甘薯肉桂酸-4-羟化酶蛋白编码序列及其应用

摘要

本发明提供了一种在甘薯中表达的新的编码肉桂酸-4-羟化酶(Cinnamicacid-4-hydroxylase，C4H)蛋白的编码序列及其在提高植物花色苷及其前体化合物含量的应用。本发明涉及包含所说基因的克隆、融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体。还涉及被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。本发明将所说基因在植物中表达，所获得的转基因植物的花色苷及其前体化合物化合物含量获得了提高。

权利要求

1.一种蛋白编码序列在改良对甘薯有用的花色苷中的应用，它使转基因甘薯及其后代的花色苷含量得到显著提高；所述蛋白编码序列是编码甘薯肉桂酸-4-羟化酶蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，其核苷酸序列是SEQ ID NO. 3中从第66-1583位所示的序列；

利用转基因技术将编码甘薯IbC4H蛋白活性多肽的核苷酸序列转化入甘薯以提高植物花色苷的方法步骤如下：(1)将编码甘薯IbC4H蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于甘薯表达调控序列，形成含甘薯IbC4H蛋白的甘薯表达载体，所述的核苷酸序列是SEQ ID NO. 3中从核苷酸第66-1583位的核苷酸序列；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入甘薯细胞；

(3)通过筛选，获得转化细胞并最终再生转基因甘薯及其后代。

2.根据权利要求1所述的蛋白编码序列在改良对甘薯有用的花色苷中的应用，其特征在于：所述转基因甘薯及其后代包括甘薯种子及甘薯组织。

说明书

甘薯肉桂酸-4-羟化酶蛋白编码序列及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学、以及基因工程等领域。具体地，本发明涉及一种在植物中表达的IbC4H蛋白（甘薯肉桂酸-4-羟化酶蛋白，Cinnamic acid-4-hydroxylase，IbC4H）及其核酸序列。本发明还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。

背景技术

[0002] 来源于植物的花色素苷具有抗氧化活性、预防癌症等多种作用，在食品着色、医药保健、化妆品方面有着较大的应用潜力。花色素苷在自然界广泛存在，但是在植物体内含量很高低不一。因此利用基因工程技术提高花色素苷合成途径中酶的活性，是提高植物体内花色素苷及其前体一个非常好的策略。

[0003] 本发明中，我们在旋花科（Convolvulaceae）植物甘薯（Ipomoea batatas（L.）Lam.）中克隆到肉桂酸-4-羟化酶（IbC4H）基因，该基因编码的蛋白质是花色素苷前体生物合成途径中第二步关键酶，催化反式肉桂酸的反应形成4-N基肉桂酸，属于细胞色素单加氧酶P450超家族中的CYP73A亚家族。利用RACE技术首次从紫肉甘薯中获得了编码该酶的基因，命名为IbC4H，提交到GenBank获得登录号GQ373157。

[0004] 在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的甘薯IbC4H蛋白序列及其核酸序列。

发明内容

[0005] 本发明的第一目的就是提供一种新的甘薯基因IbC4H，该基因是一个甘薯IbC4H蛋白基因。

[0006] 本发明的第二目的是提供一种新的甘薯蛋白IbC4H。

[0007] 本发明的第三目的是提供一种利用重组技术生产上述新的甘薯IbC4H蛋白和核酸序列的方法。

[0008] 本发明还提供了这种甘薯IbC4H蛋白多肽和编码序列在提高植物花色苷及其前体化合物化合物含量上的应用。

[0009] 在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有甘薯IbC4H蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第66-1584位DNA分子的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第66-1584位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列是SEQ ID NO.
3中从核苷酸第66-1584位的核苷酸序列。

[0010] 在本发明的另一方面，提供了一种分离出的甘薯IbC4H蛋白质多肽，它包括：具有SEQ ID NO. 4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是SEQ ID NO. 4序列所示的多肽。该多肽或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物具有催化反式肉桂酸的反应形成4-N基肉桂酸的功能。。

