A-失碳-5α-雄甾烷化合物在制备抗恶性肿瘤药物中的应用

摘要

本发明公开了A-失碳-5α-雄甾烷化合物在制备抗恶性肿瘤药物中的应用，所述化合物具有下列通式I，包括Ia，Ib，Ic，Id，Ie，If化合物。本发明的A-失碳-5α-雄甾烷化合物经体外对人肝癌细胞Hep 3B、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肺腺癌细胞A549、小鼠黑色素瘤B16的生长抑制率平均为85％以上，最高的达到99.98％；活体试验中，对小鼠肿瘤，如肠癌C26、肝癌H22、Lewis肺癌、乳腺癌、B16黑色素瘤等的平均抑制率为50％以上，最高的达到63.19％；结果表明本发明的化合物具有明显的抗恶性肿瘤作用。本发明提供的A-失碳-5α-雄甾烷化合物有显著的、广谱的抑制恶性肿瘤细胞生长的作用，是一类药物毒性小、治疗效果好，有靶向性的新型抗恶性肿瘤药物，并且此类化合物只特异地作用于肿瘤细胞，而不影响正常细胞，有较大的临床应用价值。

权利要求

1.A-失碳-5α-雄甾烷化合物在制备抗恶性肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述化合物具有下列通式I；其为Ia，Ib，Ic，Id，Ie，If化合物：

2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基化合物Ia；

2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双乙酸酯化合物Ib；

2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双丙酸酯化合物Ic；

2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基-2β-单琥珀酸酯化合物Id；

2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双琥珀酸酯化合物Ie；

2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双丁酸酯化合物If；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、食道癌、消化道癌、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、前列腺癌或黑色素瘤。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是由A-失碳-5α-雄甾烷化合物作为活性成分与药用辅料制备的药物组合物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物是由下列之一的化合物作为活性成分与药用辅料制备的药物组合物：

2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基化合物Ia、

2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双乙酸酯化合物Ib、

2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双丙酸酯化合物Ic、

2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基-2β-单琥珀酸酯化合物Id、

2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双琥珀酸酯化合物Ie或

2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双丁酸酯化合物If。

5、根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物为经口服、注射或肠道给药的药物组合物。

说明书

A-失碳-5α-雄甾烷化合物在制备抗恶性肿瘤药物中的应

用

技术领域

[0001] 本发明涉及药物化学，具体涉及A-失碳-5α-雄甾烷化合物在制备抗恶性肿瘤药物中的应用。

背景技术

[0002] 恶性肿瘤已逐渐取代心脑血管疾病成为全球头号杀手。第五届亚太癌症预防组织大会发表的《2010年癌症报告》警告说，今后20年世界癌症患者人数将呈快速上升趋势。从2008年至2030年，全球新增癌症患者人数将从每年的1240万增至2640万，其中亚太地区患者占全世界癌症患者总数的60％。

[0003] 2007年全球有760万人死于恶性肿瘤。在发达国家，恶性肿瘤死亡率占其总死亡人数的21.6％。在中国，恶性肿瘤发病率上升尤其明显，每年发病人数约260万，死亡180万，在30年中死亡率增加了80％，已成为中国城市和农村居民的第一位死因。

[0004] 目前使用的大多数抗肿瘤药物缺少选择性抑制肿瘤的作用，在抑制恶性肿瘤生长发育的同时，对机体的正常细胞，特别是增殖旺盛的骨髓细胞、消化道粘膜上皮细胞、生殖细胞等有明显的损伤作用，并对机体的重要器官：肝、肾、心、肺、神经系统等也都有一定的毒性作用。甚至有骨髓抑制、消化道反应、脱发、肝损害、心脏毒性、泌尿生殖系统毒性、致癌致畸等毒副作用等。因此，研究开发毒副反应小、疗效好的抗恶性肿瘤的药物是一直关注的热点问题。

