一类苝醌类化合物及其提取分离方法与应用转让专利
申请号 : CN201110100965.4
文献号 : CN102219768B
文献日 : 2013-09-25
发明人 : 娄红祥 , 李刚
申请人 : 山东大学
摘要 :
本发明公开了一类新的苝醌类化合物，包括通式I-VI)的化合物：本发明的苝醌类化合物是由蜈蚣衣属植物地衣的内生真菌(Phaeosphaeria sp.)发酵液中提取分离得到的，其纯度达98％以上，抗菌活性实验表明部分化合物具有较好的抗真菌作用，抗肿瘤活性实验表明该类化合物具有较好的抗肿瘤作用，在加入光照条件下，表现出明显的光敏杀伤肿瘤细胞作用。在目前药物耐药严重的环境下，采用本发明的化合物I-VI具有良好的开发、利用和发展前景，同时也为研究开发新的抗真菌和抗肿瘤药物提供先导化合物开辟了一个新的途径。
权利要求 :
1.下述通式（I-VI）的苝醌类化合物：
2.权利要求1所述的苝醌类化合物的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备真菌发酵液：将蜈蚣衣属植物地衣的内生真菌Phaeosphaeria sp.在PDA培养基上25℃斜面培养15天；然后取真菌菌落转染到锥形瓶中，每个锥形瓶中含有200ml的PDB，在22℃条件下，110rpm的摇床上培养7天；取10ml的发酵液加入到含有200ml PDB培养基的锥形瓶中，在22℃条件下，110rpm的摇床上培养30天，得到真菌发酵液；
（2）制备氯仿总提物：将上述所得真菌发酵液减压过滤，过滤液在旋转蒸发仪50℃，真空度9.0mbar条件下，减压浓缩至相对密度1.15，用一倍量的氯仿萃取5次，所述一倍量为按体积比计，收集，合并氯仿萃取液，于50℃条件下旋转蒸除氯仿后得氯仿总提物；
（3）分离：将上述氯仿总提物用其1.5倍量的200～300目的硅胶拌样，进行硅胶柱层析，以石油醚-丙酮系统梯度洗脱，在石油醚:丙酮为20:1的洗脱部分用聚酰胺薄膜检测，展开剂为丙酮:水=1:1，可见光下观察并进行合并和浓缩得两部分黄色浸膏A和B；在石油醚:丙酮为10:1的洗脱部分用聚酰胺薄膜检测，展开剂为丙酮:水=1:1，可见光下观察并进行合并和浓缩得黄色浸膏C；在石油醚:丙酮为1:1的洗脱部分用聚酰胺薄膜检测，展开剂为丙酮:水=1:1，可见光下观察并进行合并和浓缩得黄色浸膏D；
（4）纯化：将上述浸膏A进行Sephadex LH-20层析，先用氯仿:甲醇=1:1的溶液洗脱，然后再用纯甲醇溶液洗脱，可见光下合并和浓缩黄色流份，进行HPLC纯化，得到化合物I和化合物II；上述浸膏B进行Sephadex LH-20层析，以纯甲醇溶液洗脱，可见光下合并和浓缩黄色流份，进行HPLC纯化，得到化合物V和化合物VI；上述浸膏C进行Sephadex LH-20层析,以纯甲醇溶液洗脱，可见光下合并和浓缩黄色流份，进行HPLC纯化，得到化合物III；
上述浸膏D进行Sephadex LH-20层析,以纯甲醇溶液洗脱，可见光下合并和浓缩黄色流份，进行HPLC纯化，得化合物IV。
3.根据权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于：所述PDA培养基的组成为：2%葡萄糖，20%土豆，1.8%琼脂，余量为水。
4.根据权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于：所述PDB培养基的组成为：2%葡萄糖，20%土豆，余量为水。
5.根据权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于：所述HPLC是安捷伦1100高效液相色谱，其中泵为安捷伦1100G1310A泵，脱气装置为安捷伦1100G1322脱气装置，检测器为安捷伦1100G1314A VWD，检测波长为210nm，反相柱为ZORBAX SB-C185μm C18反相柱，柱外径和长度为9.4×250mm。
6.根据权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于：所述步骤（3）中，石油醚-丙酮系统为体积比从100：0到0：1。
7.权利要求1所述的苝醌类化合物在制备抗真菌药物中的应用。
8.权利要求1所述的苝醌类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.权利要求1所述的苝醌类化合物在制备光敏抗肿瘤药物中的应用。
说明书 :
一类苝醌类化合物及其提取分离方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一类新的苝醌类化合物及其提取分离方法与应用，尤其涉及一类新苝醌类化合物(I-VI)及其由蜈蚣衣属植物地衣的内生真菌(Phaeosphaeria sp.)发酵液中提取分离的方法与其在制备抗真菌和抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
[0002] 苝醌类化合物除少数来自昆虫体内，大多数来是自真菌的次级代谢产物，在结构上是一类聚合的二萘酮类化合物，存在旋阻异构和许多手性中心，通常根据真菌来源命名；到目前为止，已从真菌代谢产物中分离获得苝醌类化合物10多个，常以苝醌母核的取代和来源的差异分为三种结构类型，即：C20 Compounds，Mold Perylenequinones，Aphid Perylenequinones(Carol A.Mulrooney，Barbara J.Morgan，Xiaolin Li，Marisa C.Kozlowski.Perylenequinonenatural products：enantioselective synthesis of the oxidized pentacyclic core.J.Org.Chem.2010，75(1)：16-29.).