[0011] 在本发明的另一方面，还提供了一种载体， 它包含上述的DNA分子。

[0012] 在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是BL21和紫色甘薯甘薯。

[0013] 在本发明的另一方面，还提供了一种产生具有甘薯IbC4H蛋白质活性的多肽的方法，其步骤如下：

[0014] (1)将编码具有甘薯IbC4H蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成甘薯IbC4H蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第66-1584位的核苷酸序列有至少70%的同源性；

[0015] (2)将步骤(1)中的表达载体转入原核宿主细胞，形成甘薯IbC4H蛋白的重组细胞；

[0016] (3)在适合表达甘薯IbC4H蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；

[0017] (4)分离出具有甘薯IbC4H蛋白活性的基本纯的多肽。

[0018] 较佳地，在该方法中使用的核酸序列是SEQ ID NO.3中第66-1584位的序列。

[0019] 在本发明的另一方面，还提供了一种利用转基因技术将编码具有甘薯IbC4H蛋白活性多肽（即是该氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，该多肽或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物具有催化反式肉桂酸的反应形成4-N基肉桂酸的功能）。该核苷酸序列转化入植物以提高植物花色苷及其前体化合物化合物的方法，其步骤如下：

[0020] (1)将编码具有甘薯IbC4H蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成含甘薯IbC4H 的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第66-1584位的核苷酸序列有至少70%的同源性；

[0021] (2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共培养，在22-28℃条件下，暗培养1-2天后，通过筛选如抗生素筛选，获得含有甘薯IbC4H蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。含有甘薯IbC4H蛋白基因的转基因植株具有较高的花色苷及其前体化合物化合物合成能力。

[0022] 较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.3中第66-1584位的序列。

[0023] 本发明还提供了与IbC4H蛋白多肽特异性结合的抗体，它包括多克隆抗体和单克隆抗体。

[0024] 在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

[0025] 在本发明中，术语“甘薯IbC4H蛋白(或多肽)编码序列” 指编码具有甘薯IbC4H蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3中第66-1584位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. 3序列的编码框第66-1584位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 3中第66-1584位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第66-1584位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第66-1584位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。

[0026] 该术语还包括能编码具有与天然的甘薯IbC4H相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

[0027] 在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20%，较佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

[0028] 在本发明中，术语“甘薯IbC4H蛋白或多肽”指具有甘薯IbC4H蛋白活性的SEQ ID NO. 4序列的多肽。该术语还包括具有与天然甘薯IbC4H相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括甘薯IbC4H蛋白的活性片段和活性衍生物。

[0029] 本发明的甘薯IbC4H多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与甘薯IbC4H DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗甘薯IbC4H多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含甘薯IbC4H多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括甘薯IbC4H多肽的可溶性片段。通常，该片段具有甘薯IbC4H多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

[0030] 在本发明中，“甘薯IbC4H保守性变异多肽”指与SEQ ID NO. 4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽的丙氨酸306位残基所在侧链、苯丙氨酸119位残基及苏氨酸120残基、天冬氨酸294位残基、苏氨酸310位残基、苯丙氨酸203位残基共同形成一个穴状的结构，其中苏氨酸和天冬氨酸参与水分子的氢键的连接，增加了结构的稳定性。丝氨酸苯丙氨酸丙氨酸是酶的结合位点，该催化中心含有水分子结合位点，氧元素结合位点及铁元素结合位点，虽然CAMP-CGMP结合位点和细胞色素P450血红素半胱氨酸铁元素结合位点的序列在IbC4H一级结构即氨基酸序列中相隔很远，但在空间结构上，位点距离较近，组成了典型的IbC4H蛋白催化结合区域。

[0031] 发明还包括甘薯IbC4H蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然甘薯IbC4H多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

[0032] 修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

[0033] 在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的甘薯IbC4H多肽时，可以将甘薯IbC4H编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成甘薯IbC4H蛋白表达载体。

[0034] 如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA; 如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列; 如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

[0035] 在本发明中，术语“宿主细胞”为原核或真核细胞。常用的原核宿主细胞包括BL21，常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、甘薯细胞和其它植物细胞。

