一种制备玉米Ⅱ型胚性愈伤组织的方法

摘要

本发明公开了一种制备玉米II型胚性愈伤组织的方法。本发明的制备能产生II型胚性愈伤组织的玉米自交系的方法，包括如下步骤：将出发玉米自交系进行自交，获得F1代种子；取F1代种子的幼胚进行胚性愈伤组织诱导，得到胚性愈伤组织，挑取II型胚性愈伤组织；将所述II型胚性愈伤组织再生培养得到玉米植株，得到的玉米植株即为目的玉米自交系。本发明方法得到了具有二型愈伤表型、再生容易、再生植株农艺性状优良的玉米材料，为目前转基因的受体提供了新材料，打破了目前仅限于利用非纯系Hill的局限，缩短了利用转基因技术培育玉米新品种的时间。

权利要求

1.一种制备能产生Ⅱ型胚性愈伤组织的玉米自交系的方法，包括如下步骤：将出发玉米自交系进行自交，获得F1代种子；取F1代种子的幼胚进行胚性愈伤组织诱导，得到胚性愈伤组织，挑取Ⅱ型胚性愈伤组织；将所述Ⅱ型胚性愈伤组织再生培养得到玉米植株，得到的玉米植株即为目的玉米自交系；

所述将所述Ⅱ型胚性愈伤组织再生培养得到玉米植株的方法包括如下步骤：将所述Ⅱ型胚性愈伤组织接到胚状体诱导培养基上，进行胚状体诱导培养，得到胚状体；将所述胚状体接到分化培养基上，进行分化培养，得到玉米植株；

所述出发玉米自交系为高油自交系GY302；

所述胚性愈伤组织诱导培养基由N6培养基、2，4-D、肌醇、脯氨酸、蔗糖、水解酪蛋白和植物凝胶组成；2，4-D在所述诱导培养基中的浓度为2.0-2.5mg/L，肌醇在所述诱导培养基中的浓度为0.1-0.17g/L，脯氨酸在所述诱导培养基中的浓度为2.6-2.9g/L，蔗糖在所述诱导培养基中的浓度为30g/L，水解酪蛋白在所述诱导培养基中的浓度为0.12-0.15g/L；

所述胚状体诱导培养基由MS培养基、肌醇、蔗糖和植物凝胶组成，肌醇在所述胚状体诱导培养基中的浓度为0.1-0.17g/L，蔗糖在所述胚状体诱导培养基中的浓度为60g/L-65g/L；

所述分化培养基由MS培养基、肌醇、蔗糖、6-BA和植物凝胶组成；

肌醇在所述分化培养基中的浓度为0.1-0.17g/L，蔗糖在所述分化培养基中的浓度为

30g/L-35g/L，6-BA在所述分化培养基中的浓度为0mg/L-0.5mg/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述胚性愈伤组织诱导的方法包括如下步骤：将所述F1代种子的幼胚接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，进行胚性愈伤组织诱导培养；

所述胚性愈伤组织诱导培养的条件为于28℃的黑暗环境中培养2周。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述分化培养的条件为于28℃、光强

2000lx-2300lx、每天光照14h-18h条件下培养13-16天。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述胚状体诱导培养的条件为

26-29℃暗培养14-16天。

5.一种制备玉米的Ⅱ型胚性愈伤组织的方法，包括如下步骤：

1）按照权利要求1-4中任一所述方法制备得到能产生Ⅱ型胚性愈伤组织的玉米自交系；

2）取所述能产生Ⅱ型胚性愈伤组织的玉米自交系的幼胚，进行胚性愈伤组织诱导，得到玉米的Ⅱ型胚性愈伤组织。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述胚性愈伤组织诱导的方法包括如下步骤：将所述幼胚接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，进行胚性愈伤组织诱导培养；

所述胚性愈伤组织诱导培养的条件为于28℃的黑暗环境中培养2周；

所述胚性愈伤组织诱导培养基由N6培养基、2，4-D、肌醇、脯氨酸、蔗糖、水解酪蛋白和植物凝胶组成；

2，4-D在所述诱导培养基中的浓度为2.0-2.5mg/L，肌醇在所述诱导培养基中的浓度为0.1-0.17g/L，脯氨酸在所述诱导培养基中的浓度为2.6-2.9g/L，蔗糖在所述诱导培养基中的浓度为30g/L，水解酪蛋白在所述诱导培养基中的浓度为0.12-0.15g/L。

