一株反硝化细菌及其在水体中与湿地植物协同脱氮的应用

摘要

本发明公开了一株反硝化细菌，该菌株命名为Paenibacillus sp.XP1，属于类芽孢杆菌属的类芽孢杆菌，已于2011年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M2011120。该菌株能够有效降低水体中的总氮浓度，适用于较高浓度亚硝酸盐或硝酸盐废水的处理，具有更加广泛的适应性。使用该菌株处理废水工艺简单，脱氮效果稳定。利用该菌在水体中与芦苇、芦竹和香蒲三种湿地植物协同脱氮时，模拟含氮废水的总氮浓度为50mg/L，投加XP1菌液强化使三种湿地的氮去除率都显著提高，其中对香蒲湿地的强化脱氮作用要明显好于芦苇、芦竹湿地。在停留时间为96h时，加菌强化香蒲湿地与未加菌香蒲湿地比较，氮去除率由14％升高到94％。

权利要求

1.一株反硝化细菌，其特征在于：该菌株命名为Paenibacillus sp.XP1，属于类芽孢杆菌属的类芽孢杆菌，已于2011年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2011120。

2.根据权利要求1所述的反硝化细菌，其特征在于：其菌学特征为：细胞呈短杆状，直径约为(0.25-0.3)×(0.6-0.8)μm；菌落乳白色，奶油状、圆形、边缘整齐、致密、半透明、光滑；革兰氏染色为阴性；最适碳源为柠檬酸钠；在碳源为柠檬酸钠，氮源为硝酸钾时，最佳C/N为7；最佳初始氮浓度为30mg/L；pH在7.0～9.0之间时，有良好的脱氮能力，最适pH为8.0。

3.权利要求1所述的反硝化细菌在水体生物脱氮中的应用。

4.权利要求1所述的反硝化细菌在水体中与湿地植物协同脱氮的应用。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：具体应用时，将培养得到的含有反硝-1化细菌的菌液按10％的比例接种于待处理含氮废水中，菌液的OD600＝0.1cm 。

说明书

一株反硝化细菌及其在水体中与湿地植物协同脱氮的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株反硝化细菌及其在水体中与湿地植物协同脱氮的应用，属于环境微生物领域。

背景技术

[0002] 随着水体富营养化的日益严重，氮素尤其是氨氮和亚硝酸氮的存在对许多水产动物有一定的毒害作用，去除水中氮素污染已经成为当今水污染防治领域的一个热点问题。人工湿地技术由于其具有易于建立、易于管理、造价低、能耗低、有利于生态恢复等优点，在污水处理中得到广泛应用。研究表明，湿地中植物的吸收作用十分有限，其贡献率一般不超过TN去除率的10％，人工湿地对氮的去除主要依靠微生物的氨化、硝化和反硝化作用。然而湿地微生物的反硝化作用在自然条件下生物作用难以得到充分发挥，使得人工湿地对氮的去除率相对较低且不稳定，一般在40％-60％左右。如何提高微生物的作用，增加氮的处理效果是当今人工湿地研究的一个核心问题。

[0003] 生物脱氮是从废水中去除氮素污染的最经济也是对环境最有宜的方法。近年来，反硝化细菌的研究成为污水处理的热点，它作为污水脱氮的一种生物方式，对于控制水体富营养化、处理污水等环境问题有很广阔的应用前景。目前，反硝化脱氮技术主要集中在发展生物脱氮技术的新工艺和新概念、污水处理系统中微生物群落结构、菌株选育等方面，而反硝化细菌在实际应用中的功能稳定性，能否适应环境的变化等内容相关研究甚少。

[0004] 香蒲作为湿地中的主要大型水生维管束植物之一，是自然及人工湿地的重要组成部分，在湿地脱氮及去除其他污染物的过程中起着重要作用。孙瑞莲等发现香蒲处理较低浓度铵态氮和总氮污染水体时效果显著；钱鸣飞等发现香蒲人工湿地系统对总氮的平均去除率为58.53％。从南四湖人工湿地植物香蒲根际土壤中筛选出一株脱氮效率高的反硝化细菌，可以为今后利用微生物强化治理南四湖氮素污染的工程应用提供基础资料和菌种来源。

发明内容

[0005] 针对上述现有技术，本发明的目的之一是提供一株反硝化细菌，该细菌具有高效脱除水中氮素的能力。本发明的另一个目的是提供一种培养条件，使该细菌表现出更强的异样脱氮能力。本发明的另一个目的是提供新的细菌在水体中与湿地植物协同进行生物脱氮，单独使用该细菌便可有效去除水体中的氮素。

