一种纵切幼苗叶基座转化小麦的方法

摘要

本发明提供了一种农杆菌介导的纵切幼苗叶基座转化小麦的转基因方法，包括（a）浸泡小麦种子使之吸水饱和，培养胚轴至长1～2cm；（b）将含有目的基因的农杆菌用含有细胞分裂素KT、植物生长素2,4-D、抗氧化剂DTT和L-Cysteine渗透培养基悬浮；（c）幼苗浸泡在渗透培养基中，用11号手术刀在小麦的叶基座中间部位纵切致伤；（d）致伤处理后的小麦幼苗浸没在渗透培养基中培养；（e）处理好的小麦幼苗在吸水纸上空干，栽入大棚中培养。该方法是一种无需经过组织培养阶段的农杆菌介导的小麦转化方法，具有比较高的实际应用价值和推广前景。

权利要求

1.一种农杆菌介导的纵切幼苗叶基座转化小麦的转基因方法，包括以下步骤：（a）浸泡小麦种子使之吸水饱和，培养胚轴至长1～2cm;（b）将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮，所述渗透培养基含有细胞分裂素

0.1-4mg/L的KT、0.5-5mg/L的植物生长素2,4-D、0.5-5mM/L的抗氧化剂DTT和100～

400mg/L的L-Cysteine;

（c）幼苗浸泡在渗透培养基中，用11号手术刀在小麦的叶基座中间部位纵切致伤;（d）致伤处理后的小麦幼苗浸没在渗透培养基中，28℃、24小时黑暗条件下140～

170rpm培养15～30min;

（e）处理好的小麦幼苗在吸水纸上空干，种入蛭石营养土混合土中25～28℃黑暗条件下培养2天，然后栽入大棚中培养。

2.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于：步骤(a)所述的培养胚轴的培养条件为25℃、14小时光照10小时黑暗、保湿，培养时间为2～3天。

3.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于：所述含有目的基因的农杆菌是将目的基因插入表达载体，再将该载体导入农杆菌中。

4.根据权利要求3所述的转基因方法，其特征在于：所述表达载体为pBin系列载体、pBI系列载体、Gateway系列载体、pCAMBIA系列载体。

5.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于所述农杆菌为AGL0、AGL1、GV3101、EHA105、LBA4404。

6.根据权利要求1所述的小麦转基因方法，其特征在于步骤(c)所述的用11号手术刀在小麦的叶基座中间部位纵切致伤，具体操作为：用11号手术刀的刀尖插入叶基座的中央部位，刀刃向基部方向轻轻斜拉出，纵切伤口长度为1-2mm，不要穿透叶基座，使小麦植株是完整的。

7.根据权利要求1～6任一权利要求所述的转基因方法，其特征在于，所述小麦为栽培或野生小麦品种、品系、育种材料或中间材料。

说明书

一种纵切幼苗叶基座转化小麦的方法

技术领域

[0001] 本发明属于小麦转基因领域，涉及一种农杆菌介导的，纵切幼苗叶基座转化小麦的方法。

背景技术

[0002] 小麦是总产量占第二位的粮食作物，在世界各地广泛种植。随着世界人口的增长和人们生活水平的提高，人们对小麦的需求量越来越大，对小麦品质的要求也越来越高。常规育种已不能满足人们对小麦品种和品质的要求。转基因技术的发展打破了常规育种的种族限制，许多作物比如玉米、油菜等利用转基因技术已经成功培育出了优质、高效的转基因新品种。与其他作物相比，小麦的转基因育种相对滞后，转基因成功的例子较少，这由于小麦组织培养植株的再生频率低，建立稳定高效的再生体系比较困难；另一方面，小麦是多倍体作物，基因组大，遗传背景复杂，遗传转化体系不完善。目前，小麦转基因的方法主要有花粉管通道法、基因枪法、PEG介导法以及农杆菌介导法。

