一种发光菌毒性测定方法

摘要

本发明属于环境污染检测技术领域，公开了一种发光菌毒性的测定方法，该方法包括以下步骤：1)菌种活化：将明亮发光杆菌的冻干粉溶解，接种到斜面上传代3次后可用；2)菌种的培养：将传代好的菌种用接种环接种到液体培养基，20℃，180rpm培养12h；3)菌液的平衡：移取适量菌液到20mL3％ NaCl溶液中，控制光值测定范围在50-500万之间，20℃条件下搅拌40min；4)加样及发光强度检测：将搅拌了40min的菌液用连续进样器加入200μL到800μL的3％ NaCl空白及800μL浓度梯度的3％ NaCl污染液，加样后立即在旋涡混匀器上混匀2min，20℃条件下，静置15min后将样品管置入荧光检测器中测定发光强度；5)双交错对照法计算样品对发光强度的抑制率。本发明方法具有便捷、精度高的特点。

权利要求

1.一种发光菌毒性的测定方法，其特征在于：该方法包括以下步骤，

1）菌种活化：将明亮发光杆菌的冻干粉溶解，接种到斜面上传代3次后可用；

2）菌种的培养：将传代好的菌种用接种环接种到液体培养基，20℃，180rpm培养12h；

3）菌液的平衡：移取适量菌液到20mL3%NaCl溶液中，控制光值测定范围在50-500万之间，20℃条件下搅拌40min；

4）加样及发光强度检测：将搅拌了40min的菌液用连续进样器加入200μL到800μL的3%NaCl空白及800μL浓度梯度的3%NaCl污染液，加样后立即在旋涡混匀器上混匀

2min，20℃条件下，静置15min后将样品管置入荧光检测器中测定发光强度；

5）采用双交错对照法计算样品对发光强度的抑制率：

抑制率（%）=100%×（对照抑制率－样品抑制率）/对照抑制率；

其中，所述的对照抑制率指的是样品前后的空白平均抑制率，即双交错对照法，其具体操作为在不加污染物，添加相应体积的3%NaCl的空白组后的每个样品组同时设置一组空白对照组。

2.根据权利要求1所述的发光菌毒性的测定方法，其特征在于：所述的光值测定范围为100-300万。

3.根据权利要求1所述的发光菌毒性的测定方法，其特征在于：所述的液体培养基成分为：胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，甘油0.3%，KH2PO40.1%，Na2HPO40.5%，NaCl3%，pH7.0。

说明书

一种发光菌毒性测定方法

技术领域

[0001] 本发明属于环境污染检测技术领域，具体涉及一种发光菌毒性的测定方法。

背景技术

[0002] 随着人们对生活质量和环境质量要求的提高，对环境中的污染物也日益关注。由于环境中污染物大都具有低浓度、复合型等特点。因此，以往仪器的灵敏度不高导致很多低浓度的污染物被忽略，而其中包含某些毒性较强的污染物。以POPs（Persistent Organic Pollutants）为例，它是一类具有长期残留性、生物累积性、半挥发性和高毒性的有机污染物。然而它具有低水溶性、高脂溶性的特点，如监测仪器灵敏度不高则该类物质在水体中不易被检测。因此，为了适应新时期人们对环境质量的要求，需要建立更灵敏、准确的检测方法对污染物实施监测，为制定更合理的环境保护政策提供科学依据。

[0003] 目前已有许多其他生物学方法应用于环境毒性的检测，如浮游生物、鱼类、藻类等。但这些方法均存在着周期长，操作繁琐等缺陷。发光菌属于革兰氏阴性菌，一定条件下其发光强度是恒定的。与外界污染物接触后，发光强度与污染物毒性大小呈线 性 关 系(Curtis C,Lima A,Lozano S,Veith G(1982)Evaluation of a bacterial bioluminescence bioassay as a method for predicting acute toxicity of organic chemicals to fish.Aquatics Toxicology and Hazard Assessment:170.)。因此，1981年，Beckman仪器公司推出了利用海水光细菌测定污染物毒性的测试方法TM
(Bulich&Isenberg,1981)，并命名为Microtox (Dutka B,Kwan K(1981)Comparison of three microbial toxicity screening tests with the Microtox test.Bulletin of environmental contamination and toxicology27(1):753-757.)。该方法通过将费氏弧菌(Vibrio fischeri)的冻干粉制成菌悬液，与含有2%NaCl的样品混合，15min后测定发光值。1995年，以Micortox方法为基础，南京土壤所负责起草的《发光细菌法水质急性毒性检测的国家标准》（GB/T15441-1995）被广泛地应用于水体等环境中污染物的毒性监测和评价。但是，该方法存在以下两个问题：

[0004] 1）实验结果重现性差检测方法存在细胞发光强度本底差异大、检测期间发光变化幅度宽等缺陷，导致实验结果的重现性大约在±13%～±26%之间（Curtis,1982）。Dukta B J等（Dukta B J,K wan K K,1981）采用MICROTOX仪测定五氯酚钠的毒性，也发现明亮发光杆菌毒性实验再现性欠佳的现象。而毒性测定数据是环境中污染物毒性的判定指标，具有重要的指示作用。