[0003] 目前，天然抗真菌，抗肿瘤化合物已经成为人们开发新药以及利用天然原料提取新药的重要来源，因此人们正在不断寻找活性较好，结构新颖的新型天然化合物。苝醌类化合物是天然的光敏化合物，具有较好的光敏杀伤作用，在抗肿瘤，抗菌，抗病毒方面，甚至食品和材料领域有较好的应用前景。因此，寻求新的苝醌类化合物迫在眉睫。
发明内容
[0004] 针对上述现有技术，本发明要解决的问题是提供一类新的苝醌类化合物I-VI，及其由蜈蚣衣属植物地衣的内生真菌(Phaeosphaeria sp.)发酵液中提取分离的方法与其在制备抗真菌药物和抗肿瘤药物中的应用。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0006] 一类新的苝醌类化合物，包括下述通式(I-VI)的化合物：
[0007]
[0008] 本发明的化合物I命名为Phaeosphaerin A，分子式为C30H26O10，分子量为546；呈黄色粉末状；硅胶薄层层析显示Rf＝0.4～0.6，聚酰胺薄膜层析显示Rf＝0.4～0.7；+
可见光下为黄斑，365nm紫外灯下黄色荧光；HRESIMS：[M+H]547.1611，计算值547.1599；
+ +
ESIMS：[M+H]547.3，[M+Na]569.3；30个碳原子在碳谱上的信号分布为δ175-δ210区3个，δ145-δ175区5个，δ100-δ145区12个，δ15-δ100区10个，呈现苝醌类化合物
13 1
的典型特征，C NMR中的一个羰基低场位移(δ197.22)和 HNMR中的一个酚羟基高场位移(δ12.38)暗示此类化合物母核中一个羰基缺少一个共轭双键。
可见光下为黄斑，365nm紫外灯下黄色荧光；HRESIMS：[M+H]547.1611，计算值547.1599；
+ +
ESIMS：[M+H]547.3，[M+Na]569.3；30个碳原子在碳谱上的信号分布为δ175-δ210区3个，δ145-δ175区5个，δ100-δ145区12个，δ15-δ100区10个，呈现苝醌类化合物
13 1
的典型特征，C NMR中的一个羰基低场位移(δ197.22)和 HNMR中的一个酚羟基高场位移(δ12.38)暗示此类化合物母核中一个羰基缺少一个共轭双键。
[0009] 化合物II命名为Phaeosphaerin B，分子式为C30H26O10，分子量为546；呈黄色粉末状；硅胶薄层层析显示Rf＝0.4～0.6，聚酰胺薄膜层析显示Rf＝0.4～0.7；可见光+下为黄斑，365nm紫外灯下黄色荧光；HRESIMS：[M+H]547.1607，计算值547.1599；ESIMS：
+
[M+H]+547.5，[M+Na]569.4；30个碳原子在碳谱上的信号分布为δ175-δ210区3个，δ145-δ175区5个，δ100-δ145区11个，δ15-δ100区11个，呈现苝醌类化合物的典型特征。
+
[M+H]+547.5，[M+Na]569.4；30个碳原子在碳谱上的信号分布为δ175-δ210区3个，δ145-δ175区5个，δ100-δ145区11个，δ15-δ100区11个，呈现苝醌类化合物的典型特征。
[0010] 化合物III命名为Phaeosphaerin C，分子式为C30H28O10，分子量为548；呈黄色粉末状；硅胶薄层层析显示Rf＝0.4～0.6，聚酰胺薄膜层析显示Rf＝0.4～0.7；可见+光下为黄色斑点，365nm紫外灯下黄色荧光；HRESIMS：[M+H]549.1761，计算值549.1755；
+ +
ESIMS：[M+H]549.4，[M+Na]571.4；30个碳原子在碳谱上的信号分布为δ175-δ210区3个，δ145-δ175区5个，δ100-δ145区11个，δ15-δ100区11个，呈现苝醌类化合物的典型特征。
+ +
ESIMS：[M+H]549.4，[M+Na]571.4；30个碳原子在碳谱上的信号分布为δ175-δ210区3个，δ145-δ175区5个，δ100-δ145区11个，δ15-δ100区11个，呈现苝醌类化合物的典型特征。