[0005] 2000年李瑞麟等人发明了具有治疗前列腺增生的A-失碳-5α-雄甾烷化合物，动物药效试验表明有较好的治疗前列腺增生的作用(专利号为：ZL00116781.2)。之后，发明人在长期的进一步研究中，发现了所述A-失碳-5α-雄甾烷化合物具有显著的体内和体外抗恶性肿瘤活性，可以设计制备抗恶性肿瘤药物。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种药物毒性小，治疗效果好的抗恶性肿瘤药物新药。

[0007] 本发明提供了A-失碳-5α-雄甾烷化合物在制备抗恶性肿瘤药物中的应用。

[0008] 本发明化合物具有下列通式I，具体包括Ia，Ib，Ic，Id，Ie，If六个化合物。

[0009] 2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基化合物Ia；

[0010] 2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双乙酸酯化合物Ib

[0011] 2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双丙酸酯化合物Ic

[0012] 2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基-2β-单琥珀酸酯化合物Id

[0013] 2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双琥珀酸酯化合物Ie

[0014] 2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双丁酸酯化合物If

[0015]

[0016] 式中：

[0017] R1＝R2＝-H 化合物Ia

[0018] 化合物Ib

[0019] 化合物Ic

[0020] R2＝-H化合物Id

[0021] 化合物Ie

[0022] 化合物If

[0023] 本发明的化合物经体外对人肝癌细胞Hep 3B、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肺腺癌细胞A549、小鼠黑色素瘤B16的生长抑制率平均为85％以上，最高的达到99.98％；活体试验中，对小鼠肿瘤，如肠癌C26、肝癌H22、Lewis肺癌、乳腺癌、B16黑色素瘤等的平均抑制率为50％以上，最高的达到63.19％；小鼠灌胃试验，LD50均大于800mg/kg；通过解剖肉眼所见，心、肝、肺、脾、肾及其他脏器与正常动物相比未见异常。

[0024] 结果表明本发明的化合物具有明显的抗恶性肿瘤作用，并且十分安全，同时证明了本发明的化合物具有广谱的抗恶性肿瘤作用。

[0025] 因此，可以制备抗恶性肿瘤药物。本发明所述药物是由A-失碳-5α-雄甾烷化合物作为活性成分与药用辅料制备的药物组合物。

[0026] 本发明的另一个目的是提供了上述化合物的制备方法。该方法包括下列步骤：

[0027] (1)制备2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基化合物(Ia)

[0028] 以A-失碳-5α-雄甾烷-2，17-双酮为原料，将氢氧化钾或叔丁醇钾溶于四氢呋喃溶剂中，低温-100℃～30℃条件下通乙炔至不再吸收，反应0.5～24小时生成2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基化合物(Ia)；所述A-失碳-5α-雄甾烷-2，17-双酮与氢氧化钾及叔丁醇钾的摩尔比为1∶1～1∶100；

[0029] (2)制备2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双乙酸酯(Ib)

[0030] 化合物Ia溶于吡啶中，加入乙酸酐，醋酸钠为触媒，回流反应1～24小时，反应毕冷至室温，缓慢滴加乙酸酐摩尔量1～20倍的甲醇破坏过量的乙酸酐，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗至PH为7，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，用甲醇重结晶得2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双乙酸酯(Ib)；所述化合物Ia与乙酸酐的摩尔比为1∶1～1∶100，醋酸钠用量为Ia的0.1～100mol％，每次萃取用乙酸乙酯量与Ia体积质量比为1∶1～100∶1，萃取次数为1～50次，重结晶用甲醇量与Ia体积质量比为1∶1～50∶1，重结晶溶解温度为0～100℃；

[0031] (3)制备2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双丙酸酯(Ic)

[0032] 化合物Ia溶于吡啶中，加入丙酸酐，醋酸钠为触媒，回流反应1～24小时，反应毕冷至室温，缓慢滴加丙酸酐摩尔量1～20倍的甲醇破坏过量的丙酸酐，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗至PH为7，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，用乙醇重结晶得2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双丙酸酯(Ic)；所述化合物Ia与丙酸酐的摩尔比为1∶1～1∶100，醋酸钠用量为Ia的0.1～100mol％，每次萃取用乙酸乙酯量与Ia体积质量比为1∶1～100∶1，萃取次数为1～50次，重结晶用乙醇量与Ia体积质量比为1∶1～50∶1，重结晶溶解温度为0～100℃。