[0036] 还可用荧光定量PCR技术分析甘薯IbC4H基因产物的表达，即分析甘薯IbC4H的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

[0037] 甘薯IbC4H RNA的Northern印迹分析和甘薯IbC4H特异抗体的Western印迹分析可以联合使用，以证实甘薯IbC4H在生物样本中的表达。

[0038] 此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有甘薯IbC4H核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码甘薯IbC4H的核酸分子。

[0039] 本发明还提供了检测样品中是否存在甘薯IbC4H核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于甘薯IbC4H核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

[0040] 此外，根据本发明的甘薯IbC4H核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选甘薯IbC4H同源基因或同源蛋白。

[0041] 为了得到与甘薯IbC4H基因相关的甘薯cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选甘薯32
cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用 P对甘薯IbC4H的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自甘薯的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech， Stratagene，Palo Alto， Cal.。这种筛选方法可以识别与甘薯IbC4H相关的基因家族的核苷酸序列。

[0042] 本发明的甘薯IbC4H核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

[0043] 一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

[0044] 此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸片段，然后再进行连接而获得编码本发明甘薯IbC4H蛋白的核酸序列。然后，可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

[0045] 除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart 等人，(1969) Solid-Phase Peptide Synthesis， WH Freeman Co.， San Francisco; Merrifield J. (1963) J. Am Chem. Soc 85: 2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City， CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

[0046] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

附图说明

[0047] 图1 IbC4H 基因功能验证图（表现的是甘薯细胞转化IbC4H前后的变化，A为非转化的细胞,B为转化后的细胞）。

具体实施方式

[0048] 实施例1

[0049] 甘薯IbC4H基因的克隆

[0050] 1．组织分离

[0051] 甘薯来源于重庆北碚西南大学，采取甘薯植物薯块、幼叶材料后，立即置于液氮中冷冻保存。

[0052] 2． RNA的分离

[0053] 参见RNA Plant Buffer使用说明，方法如下：

[0054] 1).取0.1 g甘薯叶子，在研钵（实验前用酒精灼烧10 min后冷却备用）中液氮研磨成细粉；

[0055] 2).迅速移入事先已加入0.5 mLRNA Plant Buffer的1.5 mL离心管中，振荡混匀；室温水平放置5 min；

[0056] 3).4 ℃，12000 rpm离心5-10 min后，将上清移入新的1.5 mL离心管；

[0057] 4).加入0.1 mL5 mol· L-1 5 mol· L-1NaCl溶液，温和混匀；

[0058] 5).加入0.3 mL氯仿，上下颠倒混匀；

[0059] 6).4 ℃，12000 rpm离心10 min，将上清移入新的1.5 mL离心管；

[0060] 7).加入与所得上清等体积的异丙醇温和混匀后室温放置10 min；

[0061] 8).4 ℃，12000 rpm离心10 min，小心除去上清后，加入1 mL 75%乙醇；

[0062] 9).4 ℃，5000 rpm离心3 min，倒出液体，余液用枪头吸干，室温晾干2-3 min；

[0063] 10).加入50 μL DEPC处理过的水溶解沉淀，检测纯度和浓度合格后，-70 ℃保存备用。

[0064] 3．基因的全长克隆

[0065] 根据曼地亚红豆杉和其它植物肉桂酸-4-羟化酶氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源性基因克隆原理，RT-PCR获得核心片段后再采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒)获得3'、5'序列，再拼接得到理论全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物R1: 5’-AATCCCTCTGATTATCCCACCTACC-3’(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸R2：5’- GCTTCATGACAATGGTAGAGTGCTTC -3’(SEQ ID NO.2)为反向引物，以甘薯总RNA为模板， 进行RT-PCR扩增，R1/R2的PCR条件为94℃ 10分钟，随之以94℃ 45秒、64.5℃45秒和72℃ 1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1668 bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO. 3所示的序列。

