红绶曲霉SGFA1及其在降解甲醛中的应用

摘要

本发明公开了红绶曲霉SGFA1及其在降解甲醛中的应用。本发明所提供的红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1，其保藏号为CGMCC No.4538。本发明所提供的红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1可在好氧条件下将甲醛做为唯一碳源进行生长，同时将其降解。在纯培养条件下，能将浓度为80mmol/L的甲醛在7天内降解完全。该菌株有望在工业废水的生物处理中发挥重要作用。

权利要求

1.一种红绶曲霉菌株，其特征在于：该菌株是红绶曲霉(Aspergillus nomius)菌株SGFA1，其保藏号为CGMCC No.4538。

2.权利要求1所述的红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1在降解甲醛中的应用。

3.一种降解甲醛的菌剂，其活性成分为权利要求1所述的红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1。

4.权利要求3所述的菌剂在降解甲醛中的应用。

说明书

红绶曲霉SGFA1及其在降解甲醛中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及红绶曲霉SGFA1及其在降解甲醛中的应用。

背景技术

[0002] 甲醛在常温下是一种无色，有强烈刺激性气味的气体，易溶于水、醇和醚，通常以水溶液的形式出现。甲醛易发生加成、氧化、还原、聚合等化学反应，具有高度的水溶性，能够与生物大分子高度反应，甲醛在接触部位吸收或降解，进入人体后，主要与人体的蛋白质和核酸反应：引起细胞核基因突变、DNA单链内交连、DNA与蛋白质交连、抑制DNA损伤的修复，与氨基结合，改变蛋白质的内部结构并凝固，扰乱人体细胞的正常代谢，从而产生杀伤力。长时间吸入甲醛气体，可损伤肝脏、肾脏、血液系统、消化系统、呼吸系统、中枢神经系统和免疫系统，妇女、孕妇长时间接触低浓度甲醛气体，能导致月经紊乱、胎儿畸形、新生儿免疫力降低、体质下降，智力发育产生障碍。甲醛有毒，致畸，同时甲醛也具有强烈的致癌作用，在我国有毒化学品优先控制的名单上居第2位。甲醛是一种重要的化工原料和有机溶剂。常用于制造树脂、塑料、药品、油漆、合成纤维和各种黏合剂等工业品，也可用作消毒、防腐等(Hesham R.Lotfy，Rashed I.G..A method for treating waste water containing form aldehyde[J].Water Research，2002，36：633-637)。环境中甲醛的主要来源是甲醛生产企业以及以甲醛为原料的有机合成、木材加工、染料、制漆等行业排放的废水。

[0003] 目前对甲醛废水的处理方法主要有化学反应法(软锰矿催化氧化、次氯酸钠、亚氯酸钠、二氧化氯、高锰酸钾等的氧化作用)、电化学法、电解氧化、氧化吸附法、物理吸附技术、臭氧负离子技术、纳米光催化技术、低温等离子技术和生物降解等方法。但是，化学方法的反复使用会造成二次污染；物理方法普遍存在成本较高，操作复杂和处理效果不理想等问题。相对的，微生物法则以生态环境中的有益菌为材料，成本低，效果好，而且无二次污染。微生物以污染物中的有机物、富营养元素为食物，大量生长繁殖，加速消耗污染物中有机物、污染物、营养成份，从而彻底治理污染。特选的微生物能保持长久的活性，它们以各自针对分解的有毒物质为“食物”，快速、大量繁殖，在污染物表面及浅表层形成菌群保护膜，随时截杀从污染源渗透或挥发出的污染物，从而能长久地起作用由于它能渗入到污染源中，在不破坏原始材料的情况下，有效分解有害物质从而治标治本，杜绝后患。无毒无害，不会危害人体和造成环境二次污染。

[0004] 目前常用的生物方法多是应用筛选自各类不同生境的甲醛降解细菌和酵母，这类微生物对不良环境，如紫外辐射、低营养、低pH值等适应性不佳，繁殖传播能力较差，且不易保存。丝状真菌普遍存在于水体和土壤环境中，其菌丝体能提供较大的表面积与污染物接触，有利于污染物的充分降解；其孢子能够适应各类不良环境。因此，亟待开发一种能够有效降解废水中甲醛，且安全、环保、高效的真菌菌种。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1。