[0033] (4)制备2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基-2β-单琥珀酸酯化合物(Id)

[0034] 化合物Ia与琥珀酸酐，在吡啶中以醋酸钠为触媒，回流反应1～24小时，加水水解过量的酸酐，乙酸乙酯萃取，有机层水洗至PH为7，减压浓缩析出固体，甲醇-水重结晶得2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基-2β-单琥珀酸酯化合物(Id)；所述化合物Ia与琥珀酸酐的摩尔比为1∶0.5～1∶100，醋酸钠用量为Ia的0.1～
100mol％，水解酸酐所用水量为酸酐摩尔量的1～20倍，每次萃取用乙酸乙酯量与Ia体积质量比为1∶1～100∶1，萃取次数为1～50次，重结晶甲醇和水的比例为100∶1～
1∶10(体积比)，甲醇-水混合溶剂的用量与Ia体积质量比为1∶1～50∶1，重结晶溶解温度为0～100℃；

[0035] (5)制备2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双琥珀酸酯化合物(Ie)

[0036] 化合物Ia与琥珀酸酐在吡啶中，以对甲苯磺酸PTS为触媒，回流反应1～24小时，加水水解过量的酸酐，乙酸乙酯萃取有机层水洗至PH为7，减压浓缩析出固体，95％乙醇重结晶得2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双琥珀酸酯化合物(Ie)；所述化合物Ia与琥珀酸酐的摩尔比为1∶1～1∶100，PTS用量为Ia的0.1～100mol％，水解酸酐所用水量为酸酐摩尔量的1～20倍，每次萃取用乙酸乙酯量与Ia体积质量比为1∶1～100∶1，萃取次数为1～50次，重结晶用95％乙醇量与Ia体积质量比为1∶1～50∶1，重结晶溶解温度为0～100℃；

[0037] (6)制备2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5a-雄甾烷-2β，17β-双羟基双丁酸酯化合物(If)

[0038] 化合物Ia与丁酸酐，以PTS为触媒，100℃搅拌反应1～12小时，加水水解过量的酸酐，析出固体，过滤，滤饼水洗至PH为7，95％乙醇重结晶得2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5a-雄甾烷-2β，17β-双羟基双丁酸酯化合物(If)；所述化合物Ia与丁酸酐的摩尔比为1∶1～1∶100，PTS用量为Ia的0.1～100mol％，水解酸酐所用水量为酸酐摩尔量的1～20倍，每次萃取用乙酸乙酯量与Ia体积质量比为1∶1～100∶1，萃取次数为1～50次，重结晶用95％乙醇量与Ia体积质量比为1∶1～50∶1，重结晶溶解温度为
0～100℃。

[0039] 本发明的A-失碳-5α-雄甾烷化合物对哺乳动物的肿块有强力的、广谱的抑癌活性，如对抗肝癌、肺癌、睾丸癌、食道癌、消化道癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、中枢神经癌、前列腺癌等。

[0040] 本发明A-失碳-5α-雄甾烷化合物可以通过对人体局部多种方法给药，比如口服、注射、肠道给药，而达到全身起作用的效果，也可用于治疗肾、淋巴、胸腔、卵巢、黑色素瘤等恶性肿瘤。

[0041] 本发明提供的A-失碳-5α-雄甾烷化合物有显著的、广谱的抑制恶性肿瘤细胞生长的作用，是一类药物毒性小、治疗效果好，有靶向性的新型抗恶性肿瘤药物，并且此类化合物只特异地作用于肿瘤细胞，而不影响正常细胞。