[0011] 化合物IV命名为Phaeosphaerin D，分子式为C30H28O11，分子量为564；呈橘黄色粉末状；硅胶薄层层析显示Rf＝0.4～0.6，聚酰胺薄膜层析显示Rf＝0.4～0.7；可见光下+为橘黄色斑点，365nm紫外灯下橘黄色荧光；HRESIMS：[M+H]565.1716，计算值565.1704；
+ +
ESIMS：[M+H]565.4，[M+Na]587.3；30个碳原子在碳谱上的信号分布为δ175-δ210区2个，δ145-δ175区5个，δ100-δ145区11个，δ15-δ100区12个，呈现苝醌类化合物的典型特征。
+ +
ESIMS：[M+H]565.4，[M+Na]587.3；30个碳原子在碳谱上的信号分布为δ175-δ210区2个，δ145-δ175区5个，δ100-δ145区11个，δ15-δ100区12个，呈现苝醌类化合物的典型特征。
[0012] 化合物V命名为Phaeosphaerin E，分子式为C30H26O11，分子量为562；呈黄色粉末状；硅胶薄层层析显示Rf＝0.4～0.6，聚酰胺薄膜层析显示Rf＝0.4～0.7；可见光+下为黄色斑点，365nm紫外灯下橘黄色荧光；HRESIMS：[M+H]563.1558，计算值563.1548；
+ +
ESIMS：[M+H]563.3，[M+Na]585.3；30个碳原子在碳谱上的信号分布为δ175-δ210区3个，δ145-δ175区5个，δ100-δ145区11个，δ15-δ100区11个，呈现苝醌类化合物的典型特征。
+ +
ESIMS：[M+H]563.3，[M+Na]585.3；30个碳原子在碳谱上的信号分布为δ175-δ210区3个，δ145-δ175区5个，δ100-δ145区11个，δ15-δ100区11个，呈现苝醌类化合物的典型特征。
[0013] 化合物VI命名为Phaeosphaerin F，分子式为C30H26O11，分子量为562；呈黄色粉末状；硅胶薄层层析显示Rf＝0.4～0.6，聚酰胺薄膜层析显示Rf＝0.4～0.7；可见光+下为黄色斑点，365nm紫外灯下橘黄色荧光；HRESIMS：[M+H]563.1555，计算值563.1548；
+ +
ESIMS：[M+H]563.4，[M+Na]585.3；30个碳原子在碳谱上的信号分布为δ175-δ210区3个，δ145-δ175区5个，δ100-δ145区11个，δ15-δ100区11个，呈现苝醌类化合物的典型特征。
+ +
ESIMS：[M+H]563.4，[M+Na]585.3；30个碳原子在碳谱上的信号分布为δ175-δ210区3个，δ145-δ175区5个，δ100-δ145区11个，δ15-δ100区11个，呈现苝醌类化合物的典型特征。
[0014] 所述苝醌类化合物的提取分离方法，包括以下步骤：
[0015] (1)制备真菌发酵液：将蜈蚣衣属植物地衣的内生真菌(Phaeosphaeria sp.)在PDA培养基上25℃斜面培养15天；然后取适当的真菌菌落转染到几个500ml的锥形瓶中，每个锥形瓶中含有200ml的PDB(PH 7.0)，在22℃条件下，110rpm的摇床上培养7天；取10ml的发酵液加入到含有200ml PDA培养基的各个锥形瓶中，在22℃条件下，110rpm的摇床上培养30天，得到真菌发酵液；
[0016] (2)制备氯仿总提物：将上述所得真菌发酵液减压过滤，过滤液在旋转蒸发仪50℃，真空度9.0mbar条件下，减压浓缩至相对密度1.15，用一倍量(体积倍数)的氯仿萃取5次，收集，合并氯仿萃取液，于50℃条件下旋转蒸除氯仿后得氯仿总提物；
[0017] (3)分离：将上述氯仿总提物用其1.5倍量(重量倍数)的200～300目的硅胶拌样，进行硅胶柱层析，以石油醚-丙酮系统按常规比例梯度洗脱，在石油醚∶丙酮为20∶1(体积比，下同)的洗脱部分用聚酰胺薄膜检测，展开剂为丙酮∶水＝1∶1(体积比，下同)，可见光下观察并以常规方法进行合并和浓缩得两部分黄色浸膏A和B；在石油醚∶丙酮为10∶1的洗脱部分用聚酰胺薄膜检测，展开剂为丙酮∶水＝1∶1，可见光下观察并以常规方法进行合并和浓缩得黄色浸膏C；在石油醚∶丙酮为1∶1的洗脱部分用聚酰胺薄膜检测，展开剂为丙酮∶水＝1∶1，可见光下观察并以常规方法进行合并和浓缩得黄色浸膏D；