[0005] 2）检测限太窄现阶段，国内大部分科研机构及环境监测站点使用的监测及测定仪器为中科院南京土壤所开发的DXY-2型荧光检测器，该仪器研制于上世纪90年代，灵敏度欠佳，对于低浓度的污染物对发光菌的毒性影响检测能力有限。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种发光菌毒性的测定方法，该方法采用免疫荧光检测技术，创造性建立“双交错对照法”对发光菌毒性进行测定。

[0007] 本发明的技术方案如下：

[0008] 本发明提供了一种发光菌毒性的测定方法，该方法包括以下步骤：

[0009] 1）菌种活化：将明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）的冻干粉溶解，接种到斜面上传代3次后可用；

[0010] 2）菌种的培养：将传代好的菌种用接种环接种到液体培养基，20℃，180rpm培养12h；

[0011] 3）菌液的平衡：移取200μL菌液到20mL3%NaCl溶液中，控制光值测定范围在50-500万之间，20℃条件下搅拌40min；

[0012] 4）加样及发光强度检测将搅拌了40min的菌液用连续进样器加入200μL到800μL的3%NaCl空白及800μL浓度梯度的3%NaCl污染液，加样后立即在旋涡混匀器上混匀2min，20℃条件下，静置15min后将样品管置入荧光检测器中测定发光强度；

[0013] 5）采用双交错对照法计算样品对发光强度的抑制率

[0014] 抑制率（%）=100%×（对照抑制率－样品抑制率）/对照抑制率。

[0015] 所述的对照抑制率指的是样品前后的空白平均抑制率，即双交错对照法。

[0016] 所述的光值测定范围优选为100-300万。

[0017] 所述的液体培养基成分为：胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，甘油0.3%，KH2PO40.1%，Na2HPO40.5%，NaCl3%，pH7.0。

[0018] 操作原则：采取间隔设置空白的方法，避免由于菌体测定过程中发光强度的变化导致的测定误差。

[0019] 本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

[0020] 1、本发明方法测定的发光菌毒性结果数据稳定、重现性好；同时由于采用了最新的荧光检测仪器，检出限范围比原有技术更广。

[0021] 2、本发明方法可准确地测定水体中的有机化合物、农药、呼吸抑制剂等污染物的水质毒性，从而对生活用水及采矿、冶炼、印染等各类工业废水进行有效监测。

[0022] 3、本发明方法具有便捷、精度高的特点，因此，本发明方法可很好地应用于污染区域的环境生态风险评价。

[0023] 4、本发明方法同采用动物、植物毒性测定方法（周期长、费用高）相比，在建立和完善污染物毒性数据库方面，具有耗时短、费用低廉、灵敏度高的特点。

[0024] 5、本发明方法可简便、灵敏地对环境中污染物进行监测。

[0025] 6、本发明方法可对污染物进行有效筛选及生态毒理进行准确评价。

附图说明

[0026] 图1表示样品设置示意图。

[0027] 图2表示采用直线法对测定结果拟合得到EC501标准曲线。

[0028] 图3表示采用直线法对测定结果拟合得到EC502标准曲线。

[0029] 图4表示采用直线法对测定结果拟合得到EC503标准曲线。

具体实施方式

[0030] 以下结合附图所示实施例对本发明作进一步的说明。

[0031] 所用仪器：生化培养箱、摇床、旋涡振荡器、空调。

[0032] 所用菌种：明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）冻干粉，购自中科院南京土壤所。

[0033] 液体培养基配方：胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，甘油0.3%，KH2PO40.1%，Na2HPO40.5%，NaCl3%，pH7.0。

[0034] 实施步骤：

[0035] 1）取冷藏的发光菌冻干粉，置冰浴中，加入0.5ml冷的3%NaCl溶液，充分摇匀，复苏2min，使菌液具有微微绿光，无菌操作，将菌液迅速转入50ml培养液中，20℃恒温培养，每24h后转接一次斜面，将培养好的第三代斜面置4℃冰箱中备用。

[0036] 2）将传代好的菌种用接种环接种到液体培养基，20℃，180rpm培养12h。

[0037] 3）移取200μL菌液到20mL3%NaCl溶液中，控制光值大约300万，20℃条件下搅拌40min。

[0038] 4）将搅拌了40min的菌液用连续进样器加入200μL到800μL的3%NaCl（空白）及800μL浓度梯度的3%NaCl污染液。加样后立即在旋涡混匀器上混匀2min。20℃条件下，静置15min后将样品管置入荧光检测器中测定发光强度（默认参数）。

[0039] 5）双交错对照法：

[0040] 所谓双交错对照法，是针对在传统的发光菌毒性测定方法中，由于外界条件的改变对发光菌的荧光值影响偏大，导致发光菌毒性测定结果的可重现性差的缺陷而专门设计的一种方法。具体操作为：在空白组(即不加污染物，添加相应体积的3%NaCl)后的每个样品组必须同时设置一组空白对照组（图1为样品设置示意图。）。