[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0007] 一株反硝化细菌，该菌株命名为Paenibacillus sp.XP1，属于类芽孢杆菌属的类芽孢杆菌，已于2011年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M2011120。其菌学特征为：细胞呈短杆状，直径约为(0.25-0.3)×(0.6-0.8)μm；菌落乳白色，奶油状、圆形、边缘整齐、致密、半透明、光滑；革兰氏染色为阴性；最适碳源为柠檬酸钠；在碳源为柠檬酸钠，氮源为硝酸钾时，最佳C/N为7；最佳初始氮浓度为30mg/L；pH在7.0～9.0之间时，有良好的脱氮能力，最适pH为8.0。

[0008] 该菌株能够有效脱除水体中的总氮浓度，适用于较高浓度亚硝酸盐或硝酸盐废水的处理，具有更加广泛的适应性。其脱氮条件包括：本发明菌株在氮素含量较高的水体中作用显著，具有广泛的适应性，可利用的碳源丰富，pH 7.0～9.0。其最佳脱氮条件为：最适碳源为柠檬酸钠，在碳源为柠檬酸钠，氮源为硝酸钾时，最佳C/N为7，最佳初始氮浓度为30mg/L，该最适pH值8.0。

[0009] 具体应用时，使用方法为：

[0010] (1)使用前用反硝化培养基活化菌株：将保藏培养基斜面上保存的类芽孢杆菌菌株XP1用接种环刮取1环菌苔，接种入装有200mL保藏培养基或反硝化培养基的250mL锥形瓶中，30℃恒温培养箱静置培养12h，即可获得菌株。

[0011] (2)将活化后的菌液接种于待处理的含氮废水中，投加量为受处理废水体积的10％，pH值范围在7.0～9.0之间，定时取样检测TN去除情况。

[0012] (3)检测方法

[0013] TN：过硫酸钾氧化-紫外分光光度法；

[0014] 参照中国环境科学出版社出版的《水和废水检测分析方法》(第四版)。

[0015] OD值：采用UV-2450紫外分光光度计(Shimadzu)，在波长600nm下测定培养液的OD值。

[0016] 本发明的菌株是通过筛选偶然得到的一种具有高效脱氮活性的细菌，可以通过反硝化脱除水体中的亚硝酸盐氮和硝酸盐氮。经实验研究表明，该菌株能够有效降低水体中的总氮浓度，适用于较高浓度亚硝酸盐或硝酸盐废水的处理，具有更加广泛的适应性。使用该菌株处理废水工艺简单，脱氮效果稳定。利用该菌在水体中与芦苇、芦竹和香蒲三种湿地植物协同脱氮时，模拟含氮废水的总氮浓度为50mg/L，投加XP1菌液强化使三种湿地的氮去除率都显著提高，其中对香蒲湿地的强化脱氮作用要明显好于芦苇、芦竹湿地。在停留时间为96h时，加菌强化香蒲湿地与未加菌香蒲湿地比较，氮去除率由14％升高到94％。

[0017] 本发明中的反硝化是指微生物将NO3--N还原成NO2--N，继而再还原成N2O、NO或N2的过程。

[0018] 本发明中的脱氮是指水体中可溶性氮的去除，可溶性氮是指NH4+、NO3--N和NO2--N。

[0019] 本发明中的碳/氮比，又称C/N是指碳元素的质量与氮元素的质量之比。

[0020] 本发明的菌株具有以下优点：

[0021] (1)本发明菌株可利用的碳源范围广泛，易于培养。

[0022] (2)本发明菌株可用于处理适用于较高浓度亚硝酸盐或硝酸盐废水的处理。

[0023] (4)本发明菌株可与湿地植物脱氮互相促进，具有良好的实际应用前景。

附图说明

[0024] 本发明提供的菌株命名为Paenibacillus sp.XP1，属于类芽孢杆菌属的类芽孢杆菌，已于2011年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M2011120。

[0025] 图1：类芽孢杆菌XP1菌体透射电镜显微照片。

[0026] 图2：碳源对类芽孢杆菌XP1总氮去除率的影响。

[0027] 图3：碳氮比对类芽孢杆菌XP1总氮去除率的影响。

[0028] 图4：初始氮浓度对类芽孢杆菌XP1总氮去除率的影响。

[0029] 图5：pH对类芽孢杆菌XP1总氮去除率的影响。

[0030] 图6：类芽孢杆菌XP1菌体在最佳脱氮条件下的生长曲线及脱氮率。

[0031] 图7：类芽孢杆菌XP1菌体与三种湿地植物协同脱氮的去除效果比较，其中，A：芦苇强化实验的总氮浓度-时间示意图；B：芦竹强化实验的总氮浓度-时间示意图；C：香蒲强化实验的总氮浓度-时间示意图；D：香蒲强化实验的总氮去除率-时间示意图。

