色反应液组成为1mL显色缓冲液、6.5μlNBT和3.5μl BCIP。

[0027] 一种基于上述试剂盒的乙型肝炎病毒基因分型的检测方法，包括以下步骤：

[0028] 1）以包含待测乙型肝炎病毒基因组的DNA为模板，以引物对为扩增引物，进行多个循环的PCR扩增，得到PCR扩增产物；

[0029] 2）将PCR扩增产物进行变性处理后，置于固相载体上核酸扩增反应体系中，然后再加入固相检测阵列，进行固相核酸扩增反应；其反应程序为：A：在不低于探针Tm值5℃的温度下退火至少10s；B：72℃延伸至少10s；A-B循环数至少大于1；最后72℃延伸至少3min；

[0030] 3）固相核酸扩增完成后，取出固相检测阵列放入洗脱液中离心洗脱，去除非特异核酸的结合，用亲和反应液覆盖固相检测阵列并进行孵育，再次洗脱后用ddH2O冲洗，最后覆盖包含NBT和BCIP的显色反应液进行显色，直至看到显色斑点后用ddH2O终止反应；

[0031] 6）显色斑点所对应的分型结果即为所检测的乙型肝炎病毒的基因型，根据显色斑点与分型检测探针所针对的基因型，判定乙型肝炎病毒的基因型。

[0032] 所述的固相检测阵列在使用前还在体积浓度为2%～5%的BSA中37℃封闭至少15min。

[0033] 所述的变性处理为热变性处理：95℃以上至少放置5min，再在0℃至少放置3min；

[0034] 或者，所述的变性处理为碱变性处理：将质量浓度10%的NaOH溶液与PCR扩增产物按照1:10～20的体积比混合，放置至少3min。

[0035] 所述的固相核酸扩增反应完成后，取出固相检测阵列首先放入洗脱液A中，转速至少30rpm离心洗脱至少1min；然后将固相检测阵列覆盖亲和反应液后37℃孵育至少10min后，再依次放入洗脱液A、洗脱液B中，转速至少30rpm离心洗脱至少1min；取出固相检测阵列用ddH2O冲洗，最后覆盖显色反应液进行显色，至看到显色斑点后终止反应；

[0036] 所述的洗脱液A的组成为100mmol/L pH=7.5的Tris-Cl、300mmol/L NaCl和4mmol/L MgCl2；洗脱液B的组成为100mmol/L pH=9.5的Tris-Cl、300mmol/L NaCl和
4mmol/L MgCl2。

[0037] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

[0038] 1、本发明提供的用于乙型肝炎病毒基因分型的检测，是基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测，将检测探针固定在固相检测阵列上，与PCR扩增的待测基因片段进行杂交，当扩增的片段被检测探针识别后，能够进行序列的延长（固相核酸扩增），使得被生物素标记的扩增片段固定在膜阵列上而不被洗脱，而不能被探针识别的序列，就不能进行序列的延长，不能通过检测探针被固定，进而被洗脱掉；这样通过设计多个检测探针呈矩阵式的分布，通过一次就可以检测出待检测基因位点的突变性质。

[0039] 本发明通过以基因芯片为基础、PCR反应技术为原理的高通量、高特异性、快速、并且易于推广的检测方法，通过在以硝酸纤维素膜为代表的固相介质上进行特异性探针引发的核酸扩增反应，结合反向斑点杂交技术，将携带生物素标记的靶序列与膜阵列上探针结合后，通过生物素-亲和素-碱性磷酸酶-BCIP/NBT反应，可以观察到明显蓝紫色斑点，从而进行肉眼判读。

[0040] 2、本发明提供的乙型肝炎病毒基因分型的检测，检测准确性高：包括通过特异性的探针设计、利用已经成熟PCR技术的退火温度以阻止非特异的结合、以及利用Taq酶5`-3`外切酶活性阻止错配之后的延伸，完全可以达到对核酸序列单碱基差异的良好分辨力，保障了检测的准确性；