具体实施方式

[0042] 下面通过实施例对本发明做进一步说明，以便更好理解本发明，但其不影响本发明的保护范围。

[0043] 实施例1制备2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄烷-2β，17β-双羟基化合物(Ia)

[0044] 30g KOH粉末悬浮于60ml THF，冷至5℃以下通乙炔至不吸收，然后将10g A-失碳雄烷-2，17-双酮溶于100ml THF，滴加至烧瓶中，通乙炔至薄层层析见原料消失，在搅拌下缓慢滴加18ml水，搅拌30分钟，分去下层水层，有机层减压浓缩至干，加乙酸乙酯100mL溶解后，水洗至PH为7，5g活性炭脱色，过滤，滤液减压浓缩至干，所得粘稠固体用体积比为1∶1的正己烷-苯混合溶剂150mL回流溶解，冷却后析出晶体，过滤，滤饼烘干得2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄烷-2β，17β-双羟基化合物(Ia)8g，mp 169-170℃，[α]
25
D -23.5°(C＝1，CHCl3)。

[0045] 实施例2制备2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双乙酸酯(Ib)

[0046] 2g Ia溶于20mL吡啶中，加入20mL乙酸酐和0.1g醋酸钠，回流反应10小时，反应毕冷至20℃，缓慢滴加30mL甲醇，加入20mL饱和食盐水，用乙酸乙酯(15mL*3)萃取，合并有机层，水洗至PH为7，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，所得固体用20mL甲醇65℃溶解后，冷至20℃并放置24小时，析出固体，过滤，滤饼烘干，得到2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双乙酸酯(Ib)1.3g，mp190-191℃，[α]25
D -39°(C＝1，CHCl3)。

[0047] 实施例3制备2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双丙酸酯(Ic)

[0048] 2g Ia溶于20mL吡啶中，加入20mL丙酸酐和0.1g醋酸钠，回流反应10小时，反应毕冷至20℃，缓慢滴加30mL甲醇，加入20mL饱和食盐水，用乙酸乙酯(15mL*3)萃取，合并有机层，水洗至PH为7，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，所得固体用15mL乙醇78℃溶解后，冷至20℃并放置24小时，析出针状晶体，过滤，滤饼烘干，得到2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双丙酸酯(Ic)2g，mp152-153℃，[α]
25
D -32°(C＝1，CHCl3)。

[0049] 实施例4制备2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄烷-2β，17β-双羟基-2β-单琥珀酸酯(Id)

[0050] 1g Ia，加5ml吡啶和2g琥珀酸酐，0.1g醋酸钠，搅拌回流3小时，反应毕冷至20℃，加入10mL水搅拌1小时，用乙酸乙酯(10mL*3)萃取，合并有机层，水洗至pH为7，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，所得固体用15mL甲醇65℃溶解后，加入10mL水，冷至20℃并放置24小时，析出白色固体，过滤，滤饼烘干得2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄烷-2β，17β-双羟基-2β-单琥珀酸酯(Id)0.5g，mp 217-219℃，[α]
25
D -24.9°(C＝1，EtOH)。

[0051] 实施例5制备2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄烷-2β，17β-双羟基双琥珀酸酯(Ie)

[0052] 5g Ia，加20ml吡啶，15g琥珀酸酐和0.5g PTS，搅拌回流10小时，加20mL水50℃搅拌2小时，用乙酸乙酯(20mL*3)萃取，合并有机层，水洗至pH为7，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至一半体积，20℃放置24小时，过滤，滤饼用15mL乙醇78℃溶解后，冷至20℃并放置24小时，析出白色固体，过滤，滤饼烘干，2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄
25
烷-2β，17β-双羟基双琥珀酸酯(Ie)1.5g，mp 220-221℃，[α]D 24.4°(C＝1，CHCl3)。

[0053] 实施例6制备2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双丁酸酯(If)