说明书

一种制备玉米Ⅱ型胚性愈伤组织的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种制备玉米II型胚性愈伤组织的方法。

背景技术

[0002] 大多数玉米自交系能形成致密的I型愈伤组织，这种愈伤组织胚性差，继代后较难再生出植株；松脆的II型愈伤组织生长迅速，可以长期继代并保持胚性。尽管玉米II型愈伤组织的诱导受基因型限制大，但是由于其愈伤组织比较容易获得，再生能力较强，获得转化植株的周期相对较短，仍是目前应用最广泛的受体材料之一。

[0003] 现已明确外植体的再生能力受遗传因素控制，而不同基因型幼胚胚性愈伤诱导率的差异已经有大量的论文报道。目前农杆菌介导的遗传转化的玉米材料多为A188、B73以及它们的衍生系，在很大程度上受到基因型的限制。

[0004] Hodges(1986)等发现，A188最易诱导出胚性愈伤组织并且再生能力也显著高于其它品系，以其为亲本的杂交后代也表现较高的体细胞再生能力，自交系A188是表现最突出的基因型，但这个品系的农艺性状表现很差，目的性状需经长时间的杂交转育才能转入有生产利用价值的玉米品种中。

[0005] 随着粮食与能源的日趋紧张，高油玉米的发展将被受关注。目前有关高油玉米自交系的幼胚愈伤组织培养的研究报道较少。因此有必要建立一个优良的高油玉米再生体系，培育出再生能力强、具有高油性状、农艺性状好的材料，为高油材料遗传转化奠定基础。 [0006] I型愈伤：生长速度慢，结构致密，容易分化成苗，不能长期继代生长，有时可转化为II型愈伤；II型愈伤：生长速度快，松散易碎，色泽鲜艳，极易分化成苗，可以长期继代生长。III型愈伤：生长速度慢，结构疏松，色泽暗淡，有时成水渍状，无再生能力。国际上通用的用此种方法区分I型愈伤和II型愈伤，二者很容易区分。

发明内容

[0007] 本发明的一个目的是提供一种制备能产生II型胚性愈伤组织的玉米自交系的方法。

[0008] 本发明所提供的制备能产生II型胚性愈伤组织的玉米自交系的方法，包括如下步骤：将出发玉米自交系进行自交，获得F1代种子；取F1代种子的幼胚进行胚性愈伤组织诱导，得到胚性愈伤组织，挑取II型胚性愈伤组织；将所述II型胚性愈伤组织再生培养得到玉米植株，得到的玉米植株即为目的玉米自交系。

[0009] 上述过程中，所述胚性愈伤组织诱导的方法包括如下步骤：将所述F1代种子的幼胚接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，进行胚性愈伤组织诱导培养；

[0010] 上述任一所述过程中，所述胚性愈伤组织诱导培养的条件为于28℃的黑暗环境中培养2周；

[0011] 上述任一所述过程中，所述胚性愈伤组织诱导培养基由N6培养基、2，4-D、肌醇、脯氨酸、蔗糖、水解酪蛋白和植物凝胶组成；

[0012] 2，4-D在所述诱导培养基中的浓度为2.0-2.5mg/l，肌醇在所述诱导培养基中的浓度为0.1-0.17g/l，脯氨酸在所述诱导培养基中的浓度为2.6-2.9g/l，蔗糖在所述诱导培养基中的浓度为30g/l，水解酪蛋白在所述诱导培养基中的浓度为0.12-0.15g/l。 [0013] 上述胚性愈伤组织诱导培养基中，植物凝胶在所述诱导培养基中的浓度为8g/l，一般为8g/l过高培养基太硬，不易于养分吸收；过低培养基太软，外植体易移动不利于生长。

[0014] 上述任一所述过程中，所述将所述II型胚性愈伤组织再生培养得到玉米植株的方法包括如下步骤：将所述II型胚性愈伤组织进行胚状体诱导培养，得到胚状体；将所述胚状体接到分化培养基上，进行分化培养，得到玉米植株；

[0015] 上述任一所述过程中，所述分化培养的条件为于28℃、光强2000lx-2300lx、每天光照14h-18h条件下培养13-16天；

[0016] 上述任一所述过程中，所述分化培养基由MS培养基、肌醇、蔗糖、6-BA和植物凝胶组成；

[0017] 肌醇在所述分化培养基中的浓度为0.1-0.17g/l，蔗糖在所述分化培养基中的浓度为30g/L-35g/L，6-BA在所述分化培养基中的浓度为0mg/L-0.5mg/L。