[0006] 本发明所提供的红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1，其保藏号为CGMCC No.4538。

[0007] 本发明的另一个目的是提供所述红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1在降解甲醛中的应用。

[0008] 本发明的又一个目的是提供一种降解甲醛的菌剂。

[0009] 本发明所提供的降解甲醛的菌剂，其活性成分为所述红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1。

[0010] 所述菌剂在降解甲醛中的应用也属于本发明的保护范围。

[0011] 本发明所提供的红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1可在好氧条件下将甲醛作为唯一碳源进行生长，同时将其降解。在纯培养条件下，能将浓度为80mmol/L的甲醛在7天内降解完全。该菌株有望在工业废水的生物处理中发挥重要作用。

附图说明

[0012] 图1为红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1在孟加拉红培养基上的生长状况。

[0013] 图2为红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1的分生孢子囊。

[0014] 图3为将红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1在含有80mmol/l甲醛的培养基中培养时甲醛含量的变化。

[0015] 图4为将红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1在含有不同浓度甲醛的培养基中培养时菌丝体干重的的变化。

[0016] 图5为将红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1在含有不同浓度甲醛的培养基中培养时甲醛含量的变化。

[0017] 图6为将红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1在含有不同碳源的培养基中培养时菌丝体干重的的变化。

[0018] 图7为将红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1在含有不同碳源的培养基中培养时甲醛含量的变化。

[0019] 图8为不同浓度甲醛标准品对应OD值的标准曲线。

具体实施方式

[0020] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0021] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0022] 实施例1、红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1的分离和鉴定

[0023] 一、红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1的分离

[0024] 红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1的分离分为取样和富集培养，筛选和纯化两个步骤，具体方法如下：

[0025] 1、取样和富集培养

[0026] 取黑龙江省某家具厂未处理的出水口处淤泥样后立即富集培养。在超净工作台-1上，取10g淤泥样置于90mL无菌水中，180r·min ，置于30℃的条件下震荡培养5天。

[0027] 2、筛选和纯化

[0028] 筛选用的是含甲醛的PDA培养基，该培养基的配制方法如下：

[0029] 取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮沸30分钟，纱布过滤，再加20g葡萄糖和2％的琼脂，定容至1000mL，121℃灭菌20分钟，冷却后加入10mmol/L甲醛贮存备用。

[0030] 将上述步骤1震荡培养5天后生长起来的霉菌经多次用含有10mmol/L甲醛的PDA培养基平板划线，直至分离得到单菌落为止。将菌丝顶端移接到PDA培养基上连续重复纯化3次，既获得纯培养菌株。

[0031] 二、红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1的鉴定

[0032] 对上述实验一得到的纯培养菌株进行一系列形态特征鉴定，并进行DNA提取，ITS保守区序列的扩增和测序。该菌株在孟加拉红培养基上呈环状生长，菌落黄绿色，反面蛋壳黄色，菌体平薄，粗糙，内部为黄色，最外缘为白色，后期稍呈绿色。干燥无渗出液，表面无辐射状纹，基质有不规则的辐射皱折沟纹(图1)。分生孢子穗圆筒状，淡黄色。分生孢子梗平滑带黄色。分生孢子囊为球形，孢子呈葡萄状(图2)。

[0033] 孟加拉红培养基的配制方法如下：将蛋白胨5g、葡萄糖10g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O0.5g和琼脂20g加入蒸馏水中溶解后，加1/3000孟加拉红溶液(取孟加拉红30克，加蒸馏水1000毫升，加热至全部溶解，即得到1/3000孟加拉红溶液)100mL和氯霉素0.1g，定容至
1000mL，分装，121℃灭菌20min，用于分离霉菌及酵母。