[0041] 并且对实验室及仪器设备的要求不高：在普通实验室PCR仪上即可完成整体实验，无需特殊和昂贵设备；操作简单；主要操作以PCR技术为核心，常规操作，成本低廉，易于推广。

[0042] 3、本发明提供的乙型肝炎病毒基因分型的检测，针对乙型肝炎病毒基因S区和PreS2区进行，因为根据生物信息学分析比对此基因区在HBV基因组内具有最高的保守性，故选择了8个HBV基因型的型内保守序列作为待测目的片段。另外为了保证检测的准确性，每个基因型设计了2个探针。其检测结果可靠、精确；而且解决了现有方法的检测速度慢、分辨率不高、配套仪器昂贵、检测过程复杂等技术问题，可以显著的改善现有只对乙型肝炎患者做感染性检查而很少考虑到分型检测的现状。

[0043] 4、本发明提供的乙型肝炎病毒基因分型的检测，所提供的分型检测探针能够灵活组合，以适应不同的检测人群和检测目的，比如将A、B、C、D和E、F、G、H八个基因型设计为2个分别的芯片阵列，有利于临床检验的灵活应用。因为中国本土发现的HBV基因型以A、B、C、D占绝大多数，E、F、G、H基因型多为国外输入。

附图说明

[0044] 图1为扩增片段与固定在固相载体上的分型检测探针结合、延伸、显色的程序示意图；其中①为硝酸纤维素膜，②为5`端延长修饰的C10链，③为分型检测探针，④为扩增片段靶序列互补区，⑤为Taq酶，⑥为生物素标记，⑦为亲和素-碱性磷酸酶，⑧为BCIP/NBT显色；

[0045] 图2为乙型肝炎病毒分型探针的特异性鉴定芯片阵列分布示意图；

[0046] 图3为乙型肝炎病毒分型检测用检测探针和对照探针的芯片阵列分布示意图；

[0047] 图4为乙型肝炎病毒C型分型探针的特异性鉴定显色结果图；

[0048] 图5为乙型肝炎病毒分型检测的显色结果图；图5a～图5d分别为检测出的HBV的A型、B型、C型、D型的显色结果图，图5e～图5h分别为检测出的HBV的E型、F型、G型、H型的显色结果图。

具体实施方式

[0049] 下面结合具体的乙型肝炎病毒分型检测中检测片段的扩增和检测探针的设计，检测探针与固相载体的固定，检测探针与扩增片段在固相载体上杂交、扩增，对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

[0050] 参见图1，基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，所提供的一种用于乙型肝炎病毒基因分型的检测试剂盒，包括用于PCR扩增乙型肝炎病毒基因S区和PreS2区的引物对、表面固定有分型检测探针和对照探针的固相检测阵列、包含DNA聚合酶和反应底物的固相载体上核酸扩增反应体系和显色试剂。

[0051] 利用ClustalX和Bioedit软件进行对已报道的乙肝病毒HBV8个型的47个序列进行多重比对，找出S区和PreS2区的型内保守序列作为待测目的片段，其扩增采用通常的PCR体外扩增，要求循环数25～40，扩增片段的长度建议不超过1000bp，而扩增引物对上亲和素的标记既可以在正向引物也可以在反向引物上，具有由待测的突变位点在扩增片段的位置关系来决定；检测探针的长度设计为15～25nt，检测探针上针对检测突变多态性的位点设置在5`端5nt之后。

[0052] 所述的分型检测探针包括针对一个或多个基因型乙型肝炎病毒的检测探针，可以是包含所有针对已知的A～G共8种基因型的分型检测探针，其中有下划线标注的位点为检测的基因型的特异性序列位点；

[0053] 针对A型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2；

[0054] 针对B型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4；

[0055] 针对C型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6；

[0056] 针对D型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:8；

[0057] 针对E型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:10；

[0058] 针对F型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:12；

[0059] 针对G型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14；

[0060] 针对H型乙型肝炎病毒的分型检测探针的序列为SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:16；