[0018] 植物凝胶在所述分化培养基中的浓度为8g/l，一般为8g/l过高培养基太硬，不易于养分吸收；过低培养基太软，外植体易移动不利于生长。

[0019] 上述任一所述过程中，所述胚状体诱导培养的方法包括如下步骤：将所述II型胚性愈伤组织接到胚状体诱导培养基上，进行胚状体诱导培养；

[0020] 上述任一所述过程中，所述胚状体诱导培养的条件为26-29℃暗培养14-16天； [0021] 所述胚状体诱导培养基由MS培养基、肌醇、蔗糖和植物凝胶组成，肌醇在所述胚状体诱导培养基中的浓度为0.1-0.17g/l，蔗糖在所述胚状体诱导培养基中的浓度为60g/L-65g/L。

[0022] 植物凝胶在所述胚状体诱导培养基中的浓度为8g/l，一般为8g/l过高培养基太硬，不易于养分吸收；过低培养基太软，外植体易移动不利于生长。

[0023] 上述任一所述过程中，所述出发玉米自交系为高油自交系GY302。 [0024] 本发明的另一个目的是提供一种制备玉米的II型胚性愈伤组织的方法。 [0025] 本发明所提供的制备玉米的II型胚性愈伤组织的方法，包括如下步骤： [0026] 1)按照上述任一制备能产生II型胚性愈伤组织的玉米自交系方法制备得到能产生II型胚性愈伤组织的玉米自交系；

[0027] 2)取所述能产生II型胚性愈伤组织的玉米自交系的幼胚，进行胚性愈伤组织诱导，得到玉米的II型胚性愈伤组织。

[0028] 上述制备玉米的II型胚性愈伤组织的过程中，所述胚性愈伤组织诱导的方法包括如下步骤：将所述幼胚接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，进行胚性愈伤组织诱导培养；

[0029] 上述制备玉米的II型胚性愈伤组织的过程中，所述胚性愈伤组织诱导培养的条件为于28℃的黑暗环境中培养2周；

[0030] 上述制备玉米的II型胚性愈伤组织的过程中，所述胚性愈伤组织诱导培养基由N6培养基、2，4-D、肌醇、脯氨酸、蔗糖、水解酪蛋白和植物凝胶组成； [0031] 2，4-D在所述诱导培养基中的浓度为2.0-2.5mg/l，肌醇在所述诱导培养基中的浓度为0.1-0.17g/l，脯氨酸在所述诱导培养基中的浓度为2.6-2.9g/l，蔗糖在所述诱导培养基中的浓度为30g/l，水解酪蛋白在所述诱导培养基中的浓度为0.12-0.15g/l； [0032] 植物凝胶在所述诱导培养基中的浓度为8g/l。一般为8g/l过高培养基太硬，不易于养分吸收；过低培养基太软，外植体易移动不利于生长。

[0033] 本发明方法得到了具有II型愈伤表型、再生容易、再生植株农艺性状优良的玉米材料，为目前转基因的受体提供了新材料，打破了目前仅限于利用Hill、AB自交系等少数几个自交系的局限，并缩短了利用转基因技术培育玉米新品种的时间。

附图说明

[0034] 图1为NGY302的雄穗性状。

[0035] 图2为NGY302的植株性状。

具体实施方式

[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 [0037] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 [0038] 高油自交系GY302在文献“张洋，姜海鹰，刘明，张宝石.高油玉米自交系产量性状的配合力及聚类分析.玉米科学.2006，14(3)”中公开过，公众可从中国农业大学获得。 [0039] 实施例1、能产生II型胚性愈伤组织的玉米自交系-NGY302的制备及验证 [0040] 一、制备及验证

[0041] (一)制备

[0042] 1、将高油自交系GY302进行自交，获得F1代种子；

[0043] 2009年8月中旬于北京昌平中国农业大学试验站实验，将高油自交系GY302进行单株自交，获得自交F1代种子。

[0044] 2、II型胚性愈伤组织诱导：

[0045] 取100个F1代种子的幼胚进行胚性愈伤组织诱导，得到100个胚性愈伤组织，从中挑取II型胚性愈伤组织，统计II型胚性愈伤组织的诱导率。

[0046] 胚性愈伤组织诱导方法：将高油材料GY302田间自交授粉后10天的玉米穗用10％的次氯酸钠水溶液消毒10min，再用灭菌水清洗2遍，于超净工作台中将幼胚剥出，于超净工作台上接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，放置于28℃的黑暗环境中培养2周后，得到胚性愈伤组织。