[0034] 利用通用引物ITS1和ITS4进行ITS保守区序列的扩增，引物序列如下：

[0035] ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，

[0036] ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

[0037] PCR扩增条件为：94℃3min；94℃30s，50℃30s，72℃1.5min，25个循环；72℃10min。

[0038] 对PCR扩增产物进行测序，测序结果如序列表中序列1所示。

[0039] 将上述获得的纯培养菌株中的一株命名为红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1。

[0040] 该红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1已于2011年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4538。

[0041] 实施例2、红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1对甲醛的生物降解效果检测红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1一级种子的制备方法如下：

[0042] 将从上述实施例1中PDA斜面上冲洗下的孢子悬液接入PD培养基中，接种量为-12％(体积比)，在30℃，180r·min ，培养4天，即得到一级种子液。

[0043] PD培养基：除不加琼脂外，其余成分均与上述PDA培养基相同。

[0044] (一)红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1对甲醛的生物降解效果检测[0045] 将得到的一级种子液按体积比为2％的比例接种于含80mmol/l甲醛的PD培养基-1中进行培养，摇床转速180r·min ，温度30℃，培养7天。同时，设不接种一级种子液的对照。

[0046] 在接种的第1、第2、第3、第4、第5、第6和第7天分别取加菌处理和对照的培养液，每天测量甲醛剩余量，共测量7天。实验设3次重复，结果取平均值。结果如图3所示，加菌处理的培养液中，接种7天内甲醛浓度呈下降趋势，且第7天甲醛全部降解；而对照的培养液中，接种7天内甲醛浓度没有明显的变化。此结果说明，红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1可降解甲醛。

[0047] (二)红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1对不同浓度甲醛的降解效果检测[0048] 将得到的一级种子液按体积比为2％的比例分别接种于含有30mmol/l、50mmol/L-1和80mmol/L甲醛的PD培养基中进行培养，摇床转速180r·min ，温度30℃，培养7天。

[0049] 在接种的第1、第2、第3、第4、第5、第6和第7天分别取不同甲醛浓度处理培养液，每天测量菌丝干重和甲醛剩余量，共测量7天。实验设3次重复，结果取平均值。结果如图4所示，即SGFA1在30mmol/L、50mmol/L和80mmol/L甲醛处理下的生长状况和甲醛降解状况。从图中可见，SGFA1在30mmol/L甲醛处理下，第7天菌丝体干重达到0.748g，在50mmol/L甲醛处理下，第7天菌丝体干重达到0.418g，在80mmol/L甲醛处理下，第7天菌丝体干重达到0.346g。此结果说明甲醛浓度越高，同等质量的菌生长同样时间，生长状况越差。

[0050] 在接种的第1、第2、第3、第4、第5、第6和第7天分别取不同甲醛浓度处理培养液，每天测量甲醛剩余量，共测量7天。实验设3次重复，结果取平均值。结果如图5所示。从图中可见，不同甲醛浓度处理的培养液中甲醛浓度均显著下降，且SGFA13天内可将30mmol/L甲醛全部降解，6天内可将50mmol/L甲醛全部降解，7天内可将80mmol/L甲醛全部降解。

[0051] (三)不同碳源处理的培养基对红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1降解甲醛的影响

[0052] 选取4种碳源：葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉，按体积比2％的比例添加到PD培养基中，设置5种不同处理的碳源，分别为：甲醛(处理1)、甲醛+2％葡萄糖(处理2)、甲醛+2％乳糖(处理3)、甲醛+2％蔗糖(处理4)和甲醛+2％可溶性淀粉(处理5)，其余成分相同。5种不同处理的培养基的配制方法如下：

[0053] (1)以甲醛为碳源的培养基的配制方法如下：200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮沸30分钟，纱布过滤，再加2％的琼脂，定容至1000mL。121℃灭菌20分钟，冷却后加入甲醛浓度为80mmol/L贮存备用。

[0054] (2)以甲醛+2％葡萄糖为碳源的培养基的配制方法如下：200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮沸30分钟，纱布过滤，再加20g葡萄糖和2％的琼脂，定容至1000mL。121℃灭菌20分钟，冷却后加入甲醛浓度为80mmol/L贮存备用。