[0054] 1g Ia，20ml丁酸酐，0.5g PTS 100℃搅拌反应1小时，加40mL水20℃搅拌12小时，析出长针状结晶，过滤，滤饼水洗至pH为7，用10mL 95％乙醇78℃溶解后，冷至20℃并放置24小时，析出长针状结晶，过滤，滤饼烘干得2α，17α-双乙炔基-A-失碳-5α-雄甾烷-2β，17β-双羟基双丁酸酯(If) 1.4g，mp145-147℃。

[0055] 上述实施例1-6制备的化合物Ia，Ib，Ic，Id，Ie，If用于下列实验。

[0056] 实施例7体外抗恶性肿瘤作用研究

[0057] 材料和方法：

[0058] 1.1肿瘤细胞于1640(细胞培养液)或DMEM(细胞培养液)或F12k(细胞培养液)，10％小牛血清(或胎牛血清)，37℃，5％CO2条件下培养48小时；

[0059] 1.2细胞至对数生长期，胰酶消化细胞、离心收集细胞，细胞培液悬浮细胞，接种到96孔细胞培养板，每孔细胞在1000-10000个，同上条件培养过夜；

[0060] 1.3设置DMSO(二甲基亚砜)试剂对照组、阿霉素(市售10mg/瓶)阳性对照组，实验组；实验组的加入物质为DMSO溶解的不同浓度药物，加入到培养细胞中的药物终浓度分别为0.25、0.063、0.016毫克每毫升(mg/mL)的三个梯度，每种药设3个复孔，每孔总体积200微升，药物加入体积不大于10微升，静置培养48-72h；

[0061] 1.4每孔加入10微升MTT(噻唑蓝，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮溴盐)(5mg/mL)，反应4h后再加入Formazan溶解液，静置至蓝紫色沉淀完全溶解；

[0062] 1.5570nm及630nm(用于校正)光波下测定吸光度，计算抑制率；

[0063] 1.6抑制率大于等于50(≥50)的提取物判定为具有抑制细胞生长作用。

[0064] 实验结果如表1所示

[0065] 表1

[0066]

[0067]

[0068] 实施例8活体抗恶性肿瘤作用研究

[0069] 材料和方法：

[0070] 实验小鼠体重为18-22克，分为6组，每次实验使用同一性别的动物，本次实验中结肠癌C26、Lewis肺癌及B16黑色素瘤模型为雌性，肝癌H22模型为雄性。

[0071] 实体瘤瘤源的制备：无菌条件下取生长旺盛的实体瘤瘤源，以1克瘤组织加5-6mL的生理盐水匀浆法制备成细胞悬液，按照0.2ml/每鼠接种于相应宿主右腋皮下。

[0072] 腹水瘤瘤源的制备：无菌条件下抽取生长旺盛的腹水瘤瘤源，以生理盐水制备成约2×107/mL细胞悬液，按照0.2mL/每鼠接种于于相应宿主腋皮下。接种后的动物次日按实验设计方案给药，实验结束后处死各组动物，剖取肿瘤称重，按下列公式计算肿瘤抑制率：

[0073] 肿瘤抑制率％＝[(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％

[0074] 实验结果如表2所示

[0075] 表2

[0076]

[0077] 与阴性对照组相比：*P值＜0.05，**P值＜0.01

[0078] 实施例7抗艾氏腹水肿瘤和实体作用

[0079] 材料和方法：

[0080] 瑞士种成年(3～4月龄)小白鼠，体重18～22g，随机分组，动物肿瘤接种后随机分组，每组动物数12只，雌雄各半。

[0081] 将培养后的艾氏腹水瘤ECA、S180、U14瘤株制备成1×107～2×107/mL细胞悬液，每鼠2mL接种于小鼠右腋皮下。接种后第四天开始，隔日一次大腿肌注mg/0.05mL/日Ib、Ic、If溶液，共注射5次。对照组也隔日一次注射0.05mL/日的等量相应溶剂PBS(磷酸缓冲溶液)5次。

[0082] 于最后一次注射后二天处死动物，剥取瘤体组织称重，观察药物抑癌效应。

[0083] 实验结果如表3所示：

[0084] 表3