[0047] 所述胚性愈伤组织培养基由N6培养基、2，4-D、肌醇、脯氨酸、蔗糖、水解酪蛋白和植物凝胶组成；2，4-D在诱导培养基中的浓度为2.2mg/l，肌醇在诱导培养基中的浓度为0.15g/l，脯氨酸在诱导培养基中的浓度为2.8g/l，蔗糖在诱导培养基中的浓度为30g/l，水解酪蛋白在诱导培养基中的浓度为0.15g/l，植物凝胶在诱导培养基中的浓度为8g/l。
N6培养基购自Sigma，产品目录号为C1416。

[0048] II型愈伤组织的判别方法：生长速度快，松散易碎，色泽鲜艳，极易分化成苗，可以长期继代生长。其它介于I型和II型之间或介于II型和III型之间的愈伤组织均不记作II型。

[0049]

[0050] 愈伤组织继代方法：继代培养基与上述胚性愈伤组织诱导培养基相同。继代培养条件：于28℃的黑暗环境中培养2周。

[0051] 结果：挑出的II型胚性愈伤组织生长速度快，组织松散，表面不光滑，呈颗粒状，色泽鲜艳，继代了10次，仍然为II型胚性愈伤组织；挑出2个II型胚性愈伤组织；II型胚性愈伤组织的诱导率为2％。

[0052] 3、再生：

[0053] 将所述II型胚性愈伤组织再生培养得到玉米植株，得到的玉米植株即为目的玉米自交系，记作NGY302。统计再生率。

[0054] 第一次继代培养：将步骤2得到的初始II型胚性愈伤组织继代培养，继代培养的培养基与继代培养条件与步骤2中所述一致，继代培养后得到的愈伤组织仍为II型胚性愈伤组织，记作第一次继代II型胚性愈伤组织；

[0055] 第二次继代培养：将第一次继代II型胚性愈伤组织分成小块，每块再进行继代培养，继代培养的培养基与继代培养条件与步骤2中所述一致，得到150块II型胚性愈伤组织。

[0056] 胚状体诱导：将150块II型愈伤接到胚状体诱导培养基上，28℃暗培养15天，得到白色胚状体；

[0057] 所述胚状体诱导培养基由MS培养基、肌醇、蔗糖和植物凝胶组成，肌醇在所述胚状体诱导培养基中的浓度为0.15g/l，蔗糖在所述胚状体诱导培养基中的浓度为63g/L，植物凝胶在所述胚状体诱导培养基中的浓度为8g/l；

[0058] 植株分化：将白色胚状体接到分化培养基上，于28℃、光强2200lx、每天光照16h条件下培养14天；得到再生植株小苗。

[0059] 所述分化培养基由MS培养基、肌醇、蔗糖、6-BA和植物凝胶组成；肌醇在所述分化培养基中的浓度为0.15g/l，蔗糖在所述分化培养基中的浓度为33g/L，6-BA在所述分化培养基中的浓度为0.3mg/L，植物凝胶在所述分化培养基中的浓度为8g/l；

[0060] 将再生植株小苗移至大田中，生长得到成熟的玉米植株，记作NGY302。 [0061] 诱导胚状体率：得到白色胚状体的愈伤组织数目/用于诱导的总II型愈伤组织数＝130个白色胚状体/150块II型愈伤＝86.67％。

[0062] 胚状体再生率：得到植株小苗的白色胚状体数/用于分化培养的总白色胚状体数＝85个植株/130个胚状体＝65.38％。

[0063] (二)NGY302的验证

[0064] 1、产生II型胚性愈伤组织的稳定性

[0065] 验证1：在2010年3月，于中国农业大学温室中，将NGY302进行自交，获得F1代种子；按照实验一中的方法在2010年7月，于中国农业大学上庄试验站，取F1代自交所得籽粒幼胚进行胚性愈伤组织诱导，得到胚性愈伤组织(记作F1代胚性愈伤组织)，统计II型胚性愈伤组织诱导率；结果II型胚性愈伤组织诱导率为100％。