[0018] (4)纯化：将上述浸膏A进行Sephadex LH-20层析，先用氯仿∶甲醇＝1∶1(体积比，下同)的溶液洗脱，然后再用纯甲醇溶液洗脱，可见光下以常规方法合并和浓缩黄色流份，进行HPLC纯化，得到化合物I和化合物II；上述浸膏B进行Sephadex LH-20层析，以纯甲醇溶液洗脱，可见光下以常规方法合并和浓缩黄色流份，进行HPLC纯化，得到化合物V和化合物VI；上述浸膏C进行Sephadex LH-20层析，以纯甲醇溶液洗脱，可见光下以常规方法合并和浓缩黄色流份，进行HPLC纯化，得到化合物III；上述浸膏D进行进行Sephadex LH-20层析，以纯甲醇溶液洗脱，可见光下以常规方法合并和浓缩黄色流份，进行HPLC纯化，得化合物IV。
[0019] 所述PDA培养基的组成为：2％葡萄糖，20％土豆，1.8％琼脂，余量为水(各组分为质量百分数)。
[0020] 所述PDB培养基的组成为：2％葡萄糖，20％土豆，余量为水(各组分为质量百分数)。
[0021] 所述HPLC是安捷伦1100高效液相色谱，其中泵为Agilent 1100G1310A泵，脱气装置为Agilent 1100G1322脱气装置，检测器为Agilent 1100G1314A VWD，检测波长为210nm，反相柱为ZORBAX SB-C185μm C18反相柱，柱外径和长度为9.4×250mm。
[0022] 所述步骤(3)中，石油醚-丙酮系统为体积比从100∶0到0∶1。
[0023] 本发明的化合物I-VI具有较好的抗菌活性，抗肿瘤活性，因此，可以以其为原料用于制备抗菌药物(包括抗真菌药物)、抗肿瘤药物(包括光敏抗肿瘤药物)。
[0024] 采用本发明的化合物I-VI进行抗菌活性实验表明：化合物III和化合物V具有较好的抗真菌作用，且由于其结构新颖，在天然新药开发中具有较好的应用前景。
[0025] 采用本发明的化合物I-VI进行抗肿瘤活性实验表明：化合物I-VI具有较好的抗肿瘤作用，且由于其结构新颖，在天然新药开发中具有较好的应用前景。
[0026] 利用本发明涉及的化合物I-VI按照国际NCCLS标准采用XTT法测定其最小抑菌浓度(MIC80)并检测了其抑制菌丝和生物被膜形成的效果。结果表明化合物III和化合物V显示较小的MIC80和较好的抑制菌丝和生物被膜的活性。
[0027] 利用本发明涉及的化合物I-VI采用MTT法测定对3种前列腺癌细胞株的生长抑制活性：人前列腺癌细胞株PC3，DU145和LNCAP按常规方法培养于100mm培养皿中，用含1％小牛血清的RPMI1640培养液于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养3-4天。培养液更换为不含血清的培养液继续培养24h，以除去内源性甾体激素，然后更换含经活性炭处理过1％血清的培养液。将上述细胞培养液接种于96孔板上，置于37℃、5％CO2条件下培养24h，加入不同浓度的待测药物和1nmol/L人工合成激素Mibolerone(Mib)，向对照组细胞中加入
1nmol/LMib和生理盐水。培养24h，弃去上清液，加入MTT(10ul/孔，5mg/ml磷酸缓冲盐溶液)，37℃、5％CO2条件下培养4h，以酶标分析仪于570nm测定各孔OD值。实验重复3次，计算IC50值。结果显示化合物I-VI有较好的抗肿瘤活性。
1nmol/LMib和生理盐水。培养24h，弃去上清液，加入MTT(10ul/孔，5mg/ml磷酸缓冲盐溶液)，37℃、5％CO2条件下培养4h，以酶标分析仪于570nm测定各孔OD值。实验重复3次，计算IC50值。结果显示化合物I-VI有较好的抗肿瘤活性。