[0041] 对于浓度

[0042] （式1）

[0043] 对于浓度

[0044] （式2）

[0045] 对于浓度

[0046] （式3）

[0047] 其它浓度以此类推，所以，对于浓度C1，

[0048] 通常用发光细菌光抑制50%的受试化合物浓度来表征其毒性效应（EC50），将计算的抑制率与受试化合物的浓度进行回归分析，根据所得回归方程可求出相应的EC值。

[0049] 实施例

[0050] 测定丙酮对发光菌的毒性

[0051] 由于丙酮具有挥发性，研究表明该物质的生物毒性数据稳定性不佳。采用本方法，用3%NaCl配置0.034、0.061、0.872、0.109、0.195、0.347mol/L的丙酮溶液按上述方法加入到测定体系，每个浓度梯度设3组平行，每组重复测定3次。

[0052] A）第一次试验结果及抑制率列于表1中。

[0053] 表1

[0054]试验组 发光值 抑制率（%） 平均抑制率
空白 3346754
0.034mol/L 3027646 9.374979
空白 3334946 7.704
0.034mol/L 3130054 6.033632
空白 3447466
0.061mol/L 2799357 18.9069
空白 3456591 18.306
0.061mol/L 2845577 17.70553
空白 3327127
0.872mol/L 2665007 22.01844
空白 3507840 22.245
0.872mol/L 2696191 22.47096
空白 3459006
0.109mol/L 2078887 39.45795
空白 3408574 39.374
0.109mol/L 2072061 39.29012

[0055]空白 3417534
0.195mol/L 942451 72.55997
空白 3451636 72.854
0.195mol/L 925949 73.14798
空白 3445044
0.347mol/L 304021 91.209
空白 3471601 90.982
0.347mol/L 323963 90.75594
空白 3537507

[0056] 采用直线法对测定结果拟合得到标准曲线，如图2所示。

[0057] 图2中，横坐标为丙酮浓度（mol/L）的负对数（-log C），纵坐标为双交错法计算的2 1
发光抑制率，R（相关系数）表明两者有很好的线性关系，经计算，丙酮EC50=0.1292mol/L。

[0058] B）第二次试验结果及抑制率列于表2中。

[0059] 表2

[0060]试验组 发光值 抑制率（%） 平均抑制率
空白 3203491
0.034mol/L 3042741 2.995365
空白 3069902 2.575317
0.034mol/L 3071191 2.15527
空白 3207781
0.061mol/L 2801318 12.06007
空白 3163200 9.483176
0.061mol/L 2911360 6.906278
空白 3091486
0.872mol/L 2225588 29.15656
空白 3191631 28.17715
0.872mol/L 2302355 27.19774
空白 3133324
0.109mol/L 1784127 43.29459
空白 3159293 42.17499
0.109mol/L 1857527 41.05539
空白 3143326
0.195mol/L 881938.2 72.31279
空白 3227401 73.11049
0.195mol/L 870614.2 73.9082
空白 3446068
0.347mol/L 350994.6 89.46816
空白 3219333 90.08334
0.347mol/L 301883.4 90.69852
空白 3271751

[0061] 对测定体系中丙酮实际浓度（即原始浓度×80%）取对数，利用直线法得到标准曲线后求解EC502，如图3所示。

[0062] 经计算，丙酮EC502=0.1306mol/L；

[0063] C）第三次试验结果及抑制率列于表3中。

[0064] 表3

[0065]试验组 发光值 抑制率（%） 平均抑制率
空白 3023736
0.034mol/L 2960320 3.928479
空白 3139006 4.626777
0.034mol/L 2959087 5.325076
空白 3112041
0.061mol/L 2593377 16.59813
空白 3106949 15.9077
0.061mol/L 2649111 15.21727
空白 3142227
0.872mol/L 2364086 23.473
空白 3036209 22.4928
0.872mol/L 2393759 21.5126
空白 3063519
0.109mol/L 1873450 39.57002
空白 3136880 37.49363
0.109mol/L 2029814 35.41724
空白 3149051
0.195mol/L 1008817 68.08814
空白 3173469 68.3487
0.195mol/L 1003177 68.60927
空白 3218081
0.347mol/L 331616 89.5206
空白 3110833 89.27762
0.347mol/L 344426 89.03465
空白 3171244

[0066] 对测定体系结果直线拟合，得到计算曲线如图4所示。

[0067] 经计算，丙酮EC503=0.1368mol/L；

[0068] 将上述丙酮EC50与文献值（董玉瑛,等.化工学报.2006,57(3):636-639），结果如表4所示。

[0069] 表4

[0070]

[0071] 由表4可知，采用本专利测定的结果与文献报道值差别非常小，其RSD仅为0.034；另外一方面，三组测定数据间其差异也非常小，其RSD仅为0.031；由此可知，本发明所建立的方法稳定、可靠，其可能原因1）本发明采用的检测仪器先进；2）双交错法试验设计与计算增加了实验的稳定性；因而，本发明在环境领域的科研、污染物监测、检疫等部门有较好的应用前景。

[0072] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。