[0061] 并且在其5`端添加polyT（10）+polyC（10）的修饰。

[0062] 在所提供的分型检测探针中，每个基因型的两种检测探针可以单独使用，也可以将两种探针混合后固定在同一个分布位点上。

[0063] 考虑到HBV基因型呈地理区域性分布，具体基因型的选择可以根据所针对的检测人群，进行适当的筛选；比如我国感染E、F、G、H型HBV的患者极端稀少，可以直接进行分布有A、B、C、D四型检测的常用探针阵列进行首次检测，在需要时，进行分布有E、F、G、H四型检测的检测探针进行再次检测；也可以将A～H共8种的分型检测探针集合分布在一个阵列上进行一次检测。

[0064] 对照探针包括阴性对照探针和阳性对照探针，阴性对照探针和阳性对照探针的序列设计可以相同或不相同，原则是其序列不能与扩增片段有交叉互补性。阳性对照探针的5`端被生物素标记，能够被显色，用以监测显色系统是否正常；阴性对照探针用以监测杂交和固相核酸扩增的特异性。

[0065] 具体的对照探针的序列可以设计为：

[0066] 阳性对照序列Biotin-acagcactaa ggcaagctat tctg；

[0067] 阴性对照序列acagcactaa ggcaagctat tctg。

[0068] 分型检测探针5`端的修饰包括：减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰；其中减少空间位阻的序列延长修饰是出于减少核酸扩增错配和扩增后的序列与固相载体的附着、显色的考虑，包括polyT、polyC、polyT+polyC或spacer6～15C等多种序列的延长修饰。

[0069] 5`端的辅助固定修饰一般与固相载体结合考虑，固相载体可以为硝酸纤维素膜、尼龙膜或者载玻片，通过在检测探针的5`端添加氨基、巯基、羟基或醛基的辅助固定修饰与其固定，为了检测探针更好的固定和将来的显色效果，固相载体可以进行多种表面修饰。

[0070] 比如，以硝酸纤维素膜为固相载体，通过在SSC溶液中浸泡再烘干之后，可以使得显色斑点不扩散；通过检测探针5`端的羟基，经紫外光照后与硝酸纤维素膜固定。

[0071] 对于探针特异性的修饰可使用PNA、LNA、巯基等方法，增加探针的Tm值或通过聚合酶空间构象的改变提高探针结合并延伸的特异性。

[0072] 固相核酸扩增即检测探针与目的基因片段在固相载体上杂交、扩增，是探针特异性识别的核心，其中，扩增体系采用常规的PCR反应液，其独特之处就在于以包含检测位点的分型检测探针作为引物，能够与目的基因互补杂交并进行核酸扩增，且通过检测探针被固定在固相载体上不被洗脱；同时，为了保证杂交的特异性，退火温度一般设置在不低于探针Tm值的5℃范围内。

[0073] 洗脱过程是为了将未与固相载体结合的扩增片段洗脱掉，洗脱液可以为一般常用的缓冲液，结合离心洗脱效果比较好。

[0074] 显色通过亲和素-碱性磷酸酶液+NBT/BCIP的显示方式，其优势在于底色不明显，反应精确，结果容易判定，效果比较好；而且实现方便，亲和素-碱性磷酸酶液和NBT/BCIP显色液均可采用现有的试剂盒。

[0075] 下面结合乙肝病毒的基因分型检测过程，对试剂盒及其检测方法进行具体的说明：

[0076] 1）检测用扩增产物的制备

[0077] 设计扩增引物对，并对反向扩增引物的5`端增加生物素（Biotin）标记，所设计的引物对P具体为：

[0078] 正向引物：ctgctggtgg ctccagtt 18；

[0079] 反向引物：Biotin-gcactagtaa actgagcca 19；

[0080] 从乙肝患者血清中利用病毒提取试剂盒提取出乙肝病毒HBV的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以引物对P为引物进行30个循环的PCR扩增，能够获得长度为630bp的扩增片段。