[0028] 利用本发明涉及的化合物III和IV采用MTT法测定加入光照条件对人K562白血病癌细胞株的生长抑制活性，同时做阴性对照：K562细胞株按常规方法培养于100mm培养皿中，用含5％小牛血清的RPMI-1640培养液于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养3-4天。培养液更换为不含血清的培养液继续培养24h，以除去内源性甾体激素，然后更换含经活性炭处理过5％血清的培养液。将上述细胞培养液接种于96孔板上，置于37℃、5％CO2条件下培养24h，加入不同浓度的待测药物和1nmol/L人工合成激素Mibolerone(Mib)，向对照组细胞中加入1nmol/Lmib和生理盐水。培养4h后，在可见光下光照1000s，再培养20h，弃去上清液，加入MTT(10ul/孔，5mg/ml磷酸缓冲盐溶液)，37℃、5％CO2条件下培养4h，以酶标分析仪于570nm测定各孔OD值。实验重复3次，计算IC50值。结果显示化合物III和IV表现出明显的光敏杀伤肿瘤细胞作用。也间接说明这类苝醌类化合物的光敏活性。
[0029] 本发明的化合物为新的苝醌类化合物，利用本发明的从蜈蚣衣属植物地衣的内生真菌(Phaeosphaeria sp.)发酵液中提取分离化合物I-VI的方法，所获得化合物纯度达98％以上，抗菌活性实验表明部分化合物具有较好的抗真菌作用，抗肿瘤活性实验表明该类化合物具有较好的抗肿瘤作用，在加入光照条件下，表现出明显的光敏杀伤肿瘤细胞作用。在目前药物耐药严重的环境下，采用本发明的化合物I-VI具有良好的开发、利用和发展前景，同时也为研究开发新的抗真菌和抗肿瘤药物提供先导化合物开辟了一个新的途径。
附图说明
[0030] 图1.化合物I的1HNMR谱(氢谱)。
[0031] 图2.化合物I的13CNMR谱(碳谱)。
[0032] 图3.化合物II的1HNMR谱(氢谱)。
[0033] 图4.化合物II的13CNMR谱(碳谱)。
[0034] 图5.化合物III的1HNMR谱(氢谱)。
[0035] 图6.化合物III的13CNMR谱(碳谱)。
[0036] 图7.化合物IV的1HNMR谱(氢谱)。
[0037] 图8.化合物IV的13CNMR谱(碳谱)。
[0038] 图9.化合物V的1HNMR谱(氢谱)。
[0039] 图10.化合物V的13CNMR谱(碳谱)。
[0040] 图11.化合物VI的1HNMR谱(氢谱)。
[0041] 图12.化合物VI的13CNMR谱(碳谱)。
具体实施方式
[0042] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0043] 实施例1：化合物的提取分离
[0044] 将采自云南省丽江九河乡后山海拔2700米地区的蜈蚣衣属植物地衣的内生真菌(Phaeosphaeria sp.)在PDA培养基上25℃斜面培养15天；然后取适当的真菌菌落转染到5个500ml的锥形瓶中，每个锥形瓶中含有200ml的PDB(PH 7.0)，并在22℃条件下，110rpm的摇床上培养7天；最后取10ml的上述发酵液加入到含有200mlPDA培养基的40个锥形瓶中，在22℃条件下，110rpm的摇床上培养30天，得到真菌发酵液。将上述所得真菌发酵液减压过滤，过滤液在旋转蒸发仪50℃，真空度9.0mbar条件下，减压浓缩至1L，用一倍量的氯仿萃取5次，收集，合并氯仿萃取液，于50℃条件下旋蒸后得氯仿总提物4.0g。将上述氯仿总提物用其1.5倍量的200～300目的硅胶拌样，进行硅胶柱层析(青岛海洋化工生产，
200～300目，6×15cm)，以石油醚-丙酮系统按常规比例梯度洗脱(石油醚和丙酮体积比从100∶0到0∶1)，在石油醚∶丙酮为20∶1的洗脱部分用聚酰胺薄膜检测，展开剂为丙酮∶水＝1∶1，可见光下观察并以常规方法进行合并和浓缩得两部分黄色浸膏A和B；