[0066] 验证2：在2010年11月，于海南中国农业大学试验站，按照验证1中所述方法 进行验证，结果II型胚性愈伤组织诱导率为100％。

[0067] 综合以上验证结果，表明NGY302产生II型胚性愈伤组织的稳定性非常好。这符合产生II型胚性愈伤组织的表型由基因控制的原理。

[0068] 2、NGY302的农艺性状检测

[0069] 在2010年夏时间、北京上庄地点进行如下实验。

[0070] 将NGY302进行自交，获得F1代种子；将F1代种子种植，得到新生植株。统计出苗率，观察植株的农艺性状(雌雄花期、散粉性、籽粒授粉结实率、植株株高、叶片形状等表型)，检测新生植株中果穗籽粒的油分含量。

[0071]

[0072] 按 照 文 献“Science 16 May 1969：Vol.164 no.3881 pp.827-828.DOI：10.1126/science.164.3881.827.Nuclear Magnetic Resonance Measurement of Oil″Unsaturation″in Single Viable Corn Kernels.T.F.Conway and L.F.Johnson”中所述方法，利用近红外分析仪测定NGY302的籽粒的胚的油分含量。

[0073] 结果：

[0074] 籽粒出苗率达100％。

[0075] 新生植株雌雄花期一致，散粉性好(在干燥炎热的天气，摇动雄花，花药容易飘落，呈分散的颗粒状，散粉量大)，籽粒授粉结实率高(新生植株的玉米穗中的籽粒几乎100％为饱满的)，植株株高中等(1.7m-1.9m)，植株强壮，叶片稍窄叶较脆硬直立(图1、2)。 [0076] 籽粒油分含量结果如表1。籽粒胚的油分含量变化不大仍为高油分。 [0077] 表1、油分含量，两种材料随机挑选8粒测定油份：

[0078] NGY302籽粒油分测定结果

[0079]

[0080] GY302籽粒油分测定结果

[0081]

[0082]

[0083] 实验设3次重复，均得到性状稳定的NGY302。

[0084] 二、制备及验证

[0085] 方法与实验一中基本相同，不同之处如下：

[0086] 1、II型胚性愈伤组织诱导步骤中，使用的培养基如下：

[0087] 诱导培养基：除如下各物质在诱导培养基中的浓度不同外，其余均与实验一中的诱导培养基相同：2，4-D 2.0mg/l，肌醇0.1g/l，脯氨酸2.6g/l，蔗糖30g/l，水解酪蛋白0.12g/l，植物凝胶8g/l。

[0088] 2、胚状体诱导步骤中，

[0089] 使用的培养基如下：所述胚状体诱导培养基由MS培养基、肌醇、蔗糖和植物凝胶组成，肌醇在所述胚状体诱导培养基中的浓度为0.1g/l，蔗糖在所述胚状体诱导培养基中的浓度为60g/L，植物凝胶在所述胚状体诱导培养基中的浓度为8g/l；

[0090] 所述胚状体诱导培养的条件为26℃暗培养14天；

[0091] 3、植株分化步骤中，

[0092] 使用的培养基如下：除如下各物质在分化培养基中的浓度不同外，其余均与实验一中的分化培养基相同：肌醇在所述分化培养基中的浓度为0.1g/l，蔗糖在所述分化培养基中的浓度为30g/L，6-BA在所述分化培养基中的浓度为0mg/L，植物凝胶在所述分化培养基中的浓度为8g/l；

[0093] 所述分化培养的条件为于28℃、光强2000lx、每天光照14h条件下培养13天； [0094] 实验设3次重复，结果与实验一得到相同的玉米自交系。

[0095] 三、制备及验证

[0096] 方法与实验一中基本相同，不同之处如下：

[0097] 1、II型胚性愈伤组织诱导步骤中，使用的培养基如下：

[0098] 诱导培养基：除如下各物质在诱导培养基中的浓度不同外，其余均与实验一中的诱导培养基相同：2，4-D 2.5mg/l，肌醇0.17g/l，脯氨酸2.9g/l，蔗糖30g/l，水解酪蛋白0.14g/l，植物凝胶8g/l。

[0099] 2、胚状体诱导步骤中，

[0100] 使用的培养基如下：所述胚状体诱导培养基由MS培养基、肌醇、蔗糖和植物凝胶组成，肌醇在所述胚状体诱导培养基中的浓度为0.17g/l，蔗糖在所述胚状体诱导培养基中的浓度为65g/L，植物凝胶在所述胚状体诱导培养基中的浓度为8g/l；