[0066] 实施例2

[0067] 甘薯IbC4H基因的序列生物信息学分析与功能验证

[0068] 本发明的甘薯IbC4H全长cDNA的长度为1668 bp，详细序列见SEQ ID NO. 3，其中开放读框位于66-1584位核苷酸。根据全长cDNA推导出甘薯IbC4H的氨基酸序列，共312个氨基酸残基，分子量为58.16 Da，pI为9.23。详细序列见SEQ ID NO. 4。

[0069] TargetP分析结果显示IbC4H定位于细胞质。GOR4在线工具预测甘薯基因C4H基因的氨基酸序列二级，结果如图所示，IbC4H多肽链中，含有44.55%的α-螺旋，13.47%的延伸链，和41.98%的无规则卷曲。α-螺旋和无规则卷曲是IbCHS蛋白最大量的结构元件，而延伸链则散布于整个蛋白中。

[0070] 在PROSITE中分别预测IbC4H的Motif，发现IbCHS含有7个重要的基序，分别是N-糖基化位点(57～60 NLTD，272～275)，依赖于CAMP-CGMP蛋白激酶磷酸结合位点(262～265 KKLS)，蛋白激酶C磷酸化位点(111～113 TGK，139～141 TNK，266～268 STK，274～276 SLK，351～353 THK，364～366 TLR，409～411 TWK，482～484 TEK.)，酪蛋白激酶II 磷酸化位点( 82～85 SSPE，197～200 SEED，347～350 TEPD，477～480 SKVD.)，N-豆蔻酰化位点( 12～17 GLFFAI，95～100 GVEFGS，269～274 GMDNNS，343 ～348 GVQLTE，449～454 GIILAL，458～463 GIVLGR，485～490 GGQFSL)，酰胺化位点(27～
30 RGKK，442～445 VGRR.)，细胞色素P450血红素半胱氨酸铁元素结合位点(440～449 FGVGRRSCPG)。

[0071] 丙氨酸306位残基所在侧链，苯丙氨酸119位残基及苏氨酸120残基，天冬氨酸294位残基，苏氨酸310位残基，苯丙氨酸203位残基共同形成一个穴状的结构，其中苏氨酸和天冬氨酸参与水分子的氢键的连接，增加了结构的稳定性。细胞色素P450血红素半胱氨酸铁元素结合位点(440～449 FGVGRRSCPG)也恰好在此位置，丝氨酸苯丙氨酸丙氨酸是酶的结合位点，该催化中心含有水分子结合位点，氧元素结合位点及铁元素结合位点，和Stefaan Sansen等关于人类细胞色素P450的氧化及相关结构模型研究结构相一致，进一[108-109]
步证明所克隆的基因属于细胞色素P450家族成员 。虽然CAMP-CGMP结合位点和细胞色素P450血红素半胱氨酸铁元素结合位点的序列在IbC4H一级结构即氨基酸序列中相隔很远，但在空间结构上，位点距离较近，组成了典型的IbC4H蛋白催化结合区域[0072] 实施例3

[0073] 甘薯IbC4H基因的序列导入植物（实例中为甘薯品种渝苏8号）

[0074] 将含肉桂酸-4-羟化酶基因的中间载体，进一步克隆到植物双元表达载体（如pCAMBIA1380）中，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌（如EHA105、LBA4404、A4、R1000、ATCC15834等）中，转化甘薯胚性细胞，转化方法按照Zhang Peng等在Plant Science(2011)的文献上等在方法进行。

[0075] 用PCR和Southern blotting检测转基因再生植株，阳性植株在5月移栽大田，8-10月采样用荧光定量PCR检测转基因甘薯肉桂酸-4-羟化酶基因的表达水平和按照HPLC法（夏效东，2010）测定花色苷含量。

[0076] 由图1可以看出，在甘薯胚性细胞中表达IbC4H后，受体细胞的颜色加深，荧光定量PCR检测后表明IbC4H的表达量增加，含量测定表明花色苷积累量增加，以此验证了IbC4H蛋白的功能，转入IbC4H后花色苷的前体物质含量增加，推动代谢流往下游流动，生产更丰富的花色苷。