在石油醚∶丙酮为10∶1的洗脱部分用聚酰胺薄膜检测，展开剂为丙酮∶水＝1∶1，可见光下观察并以常规方法进行合并和浓缩得一部分黄色浸膏C；在石油醚∶丙酮为1∶1的洗脱部分用聚酰胺薄膜检测，展开剂为丙酮∶水＝1∶1，可见光下观察并以常规方法进行合并和浓缩得一部分黄色浸膏D。将上述浸膏A进行Sephadex LH-20层析，先用氯仿∶甲醇＝1∶1的溶液洗脱，然后再用纯甲醇溶液洗脱，可见光下以常规方法合并和浓缩黄色流份，进行HPLC纯化，其中流动相甲醇∶水＝95∶5，流速为1.8ml/min，在13.4min得到化合物I 2.8mg，在12.6min得到化合物II 2.0mg；上述浸膏B进行Sephadex LH-20层析，以纯甲醇溶液洗脱，可见光下以常规方法合并和浓缩黄色流份，进行HPLC纯化，其中流动相甲醇∶水＝87∶13，流速为1.8ml/min，在16.2min得到化合物V 1.6mg，在15.3min得到化合物VI 1.8mg；上述浸膏C进行Sephadex LH-20层析，以纯甲醇溶液洗脱，可见光下以常规方法合并和浓缩黄色流份，进行HPLC纯化，其中流动相甲醇∶水＝80∶20，流速为1.8ml/min，在16.1min得到化合物III 7.2mg；上述浸膏D进行进行Sephadex LH-20层析，以纯甲醇溶液洗脱，可见光下以常规方法合并和浓缩黄色流份，进行HPLC纯化，其中流动相甲醇∶水＝90∶10，流速为1.8ml/min，在11.5min得化合物IV 6.8mg。
200～300目，6×15cm)，以石油醚-丙酮系统按常规比例梯度洗脱(石油醚和丙酮体积比从100∶0到0∶1)，在石油醚∶丙酮为20∶1的洗脱部分用聚酰胺薄膜检测，展开剂为丙酮∶水＝1∶1，可见光下观察并以常规方法进行合并和浓缩得两部分黄色浸膏A和B；
在石油醚∶丙酮为10∶1的洗脱部分用聚酰胺薄膜检测，展开剂为丙酮∶水＝1∶1，可见光下观察并以常规方法进行合并和浓缩得一部分黄色浸膏C；在石油醚∶丙酮为1∶1的洗脱部分用聚酰胺薄膜检测，展开剂为丙酮∶水＝1∶1，可见光下观察并以常规方法进行合并和浓缩得一部分黄色浸膏D。将上述浸膏A进行Sephadex LH-20层析，先用氯仿∶甲醇＝1∶1的溶液洗脱，然后再用纯甲醇溶液洗脱，可见光下以常规方法合并和浓缩黄色流份，进行HPLC纯化，其中流动相甲醇∶水＝95∶5，流速为1.8ml/min，在13.4min得到化合物I 2.8mg，在12.6min得到化合物II 2.0mg；上述浸膏B进行Sephadex LH-20层析，以纯甲醇溶液洗脱，可见光下以常规方法合并和浓缩黄色流份，进行HPLC纯化，其中流动相甲醇∶水＝87∶13，流速为1.8ml/min，在16.2min得到化合物V 1.6mg，在15.3min得到化合物VI 1.8mg；上述浸膏C进行Sephadex LH-20层析，以纯甲醇溶液洗脱，可见光下以常规方法合并和浓缩黄色流份，进行HPLC纯化，其中流动相甲醇∶水＝80∶20，流速为1.8ml/min，在16.1min得到化合物III 7.2mg；上述浸膏D进行进行Sephadex LH-20层析，以纯甲醇溶液洗脱，可见光下以常规方法合并和浓缩黄色流份，进行HPLC纯化，其中流动相甲醇∶水＝90∶10，流速为1.8ml/min，在11.5min得化合物IV 6.8mg。
[0045] 化合物I为黄色粉末，聚酰胺薄膜层析(丙酮∶水＝1∶1)显示Rf＝0.45，可见光下显黄色斑点。
[0046] 本发明化合物I通过1HNMR，13CNMR，HMQC，HMBC，H-HCOSY等波谱数据及ESIMS和HRESIMS确定其结构，经查阅文献，此化合物属于苝醌类化合物，与常见的苝醌类化合物母核不同的是其母核中一个羰基缺少一个共轭双键，检索相关文献，没有发现该化合物，确定1 13
该化合物为新化合物，命名为Phaeosphaerin A。其结构及其 HNMR、CNMR和HMBC核磁数据如下(图1、图2、表1)：
该化合物为新化合物，命名为Phaeosphaerin A。其结构及其 HNMR、CNMR和HMBC核磁数据如下(图1、图2、表1)：
[0047]
[0048]
[0049]
[0050] HRESIMS：[M+H]+547.1611，计算值547.1599。
[0051] 化合物II为黄色粉末，聚酰胺薄膜层析(丙酮∶水＝1∶1)显示Rf＝0.46，可见光下显黄色斑点。
[0052] 本发明化合物II通过1HNMR，13CNMR，HMQC，HMBC，H-HCOSY等波谱数据及ESIMS和HRESIMS确定其结构，经查阅文献，此化合物属于苝醌类化合物，与常见的苝醌类化合物母核不同的是其母核中一个羰基缺少一个共轭双键，检索相关文献，没有发现该化合物，确定1 13