[0101] 所述胚状体诱导培养的条件为29℃暗培养16天；

[0102] 3、植株分化步骤中，

[0103] 使用的培养基如下：除如下各物质在分化培养基中的浓度不同外，其余均与实验一中的分化培养基相同：肌醇在所述分化培养基中的浓度为0.17g/l，蔗糖在所述分化培养基中的浓度为35g/L，6-BA在所述分化培养基中的浓度为0.5mg/L，植物凝胶在所述分化培养基中的浓度为8g/l；

[0104] 所述分化培养的条件为于28℃、光强2300lx、每天光照18h条件下培养16天； [0105] 实验设3次重复，结果与实验一得到相同的玉米自交系。

[0106] 实施例2、用NGY302制备II型胚性愈伤组织

[0107] 一、方法I

[0108] 将NGY302的幼胚接种到胚性愈伤组织培养基上，于28℃的黑暗环境中培养2周，得到II型胚性愈伤组织；

[0109] 所述胚性愈伤组织培养基由N6培养基、2，4-D、肌醇、脯氨酸、蔗糖、水解酪蛋白和植物凝胶组成；

[0110] 2，4-D在所述诱导培养基中的浓度为2.2mg/l，肌醇在所述诱导培养基中的浓度为0.15g/l，脯氨酸在所述诱导培养基中的浓度为2.8g/l，蔗糖在所述诱导培养基中的浓度为30g/l，水解酪蛋白在所述诱导培养基中的浓度为0.15g/l，植物凝胶在所述诱导培养基中的浓度为8g/l。

[0111] N6培养基购自Sigma，产品目录号为C1416。

[0112] 结果所有用于培养的幼胚均得到II型胚性愈伤组织。

[0113] 二、方法II

[0114] 将NGY302的幼胚接种到胚性愈伤组织培养基上，于28℃的黑暗环境中培养2周，得到II型胚性愈伤组织；

[0115] 所述胚性愈伤组织培养基由N6培养基、2，4-D、肌醇、脯氨酸、蔗糖、水解酪蛋白和植物凝胶组成；

[0116] 2，4-D在所述诱导培养基中的浓度为2.0mg/l，肌醇在所述诱导培养基中的浓度 为0.1g/l，脯氨酸在所述诱导培养基中的浓度为2.6g/l，蔗糖在所述诱导培养基中的浓度为30g/l，水解酪蛋白在所述诱导培养基中的浓度为0.12g/l，植物凝胶在所述诱导培养基中的浓度为8g/l。

[0117] N6培养基购自Sigma，产品目录号为C1416。

[0118] 结果所有用于培养的幼胚均得到II型胚性愈伤组织。

[0119] 三、方法III

[0120] 将NGY302的幼胚接种到胚性愈伤组织培养基上，于28℃的黑暗环境中培养2周，得到II型胚性愈伤组织；

[0121] 所述胚性愈伤组织培养基由N6培养基、2，4-D、肌醇、脯氨酸、蔗糖、水解酪蛋白和植物凝胶组成；

[0122] 2，4-D在所述诱导培养基中的浓度为2.5mg/l，肌醇在所述诱导培养基中的浓度为0.17g/l，脯氨酸在所述诱导培养基中的浓度为2.9g/l，蔗糖在所述诱导培养基中的浓度为30g/l，水解酪蛋白在所述诱导培养基中的浓度为0.14g/l，植物凝胶在所述诱导培养基中的浓度为8g/l。

[0123] N6培养基购自Sigma，产品目录号为C1416。

[0124] 结果所有用于培养的幼胚均得到II型胚性愈伤组织。

[0125] 实施例3、对照

[0126] A188在文献“玉米体细胞培养与抗病变异体筛选，1993”中公开过，公众可从中国农业大学获得。

[0127] 2010年夏，将A188的籽粒和NGY302的籽粒分别种于北京上庄实验站，观察其农艺性状。结果A188植株矮小，授粉结实率约为80％，雌雄花期表现不协调，相隔2天；而NGY302植株强壮，高度中等，授粉结实率高，约为100％。

[0128] 将A188的籽粒幼胚和NGY302的籽粒幼胚分别种于N6培养基上，放置于28℃的黑暗环境中培养2周，观察得到的愈伤组织为I型还是II型。

[0129] A188在同样的N6培养上，诱导的愈伤表现95％为介于I、II之间；NGY302则为100％II型愈伤。

[0130] 在分化成植株的培养步骤中，A188需要在MS培养基上加入特定浓度的6-BA生长激素，才可分化出植株小苗；NGY302则无需加6-BA即可。