一种从天然产物中提取分离牡荆素和异牡荆素的方法

摘要

本发明公开一种从天然产物中提取分离牡荆素和异牡荆素的方法。该方法以檀香叶为原料，用醇类溶剂对檀香叶进行超声提取、浸提，然后依次采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯对檀香叶醇提物进行萃取；对乙酸乙酯萃取液柱层析，所得洗脱液重结晶后得到异牡荆素；余液通过制备液相分离，得到牡荆素。本发明首次采用檀香叶，提取出牡荆素和异牡荆素，分离工艺简单，成本低，原料易得，并且檀香叶中的牡荆素和异牡荆素含量高，为檀香叶资源利用提供新的途径，这两个化合物可制成小水针滴注液、冻干粉及片剂、胶囊剂或滴丸剂，牡荆素可用于制备治疗冠心病、心肌梗死、心绞痛、防癌抗肿瘤药物，异牡荆素可用于制备治疗或预防前列腺癌、乳腺癌和子宫内膜癌药物。

权利要求

1.一种从天然产物中提取分离牡荆素和异牡荆素的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）用乙醇对粉碎后的檀香叶进行超声和/或浸提，得到檀香叶乙醇粗提物；

（2）依次采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯对檀香叶乙醇粗提物进行萃取，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩，干燥，得到乙酸乙酯萃取物；

（3）将步骤（2）得到的乙酸乙酯萃取物在层析柱中进行分离；所述分离依次选用乙酸乙酯、甲醇与甲酸的体积比为100:0：0.05，90:1：0.05，70:1：0.05，50:1：0.05，30:1：

0.05，20:1：0.05，10:1：0.05，5:1：0.05，1:1：0.05，0:1：0.05的洗脱剂进行梯度洗脱，收集合并洗脱液，对洗脱液进行重结晶，得到异牡荆素；

（4）步骤（3）重结晶后的余液进行制备液相分离纯化，得到牡荆素。

2.如权利要求1所述的从天然产物中提取分离牡荆素和异牡荆素的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述乙醇为体积分数为50~80%的乙醇水溶液；所述乙醇与檀香叶的质量比为10:1。

3.如权利要求1所述的从天然产物中提取分离牡荆素和异牡荆素的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）用与檀香叶质量比为10:1的体积分数为80%的乙醇水溶液对粉碎后的檀香叶依次进行超声、浸提，得到檀香叶乙醇粗提物；

（2）依次采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯对檀香叶乙醇粗提物进行萃取，直至乙酸乙酯溶液为无色透明为止，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩，干燥，得到乙酸乙酯萃取物；

（3）将步骤（2）得到的乙酸乙酯萃取物在层析柱中进行分离；所述分离依次选用乙酸乙酯、甲醇与甲酸的体积比为100:0：0.05，90:1：0.05，70:1：0.05，50:1：0.05，30:1：

0.05，20:1：0.05，10:1：0.05，5:1：0.05，1:1：0.05，0:1：0.05的洗脱剂进行洗脱，收集合并洗脱液，对洗脱液进行重结晶，得到异牡荆素；

（4）步骤（3）重结晶后的余液进行制备液相分离纯化，得到牡荆素。

4.如权利要求1、2或3中所述的从天然产物中提取分离牡荆素和异牡荆素的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述重结晶为用甲醇进行重结晶。

5.如权利要求1、2或3中所述的从天然产物中提取分离牡荆素和异牡荆素的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述制备液相分离的条件为采用C18反相柱，流动相为甲醇和水的体积比为35:65的甲醇水溶液，流速为10ml/min。

说明书

一种从天然产物中提取分离牡荆素和异牡荆素的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及天然产物提取领域，具体涉及一种从天然产物中提取分离牡荆素和异牡荆素的方法。

背景技术

[0002] 檀香(Santalum album L)又名真檀，白旃檀、震檀等，是檀香科檀香属的一种半寄生常绿小乔木。原产于印度南部、印度尼西亚等地，是一种集药用、香料、佛教用品、精细工艺品和优良雕刻材料于一体的重要经济树种。我国利用檀香的历史悠久，明代李时珍的《本草纲目》中记载：“檀香；释名：旃檀、真檀；气味：温、辛、无毒；主治：消风热肿毒、治中恶鬼气、杀虫、止心腹痛、霍乱、肾气痛；磨水：可涂外肾及腰肾痛处、散冷气，引胃气上升、噎膈吐食”。《中华本草》中记载：“干檀香叶具有：祛瘀血、解疮毒、主治痈疮、疥癣等功效”。