该化合物为新化合物，命名为Phaeosphaerin B。其结构及其 HNMR、CNMR和HMBC核磁数据如下(图3、图4、表2)：
该化合物为新化合物，命名为Phaeosphaerin B。其结构及其 HNMR、CNMR和HMBC核磁数据如下(图3、图4、表2)：
[0053]
[0054]
[0055]
[0056] HRESIMS：[M+H]+547.1607，计算值547.1599。
[0057] 化合物III为黄色粉末，聚酰胺薄膜层析(丙酮∶水＝1∶1)显示Rf＝0.60，可见光下显黄色斑点。
[0058] 本发明化合物III通过1HNMR，13CNMR，HMQC，HMBC，H-HCOSY等波谱数据及ESIMS和HRESIMS确定其结构，经查阅文献，此化合物属于苝醌类化合物，与常见的苝醌类化合物母核不同的是其母核中一个羰基缺少一个共轭双键，检索相关文献，没有发现该化合物，确定1 13
该化合物为新化合物，命名为Phaeosphaerin C。其结构及其 HNMR、CNMR和HMBC核磁数据如下(图5、图6、表3)：
该化合物为新化合物，命名为Phaeosphaerin C。其结构及其 HNMR、CNMR和HMBC核磁数据如下(图5、图6、表3)：
[0059]
[0060]
[0061]
[0062] HRESIMS：[M+H]+549.1761，计算值549.1755。
[0063] 化合物IV为黄色粉末，聚酰胺薄膜层析(丙酮∶水＝1∶1)显示Rf＝0.70，可见光下显黄色斑点。
[0064] 本发明化合物IV通过1HNMR，13CNMR，HMQC，HMBC，H-HCOSY等波谱数据及ESIMS和HRESIMS确定其结构，经查阅文献，此化合物属于苝醌类化合物，与常见的苝醌类化合物母核不同的是其母核中一个羰基缺少一个共轭双键，检索相关文献，没有发现该化合物，确定该化合物为新化合物，命名为Phaeosphaerin D。其结构及其1HNMR、13CNMR和HMBC核磁数据如下(图7、图8、表4)：
[0065]
[0066]
[0067]
[0068] HRESIMS：[M+H]+565.1716，计算值565.1704。
[0069] 化合物V为橘黄色粉末，聚酰胺薄膜层析(丙酮∶水＝1∶1)显示Rf＝0.55，可见光下显橘黄色斑点。
[0070] 本发明化合物V通过1HNMR，13CNMR，HMQC，HMBC，H-HCOSY等波谱数据及ESIMS和HRESIMS确定其结构，经查阅文献，此化合物属于苝醌类化合物，与常见的苝醌类化合物母核不同的是其母核中一个羰基缺少一个共轭双键，检索相关文献，没有发现该化合物，确定1 13
该化合物为新化合物，命名为Phaeosphaerin E。其结构及其 HNMR、CNMR和HMBC核磁数据如下(图9、图10、表5)：
该化合物为新化合物，命名为Phaeosphaerin E。其结构及其 HNMR、CNMR和HMBC核磁数据如下(图9、图10、表5)：
[0071]
[0072]
[0073] HRESIMS：[M+H]+563.1558，计算值563.1548。
[0074] 化合物VI为黄色粉末，聚酰胺薄膜层析(丙酮∶水＝1∶1)显示Rf＝0.57，可见光下显黄色斑点。
[0075] 本发明化合物VI通过1HNMR，13CNMR，HMQC，HMBC，H-HCOSY等波谱数据及ESIMS和HRESIMS确定其结构，经查阅文献，此化合物属于苝醌类化合物，与常见的苝醌类化合物母核不同的是其母核中一个羰基缺少一个共轭双键，检索相关文献，没有发现该化合物，确定1 13
该化合物为新化合物，命名为Phaeosphaerin F。其结构及其 HNMR、CNMR和HMBC核磁数据如下(图11、图12、表6)：
该化合物为新化合物，命名为Phaeosphaerin F。其结构及其 HNMR、CNMR和HMBC核磁数据如下(图11、图12、表6)：
[0076]
[0077]
[0078] HRESIMS：[M+H]+563.1555，计算值563.1548.