[0081] 2）检测探针的设计与合成

[0082] 设计并人工合成了乙肝病毒HBV的A～G八种分型检测探针，每型2个探针，探针Tm值设计为59±1℃，探针长度为16～24nt，同时在探针序列5`端进行加上polyT（T10）、polyC（C10）的序列延长修饰，进行减少空间位阻的延长修饰是为了利于靶序列与固定在基膜上的探针进行结合，具体的检测探针序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:16所示，可以选择每种基因型针对的探针的一种，也可以是两种混合，点样时分布在一起；

[0083] 探针上检测多态性的位点设置均在探针5`端5nt之后。

[0084] 3）检测探针在检测阵列上的固定

[0085] 将硝酸纤维素膜在2×SSC溶液（柠檬酸三钠15mM，氯化钠150mM，pH7.0）中浸泡30min后取出，在37℃孵箱内烘干2小时，再将分型检测探针和对照探针用点膜仪喷涂至膜上（1滴500nl，间隔1mm，呈矩阵分布），裁减至4mm×6mm大小，将点完探针的硝酸纤维素膜放入80℃烘箱烘干30分钟，254nm波长紫外光照6分钟，通过紫外光照将探针与硝酸纤维素膜固定连接，得到固定有检测探针和对照探针的固相检测阵列。在干燥条件下，固相检测阵列可长期储备待用，使用前将该膜浸入2%BSA液37℃封闭15min。

[0086] 为了检测分型检测探针对不同基因型的特异性检测、显示，设计如下两种阵列分布：

[0087] 为了检测分型探针鉴定的特异性，具体以B、C型探针作为检测示意，其探针分布如图2所示，其中①为B型探针的两种探针（B1和B2）的等比例混合物，②为阳性对照探针，③～④分别为C型的探针一和探针二（C1、C2）；

[0088] 为了检测每种分型探针鉴定的特异性、准确性，设计如图3所示的探针分布：其中①、②为对照探针，③～⑥分别为分型检测探针；而且以中国地区常见的基因型做了阵列分布的区分：阵列一的③～⑥分别为针对HBV的A型、B型、C型、D型的检测探针；阵列二的③～⑥分别为针对HBV的E型、F型、G型、H型的检测探针；每个位点均包含同型两个探针的等比例混合物。

[0089] 4）固相核酸扩增反应

[0090] 首先对第一步获得的基因扩增产物进行序号标记，然后对扩增产物进行热变性处理：95℃水浴5min，然后冰上放置3min；再将变性后的扩增产物10μl、PCR反应液（欣百诺公司，TagMixMaster）20μl、ddH2O 10μl放入干净的PCR反应管中混匀，将制备好的检测阵列放入，固相检测阵列的膜背面靠管壁，进行固相核酸扩增反应；设计反应程序：A：57℃退火30s；B：72℃延伸30s；A-B循环数为10；最后72℃延伸3min。