[0003] 目前，国内外学者们对中药檀香的生药学鉴定、栽培技术、质量等方面研究较多，但对檀香的化学、药理、应用等方面研究较少，而有关檀香叶的成分分析报道较少。彭万喜等采用热解-气相色谱/质谱(Py-GC/MS)技术研究檀香叶抽提物的成分，分析结果表明檀香叶苯/醇抽提物主要包含16-三十烷酮(8.69%)、11,14,17-二十碳三烯酸甲酯(8.49%)、十六酸(5.38%)、吡嗪(4.01%)、环辛二十四烷(3.89%)、苯酚(3.19%)等118种化合物，檀香叶丙酮抽提物主要包含3-羽扇酮(39.35%)、蒲公英甾醇(7.60% )、β-谷甾醇(5.38%)、蒲公英萜醇(3.42%)、乙醛(2.37%)、(5α)-雄甾-6-酮(2.36%)等48种化合物。Jigna J.等应用琼脂扩散法测定檀香叶的甲醇提取物对表皮葡萄球菌、枯草杆菌、类产碱假单胞菌、变形杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌的抑制作用，研究结果表明：檀香叶的甲醇提取物对枯草杆菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌都具有明显的抑制作用。文海涛等研究了乙烯刺激对檀香叶中多糖含量的影响,发现未经乙烯刺激的檀香叶多糖含量在9.23%~9.37%之间。

[0004] 牡荆素、异牡荆素都是具有良好生理功能的化合物。目前，牡荆素主要用于治疗心血管疾病，已有成药注射用牡荆素用于临床医疗。从零售市场上销售情况来看，牡荆素等活血化瘀类药物销售形势较好，是增长最为迅速的药品之一，其潜力巨大，空间广阔。牡荆素、异牡荆素还是防癌抗肿瘤的天然药物成分，近年研究发现，山楂叶的抗癌成分中含有牡荆素，因此医生建议消化道癌症的高危人群应经常食用山楂。异牡荆素等对AKR1C3有潜在的抑制作用,可用于治疗或预防前列腺癌、乳腺癌和子宫内膜癌。

[0005] 现在，许多植物提取厂家都在生产牡荆素类植物提取物，除了牡荆提取物以外，还有山楂提取物等。他们都是以牡荆素为指标在生产，产品也是以牡荆素为指标向客户销售。但是这类提取物所含的牡荆素含量都很低，如山楂提取物中牡荆素的含量只有0.7％左右。
从天然植物中提取分离牡荆素、异牡荆素一般采用硅胶柱色谱、SephadexLH-20柱色谱和制备HPLC联用的方法，工艺都比较复杂。

[0006] 经文献查新得知，目前国内外目前没有关于从檀香叶中分离得到牡荆素、异牡荆素的任何报道。

发明内容

[0007] 本发明的发明目的在于克服现有的天然产物提取物中，牡荆素和异牡荆素含量不高等缺点，提供一种从天然产物中提取分离并同时获得含量大、高纯度的牡荆素和异牡荆素的方法。

[0008] 本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：

[0009] 一种从天然产物中提取分离异牡荆素（即式Ⅰ化合物）和牡荆素（即式Ⅱ化合物）的方法，所述天然产物为檀香叶。

[0010] 所述提取分离方法，可以参照现有的从其它天然产物中提取分离牡荆素和异牡荆素的方法进行。

[0011] 作为一种优选方案，所述方法优选为以醇类溶剂对檀香叶进行提取得到醇提物，用酯类溶剂对醇提物进行萃取，所得酯类溶剂萃取物经过柱层析和制备液相分离分别得到异牡荆素和牡荆素。

[0012] 所述醇类溶剂为常用的低分子量醇类溶剂，作为一种优选方案，所述醇类溶剂优选为乙醇。

[0013] 所述酯类溶剂为常用的低分子量酯类溶剂，作为一种优选方案，所述酯类溶剂优选为乙酸乙酯。

[0014] 作为一种更优选方案，所述从天然产物中提取分离牡荆素和异牡荆素的方法，包括如下步骤：

[0015] （1）用乙醇对檀香叶进行超声和/或浸提，得到檀香叶乙醇粗提物；

[0016] （2）依次采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯对檀香叶乙醇粗提物进行液液萃取；收集乙酸乙酯萃取液，浓缩，干燥，得到乙酸乙酯萃取物；

[0017] （3）将步骤（2）得到的乙酸乙酯萃取物在层析柱中进行分离；所述分离选用乙酸乙酯、甲醇组成的洗脱剂进行梯度洗脱，收集合并洗脱液，对洗脱液进行重结晶，得到异牡荆素；

[0018] （4）步骤（3）重结晶后的余液进行制备液相分离纯化，得到牡荆素。

[0019] 步骤（2）所说的液液萃取，是指先对檀香叶乙醇粗提物用石油醚萃取至石油醚层无色透明，除去石油醚层，用氯仿萃取余下液层至氯仿层无色透明为止，除去氯仿层，再加入乙酸乙酯进行萃取。