[0079] 实施例2：化合物的抑菌效果
[0080] 化合物I-VI按照国际NCCLS标准采用XTT法测定其最小抑菌浓度(MIC80)并检测了其抑制菌丝和生物被膜形成的效果。-80℃保存的白色念珠菌菌株解冻后，接种到SDA培养基上，在35℃培养24h。取发育良好的单一菌落再次接种到SDA上，35℃培养24h，以获得纯培养菌株。选择直径大于1mm的菌落5个，将其用0.85％灭菌生理盐水制成细菌悬液。将菌悬液在震荡器上振荡15秒钟，用血细胞计数板计数菌数，用RPMI-1640培养液调整菌悬液浓度为1～5×106CFU/ml。采用微量稀释法测定对真菌的抑制活性，测定时每孔中含
3
菌量约为0.5～2.5×10CFU/ml，化合物I-VI的浓度范围为512～0.25ug/ml。培养板置
35℃温箱中培养24h后观察结果，氟康唑为阳性对照。所有实验重复3次。计算最低抑菌
6
浓度(MIC)。取上述的浓度为1～5×10CFU/ml的菌悬液放入96孔板中孵育1h，弃上清，用PBS洗3次，加入含化合物I-VI的各个浓度的RPMI-1640培养液，以氟康唑做阳性对照，培养48h，加入XTT，测定吸光度OD490nm，计算被膜抑制率EC80。
3
菌量约为0.5～2.5×10CFU/ml，化合物I-VI的浓度范围为512～0.25ug/ml。培养板置
35℃温箱中培养24h后观察结果，氟康唑为阳性对照。所有实验重复3次。计算最低抑菌
6
浓度(MIC)。取上述的浓度为1～5×10CFU/ml的菌悬液放入96孔板中孵育1h，弃上清，用PBS洗3次，加入含化合物I-VI的各个浓度的RPMI-1640培养液，以氟康唑做阳性对照，培养48h，加入XTT，测定吸光度OD490nm，计算被膜抑制率EC80。
[0081] 实验结果：结果表明化合物III和化合物V显示较小的MIC80和较好的抑制菌丝和生物被膜的活性。如下表7所示：
[0082] 表7
[0083]
[0084] 实施例3：化合物的抗肿瘤效果
[0085] 化合物I-VI采用MTT法测定对3种前列腺癌细胞株的生长抑制活性：人前列腺癌细胞株PC3，DU145和LNCaP按常规方法培养于100mm培养皿中，用含1％小牛血清的RPMI1640培养液于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养3-4天。培养液更换为不含血清的培养液继续培养24h，以除去内源性甾体激素，然后更换含经活性炭处理过1％血清的培养液。将上述细胞培养液接种于96孔板上，置于37℃、5％CO2条件下培养24h，加入不同浓度的待测药物和1nmol/L人工合成激素Mibolerone(Mib)，向对照组细胞中加入1nmol/LMib和生理盐水。培养24h，弃去上清液，加入MTT(10ul/孔，5mg/ml磷酸缓冲盐溶液)，37℃、5％CO2条件下培养4h，以酶标分析仪于570nm测定各孔OD值。实验重复3次，计算IC50值。
[0086] 实验结果：化合物I-VI具有较好的抗肿瘤活性。化合物I-VI的IC50值如下表8所示：
[0087] 表8
[0088]
[0089] 实施例4：化合物的光敏抗肿瘤效果
[0090] 化合物III和IV采用MTT法测定加入光照条件对人K562白血病癌细胞株的生长抑制活性，同时做阴性对照：K562细胞株按常规方法培养于100mm培养皿中，用含5％小牛血清的RPMI1640培养液于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养3-4天。培养液更换为不含血清的培养液继续培养24h，以除去内源性甾体激素，然后更换含经活性炭处理过5％血清的培养液。将上述细胞培养液接种于96孔板上，置于37℃、5％CO2条件下培养24h，加入不同浓度的待测药物和1nmol/L人工合成激素Mibolerone(Mib)，向对照组细胞中加入1nmol/L mib和生理盐水。培养4h后，在可见光下光照1000s，再培养20h，弃去上清液，加入MTT(10ul/孔，5mg/ml磷酸缓冲盐溶液)，37℃、5％CO2条件下培养4h，以酶标分析仪于
570nm测定各孔OD值。实验重复3次，计算IC50值。
570nm测定各孔OD值。实验重复3次，计算IC50值。
[0091] 实验结果：所测化合物III和IV，加入一定光照条件后，其IC50值明显降低，分别由19.49umol/L到7.08umol/L和11.75umol/L到1.99umol/L，表明化合物III和IV具有较好的光敏杀伤肿瘤细胞的活性。也间接说明化合物I-VI是天然的光敏化合物，具有较好的光敏杀伤肿瘤细胞作用。IC50具体结果见下表9：
[0092] 表9
[0093]