具体实施方式

[0032] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

[0033] 实施例1本发明菌株的分离鉴定：

[0034] (1)培养基：

[0035] A、菌株分离、纯化、保藏培养基(/L)：CH3COONa，2g；蛋白胨，15g；酵母膏，3g；葡萄糖，1g；NaCl，6g；KNO3，1.5g；pH控制在7.0～7.2。

[0036] B、菌株筛选、脱氮培养基(DM：Denitrifying Medium)(/L)：CH3COONa，2g；KH2PO4，0.4g；MgSO4·7H2O，0.6g；CaCl2·2H2O，0.07g；KNO3，1g；Tris缓冲液12mL；微量元素2mL；pH控制在7.0～7.2。

[0037] 上述培养基如制成固体培养基，则添加琼脂1.5％。

[0038] (2)类芽孢杆菌XP1的分离纯化：

[0039] 称取10g芦竹根际土壤样品置于250mL三角瓶中，加100mL无菌水及几粒玻璃珠，摇床振荡15min使土样分散均匀。待土样分散后，静置5min，吸取1mL土壤悬液至9mL稀释-2 -7液(无菌水)，得到10 稀释度悬液，依次按10倍稀释法稀释至10 ，由此制得各稀释度土壤悬液。

[0040] 分别吸取各稀释度悬液0.1mL至(1)中所述的反硝化细菌分离培养基A用固体培养基平板培养(已放置过夜，无杂菌生长)，用玻璃刮刀将土壤悬液涂布均匀。之后将平板倒置，放入30℃恒温培养箱，培养至长出明显菌落。

[0041] 挑取分离出来的菌株，在培养基A平板上多次划线纯化，直至显微镜下观察显示无杂菌为止，此时可认为本发明的菌株类芽孢杆菌XP1已纯化完毕。

[0042] (3)类芽孢杆菌XP1的菌落形态特征：在培养基A平板上培养3d后，显微镜下观察到菌落菌落乳白色，奶油状、圆形、边缘整齐、致密、半透明、光滑。

[0043] (4)类芽孢杆菌XP1的菌体形态特征：透射电镜观察结果表明菌体呈短杆状，直径约为(0.25-0.3)×(0.6-0.8)μm(如图1所示)。

[0044] (5)类芽孢杆菌XP1的生理生化特征：

[0045] 最适pH值范围在7.0～9.0之间，有良好的脱氮能力，革兰氏染色阴性。菌株XP1具有较为广泛的碳源谱，可利用碳源种类多样。最适碳源为柠檬酸钠(如图2所示)；在碳源为柠檬酸钠，氮源为硝酸钾时，最佳C/N为7(如图3所示)；最佳初始氮浓度为30mg/L(如图4所示)；最适pH为8.0(如图5所示)。

[0046] (6)16S rDNA的PCR扩增与测序：

[0047] 实验仪器：小型离心机(Eppendorf，转速＞12000r/min)；电泳仪(北京六一仪器厂)；PCR热循环扩增仪(Eppendorf)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。

[0048] 实验方法：从菌株XP1的新鲜斜面上直接挑取菌体，加入至含100μL双蒸水的离心管中，旋涡混匀后，沸水浴7min，12000r/min离心5min，上清液用于PCR扩增模板。扩增引物为一对通用引物。

[0049] 正向引物为27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

[0050] 反向引物为1492R：5’-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3’。

[0051] PCR反应在25μL体系中进行。反应体系的组成为：模板DNA 1μL；dNTP混合物1μL；rTaq DNA聚合酶0.2μL；正向引物1μL；反向引物1μL；双蒸水8.8μL。

[0052] PCR扩增条件：94℃变性5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min。循环30次；72℃延伸10min，4℃放置。用1％的琼脂糖凝胶对菌株的16S rDNA扩增产物做电泳检测，验证后切下胶条，用DNA凝胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)纯化PCR产物。回收后的PCR扩增产物委托上海生工生物工程有限公司进行测序。