[0091] 其中分型探针的特异性鉴定是以扩增C型乙型肝炎病毒的基因组的扩增产物作为检测对象；

[0092] 阵列一检测的是分别包含A～D型乙型肝炎病毒的一种的基因组的扩增产物作为检测对象；

[0093] 阵列二检测的是分别包含F～H型乙型肝炎病毒的一种的基因组的扩增产物作为检测对象。

[0094] 5）洗脱与显色

[0095] 固相PCR反应完成后，取出检测阵列进行洗脱，将未与检测阵列固定的片段洗脱掉，全部洗脱过程均在37℃条件下完成，具体为：

[0096] 将检测阵列取出，放入洗脱液A（100mmol/L pH=7.5的Tris-Cl、300mmol/L NaCl和4mmol/L MgCl2）中离心洗脱（转速为30rpm，洗脱1min），取出检测阵列后，用碱性磷酸酯酶标记的亲和反应液（1mL ddH2O和2μl亲和素-碱性磷酸酶液，购自碧云天公司，碱性磷酸酯酶标记为Streptavidin）覆盖后，37℃条件下孵育10min；孵育完成后将检测阵列放入干净的洗脱液A进行洗脱（转速30rpm，洗脱1min），取出后再放入洗脱液B（100mmol/LpH=9.5的Tris-Cl、300mmol/L NaCl和4mmol/L MgCl2）中，再离心洗脱（转速30rpm，洗脱1min）；取出检测阵列，用清水对膜块表面冲洗，并利用吸水纸去除膜块上的液体，将膜块覆盖显色反应液（1mL显色缓冲液、6.5μlNBT和3.5μl BCIP，购自碧云天公司，BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒），30秒后肉眼可看到斑点后，即用清水中止反应。

[0097] 6）基因型分析

[0098] 乙型肝炎病毒C型分型探针的特异性鉴定显色结果图如图4所示，其中阳性对照探针②正常显色，而包含B型探针B1和探针B2的①没有显色，包含C型探针C1和探针C2的③、④均特异性的显示，这表明分型检测探针的特异性，每种基因型的探针均针对其检测的基因型特异性的显色，其他的检测探针无交叉反应：C型的两个探针位点均特异性的显色，而B型探针并无显色。并且对A、B、D的探针进行了类似图2设计的探针分布的特异性鉴定，且均显示特异性非常好。

[0099] 阵列一的检测结果如图5a～图5d所示，分别为检测出的HBV的A型、B型、C型、D型的显色结果图，其中①为阳性对照，②为阴性对照，可以看到被生物素标记的阳性对照均正常显色，说明显色系统工作正常；阴性对照不显色，说明固相扩增的特异性好，没有非特异性杂交和核酸扩增；图5a～图5d中只有③、④、⑤、⑥位点固定的检测探针均分别与HBV病毒靶序列特异结合并显色，阵列当中只有一种探针针对待测的某种型乙肝病毒显色，进行结果指示，膜阵列中其他探针并无显色；这表明这四种基因型的探针能够特异性的识别出待测乙肝基因组的基因型，而且其结果准确可靠，彼此之间无杂交染色。

[0100] 而阵列二的检测结果如图5e～图5h所示，分别为检测出的HBV的E型、F型、G型、H型的显色结果图，其中①为阴性对照，②为阳性对照，可以看到被生物素标记的阳性对照均正常显色，说明显色系统工作正常；阴性对照不显色，说明固相扩增的特异性好，没有非特异性杂交和核酸扩增；图5a～图5d中只有③、④、⑤、⑥位点固定的检测探针均分别与HBV病毒靶序列特异结合并显色，阵列当中只有一种探针针对待测的某种型乙肝病毒显色，进行结果指示，膜阵列中其他探针并无显色；这表明这四种基因型的探针能够特异性的识别出待测乙肝基因组的基因型，而且其结果准确可靠，彼此之间无杂交染色。

[0101] 结合以上阵列的检测结果，本发明所提供的分型检测探针被固定形成阵列分布的检测阵列后，每种检测探针均能针对待测的某种型乙肝病毒显色，进行结果指示，其显色明显、结果准确可靠。

[0102] 注：对于中国人群感染HBV极为稀少的基因型，尚未在患者提取的标本当中获得病毒株，为了验证探针的检测效果，在阵列检测中使用了人工合成DNA模板。

[0103] 准确性和重复性考证：

[0104] 对100例中国乙型肝炎病毒患者的血清中HBV扩增产物进行测序，用NCBI的genotyping tool进行分型，其中A型为人工合成序列1例，B型25例，C型67例，D型7例，再同上述方法检测结果进行比对，该方法检测准确率为99%。其中1例误检因在设计探针的位点旁边碱基产生突变引起。