[0020] 作为一种优选方案，步骤（1）中，所述乙醇优选为体积分数为50%~80%的乙醇水溶液。

[0021] 作为一种最优选方案，步骤（1）中，所述乙醇最优选为体积分数为80%的乙醇水溶液。

[0022] 作为一种优选方案，步骤（1）中，所述乙醇与檀香叶的质量比优选为10:1。

[0023] 步骤（1）中，超声或浸提都是有效的萃取方法，超声在一定程度上可以缩短萃取的时间，作为一种优选方案，选用超声萃取与浸提萃取联合进行。

[0024] 作为一种优选方案，步骤（3）中，所述层析柱优选为硅胶柱。

[0025] 作为一种优选方案，步骤（3）中，所述洗脱剂中还含有甲酸。加入甲酸，可以防止洗脱时出现的拖尾，使柱层析的分离效果更好。

[0026] 作为一种更优选方案，步骤（3）中，所述分离依次选用乙酸乙酯、甲醇与甲酸的体积比为100:0:0.05，90:1:0.05，70:1:0.05，50:1:0.05，30:1:0.05，20:1:0.05，10:1:0.05，5:1:0.05，1:1:0.05，0:1:0.05的洗脱剂进行洗脱。

[0027] 作为一种更优选方案，所述从天然产物中提取分离牡荆素和异牡荆素的方法，包括如下步骤：

[0028] （1）用体积分数为80%乙醇水溶液与檀香叶质量比为10:1的比例超声、浸提粉碎后的檀香叶，得到檀香叶乙醇粗提物；

[0029] （2）依次采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯对檀香叶乙醇粗提物进行萃取，直至乙酸乙酯溶液为无色透明为止，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩，干燥，得到乙酸乙酯萃取物；

[0030] （3）将步骤（2）得到的乙酸乙酯萃取物在层析柱中进行分离；所述分离依次选用乙酸乙酯、甲醇与甲酸的体积比为100:0:0.05，90:1:0.05，70:1:0.05，50:1:0.05，30:1:0.05，20:1:0.05，10:1:0.05，5:1:0.05，1:1:0.05，0:1:0.05的洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，重结晶，得到异牡荆素；

[0031] （4）步骤（3）重结晶后的余液进行制备液相分离纯化，得到牡荆素。

[0032] 本申请所述的超声提取，是一种常规的超声提取技术，作为一种优选方案，步骤（1）中，采用频率20KHz的超声波进行萃取，超声萃取次数为2~3次，每次超声10min~15min，浸提的时间优选为48小时。

[0033] 作为一种优选方案，步骤（3）中，收集按乙酸乙酯、甲醇与甲酸的体积比为30:1:0.05，20:1:0.05，10:1:0.05，5:1:0.05，1:1:0.05，0:1:0.05洗脱的洗脱液进行重结晶。

[0034] 作为一种优选方案，步骤（3）中，所述重结晶为用甲醇进行重结晶。

[0035] 作为一种优选方案，步骤（4）中，所述制备液相分离的条件为采用C18反相柱，流动相为甲醇和水的体积比为35:65的甲醇水溶液，流速为10ml/min。制备液相中，收集浓度最大的化合物。

[0036]

[0037] Ⅰ

[0038]

[0039] Ⅱ

[0040] 经检测及换算，牡荆素在檀香叶中含量：1.84%，异牡荆素在檀香叶中含量：0.99%。

[0041] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0042] 1.本发明的原料为檀香叶，檀香的树叶较多，每年可通过机械的方法采集到大量的檀香叶，但目前檀香叶均被遗弃，不仅造成极大的浪费，对环境也造成不良的影响，本发明提供了檀香叶资源利用的新途径；

[0043] 2.本发明分离的牡荆素和异牡荆素为首次在檀香叶中分离得到，这两个化合物具有抗癌、抗肿瘤、降血压、止痉挛、抗感染、抗菌、抗辐射、抗氧化以及清除自由基、抗甲状腺和致甲状腺肿的功效，本发明为高附加值产品资源化的综合利用提供了很好的途径。

[0044] 3.本发明可以从檀香叶中提取得到占檀香叶重量1.84%的牡荆素及0.99%的异牡荆素，比目前生产牡荆素类植物的含量高1%左右。

[0045] 4.目前，从天然植物中提取分离牡荆素、异牡荆素一般需要采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱和制备HPLC联用的方法，工艺比较复杂且成本高；而本发明用硅胶柱层析分离得到异牡荆素，再经制备液相分离得到牡荆素，工艺简单，成本较低。

具体实施方式

[0046] 以下结合具体实施例进一步解释本发明，但实施例并不对本发明作任何形式的限定。

[0047] 实施例1

[0048] （1） 檀香叶乙醇粗提物的制备：将檀香叶粉碎，加入10倍重量、体积分数为80%的乙醇水溶液，搅匀，采用频率20KHz的超声波进行萃取，超声萃取次数为2~3次，每次超声10min，然后在室温下浸提48 h，过滤，滤渣再重复提取三次，合并滤液，将滤液浓缩，把乙醇挥尽，得乙醇粗提物；

[0049] （2） 檀香叶乙醇粗提物液液萃取分离纯化：将乙醇粗提物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，直至乙酸乙酯溶液为无色透明为止，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩，干燥，得到乙酸乙酯萃取物；

[0050] （3） 将乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱色谱分离，依次用不同浓度的乙酸乙酯、甲醇