[0053] (7)16S rDNA序列分析与系统发育分析：

[0054] 测序后得到XP1菌株的16S rDNA长度为1511bp的序列，提交到Genbank与其他菌株进行比对(登录号为GQ981313)，发现和XP1菌株亲缘关系最近的是Paenibacillus属中的Paenibacillus sp.菌株(AM162303)，序列同源性可达99％。将菌株XP1归属于类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)类群中，命名为Paenibacillus sp.XP1。

[0055] 实施例2本发明菌株的培养

[0056] (1)所使用的培养基

[0057] A、菌株保藏培养基(/L)：CH3COONa，2g；蛋白胨，15g；酵母膏，3g；葡萄糖，1g；NaCl，6g；琼脂，12g；KNO3，1.5g；pH控制在7.0～7.2。

[0058] B、菌株反硝化培养基(DM：Denitrifying Medium)(/L)：CH3COONa，2g；KH2PO4，0.4g；MgSO4·7H2O，0.6g；CaCl2·2H2O，0.07g；KNO3，1g；Tris缓冲液12mL；微量元素2mL；pH控制在7.0～7.2。

[0059] 上述培养基如制成固体培养基，则添加琼脂1.5％。使用前，121℃，灭菌20分钟。

[0060] (2)培养条件

[0061] 将保藏培养基斜面上保存的类芽孢杆菌XP1用接种环刮取1环菌苔，接种入装有200mL保藏培养基或反硝化培养基的250mL锥形瓶中，30℃恒温培养箱静置培养12h，即可获得菌株。

[0062] 实施例3本发明菌株在最佳脱氮条件下的脱氮性能

[0063] 实验在250mL三角瓶中进行，每瓶含100mL反硝化废水，调节废水中各物质的含-1量，使XP1处于反硝化所需的最佳脱氮条件。加入OD600＝0.1(cm )，10mL菌液，30℃，120r/min培养，定时检测培养基中细菌的OD600及总氮浓度。实验结果见图6。从图6中可以看出，菌株XP1的延滞期不明显，8小时之后进入指数增长期，OD600由0.15增加到1.35。50小时之后进入稳定期，90小时之后XP1菌株趋向衰亡。OD600逐渐降低.总氮去除率随着菌株XP1的增长不断升高。最终达到90％左右，且总氮去除主要发生在指数期。

[0064] 实施例4本发明菌株在水体中与湿地植物协同脱氮效果

[0065] 采用盆栽方式模拟菌株在水体中与湿地植物的协同脱氮作用。XP1菌株为南四湖湿地植物香蒲根际土壤中分离获得一株高效反硝化细菌。以直径0.5m，深0.8m的塑料桶作为盆栽基础。桶底部填充15cm厚的土壤，土壤全部采用南四湖入湖河流现有人工湿地表层熟土。将香蒲、芦竹、芦苇分别栽种桶中，控制淹水深度在10cm处。实验用水初始总氮浓度为50mg/L。分别设计菌株XP1与土壤结合、植物与土壤结合、XP1菌株，植物，土壤三者结合进行对照实验，定时检测总氮浓度。

[0066] 如图7所示，模拟湿地加入菌株XP1后，在菌株XP1、植物及湿地土壤的共同作用下，三种不同湿地植物构成的模拟湿地脱氮作用都有所提高。以香蒲为植物的模拟湿地系统，以96小时的总氮去除情况来分析，香蒲无菌实验组总氮浓度降为43mg/L，去除率为14％；香蒲加菌强化实验组总氮浓度为3mg/L，去除率为94％。加菌强化后，香蒲湿地的总氮去除率大大提高，去除率由14％升高到94％。

[0067] 对于以芦苇为植物的模拟湿地系统，以96小时的总氮去除情况来分析，芦苇无菌实验组总氮浓度降为28mg/L，去除率为44％；芦苇加菌强化实验组总氮浓度为2mg/L，去除率为96％。对于以芦竹为植物的模拟湿地系统，96小时时，芦竹无菌实验组总氮浓度降为22mg/L，去除率为56％；芦苇加菌强化实验组总氮浓度为2mg/L，去除率为96％。但两者最终总氮浓度及强化脱氮效果基本相同。

[0068] 投加菌株XP1强化植物脱氮效果表明：加入菌株XP1强化脱氮后，随着植物本身脱氮能力的增大，强化脱氮实验中总氮浓度逐渐降低，香蒲湿地的强化脱氮作用要明显好于芦苇、芦竹湿地。在实验室条件下三种湿地投加菌株XP1强化脱氮后，菌株XP1在实验中的强化脱氮作用明显，能够跟植物脱氮起到互相促进的作用，具有良好的实际应用前景。