[0055] (3)以甲醛+2％乳糖为碳源的培养基的配制方法如下：200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮沸30分钟，纱布过滤，再加20g乳糖和2％的琼脂，定容至1000mL。121℃灭菌20分钟，冷却后加入甲醛浓度为80mmol/L贮存备用。

[0056] (4)以甲醛+2％蔗糖为碳源的培养基的配制方法如下：200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮沸30分钟，纱布过滤，再加20g蔗糖和2％的琼脂，定容至1000mL。121℃灭菌20分钟，冷却后加入甲醛浓度为80mmol/L贮存备用。

[0057] (5)以甲醛+2％可溶性淀粉为碳源的培养基的配制方法如下：200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮沸30分钟，纱布过滤，再加20g可溶性淀粉和2％的琼脂，定容至1000mL。121℃灭菌20分钟，冷却后加入甲醛浓度为80mmol/L贮存备用。

[0058] 将红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1一级种子液按体积比为2％的比例接种-1到上述五种培养基中进行培养。摇床转速180r·min ，温度30℃，培养7天。

[0059] 在接种的第1、第2、第3、第4、第5、第6和第7天分别取不同处理培养液，每天取2瓶测量菌丝干重和甲醛剩余量，共测量7天，实验设3次重复，结果取平均值。结果如图6和图7。

[0060] 图6和图7的结果显示：红绶曲霉(Aspergillus nomius)SGFA1能利用甲醛作为唯一碳源生长繁殖，7天能够将80mmol/L甲醛全部降解。同时，该菌能够在不同碳源的条件下代谢甲醛。

[0061] 甲醛含量测量方法为乙酰丙酮法，具体方法为：根据不同浓度的甲醛水溶液，在乙酸铵溶液介质中，与乙酰丙酮加热反应生成黄色化合物(3，5一二乙酰基-1，4氢卢剔啶)。该化合物对可见光有选择性吸收，并且对波长414nm的可见光吸收最多，其对可见光的吸收值与甲醛溶液成正比。依据这一原理，分别对几种已知浓度的甲醛溶液进行吸光度的测量，绘出不同甲醛浓度对应OD值标准曲线，得出标线方程。

[0062] 具体步骤如下：取6支10ml容量瓶编号，分别加入0，2，4，6，8，10ml浓度为100mmol/l的甲醛标准品溶液(甲醛分析纯溶液购自国药集团化学试剂有限公司，产品目录号为CAS RN 50-00-0浓度为37％-40％(体积百分比浓度))，取9.959ml该溶液加水定容到1L)，加水至10ml摇匀(不同编号的容量瓶中甲醛浓度见表1所示)。将1mL乙酰丙酮溶液加入4mL水中，然后加入不同浓度的甲醛标准品溶液1μl，65℃反应10min。当溶液冷却到室温时，测量其OD值。采用10mm比色皿，在波长414nm处，以0号为参比测量吸光度，OD值测定结果见表2。绘制不同甲醛浓度对应OD值标准曲线(如图8所示)，得出标准曲线方程为：y＝0.0065x+0.0034(R2＝0.9998)。

[0063] 表1配制不同浓度的甲醛标准品溶液

[0064]

[0065] 表2标准曲线中不同浓度的甲醛标准品浓度所对应的OD值

[0066]

[0067] 将1mL乙酰丙酮溶液加入4mL水中，然后加入菌株培养液1μl，65℃反应10min。当溶液冷却到室温时，测量其OD值。采用10mm比色皿，在波长414nm处，以水为参比测量吸光度。根据上述得出的标准曲线方程计算菌株培养液中的甲醛浓度。

[0068] 乙酰丙酮溶液的配制方法如下：将50g乙酸铵、6mL冰乙酸及0.5mL乙酰丙酮溶于100mL水中，即得到乙酰丙酮溶液。此溶液在4℃保存至少可稳定一个月。

[0069] 菌丝干重的测量方法如下：取培养液用两层纱布过滤，收集菌体，将菌体放在定量分析滤纸(滤纸事先称重)上，60℃烘干至恒重，称重。菌丝干重＝总质量-定量分析滤纸重量。