[0003] 花粉管通道法是利用植物授粉后花粉萌发形成的花粉管，将外源DNA导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中。该方法具有操作简单、耗费低廉、不需要经过繁琐的组织培养过程等优点，但是目前该方法尚不成熟，DNA的导入时间和部位往往会影响植株的结实率，最终很难得到转基因后代。基因枪法是小麦转基因育种的主要方法，在获得的小麦转基因植株的报道中，基因枪法占了绝大多数，这主要由于该方法不受作物基因型的限制、方法相对简单，目前基因枪介导的小麦转化体系已经比较完善。但是基因枪法需要经过复杂的组织培养和植株再生过程，成本花费高、周期长，不利于转基因小麦的产业化。PEG法主要是以原生质体为受体的转化方法，由于小麦的原生质体再生困难，限制了该方法的使用。

[0004] 由于小麦不是农杆菌的天然宿主、谷物类作物对农杆菌没有伤感反应等原因，农杆菌介导的小麦转化一直是摆在分子生物学家和育种学家面前的一道难题。后来人们虽然实现了农杆菌介导的小麦转化，但是受到基因型、组织培养条件、外植体类型、农杆菌菌株等限制，目前农杆菌介导的小麦转化效率低，需要组织培养和植株再生阶段，周期比较长，不利于产业化的发展。由于农杆菌转化方法具有易操作、低费用、高效率、插入片段的确定性好、拷贝数低等独特优点，因此通过研究来提高农杆菌的转化效率具有主要的意义。本发明提供了一种农杆菌介导的小麦活体转化方法，除了具有上述农杆菌转化的通用优点外，还具有转化植株存活率高、不需经过复杂的组织培养等优越性，具有很高的实际操作性和市场推广价值。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种纵切幼苗叶基座转化小麦的转基因方法，包括以下步骤：

[0006] （a） 浸泡小麦种子使之吸水饱和，培养胚轴至长1～2cm。

[0007] （b） 将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮，所述渗透培养基含有细胞分裂素KT、植物生长素2,4-D、抗氧化剂DTT和L-Cysteine。

[0008] （c） 幼苗浸泡在渗透培养基中，用11号手术刀在小麦的叶基座中间部位纵切致伤。

[0009] （d） 致伤处理后的小麦幼苗浸没在渗透培养基中，28℃黑暗条件下 140～[0010] 170rpm培养15～30min。

[0011] （f） 处理好的小麦幼苗在吸水纸上空干，种入蛭石营养土混合土中25～28℃黑暗条件下培养2天；然后栽入大棚中。

[0012] 本发明使用的渗透培养基里添加了生长素2,4-D、激动素(KT)、抗氧化剂DTT和L-Cysteine、这些添加剂能够显著提高小麦的转化效率。本发明所有的渗透培养基植物生长素2,4-D的优选用量为0.5-5mg/L，细胞分裂素KT的优选用量为0.1-4mg/L，抗氧化剂DTT的优选用量为0.5-5mM/L，L-Cysteine的优选用量为100～400mg/L。

[0013] 本发明含有目的基因的农杆菌的获得，是将目的基因插入表达载体，再将该载体导入农杆菌中。常用的表达载体包括但不限于：pBin系列载体、pBI系列在、Gateway系列载体、pCAMBIA系列载体；常用的农杆菌菌株包括但不限于：AGL0、AGL1、GV3101、EHA105、LBA4404等。

[0014] 本发明人研究发现小麦幼苗的培养时间以及胚轴的长度是影响小麦的转化[0015] 效率的一个重要因素。本发明中所用的小麦幼苗是在25 ℃、14小时光照10小时黑暗、保湿条件培养2~3天，小麦胚轴的长度为1-2cm。这种状态下生长的小麦幼苗纵切后植株的生长状态是最好的，转化效率也是最高。

[0016] 小麦幼苗的致伤位置和方式是影响小麦转基因效率的另一个重要因素。本发明人经过长期艰苦的实验发现纵切部位为小麦幼苗的叶基座时转化效率最高，具体操作为用11号手术刀的刀尖插入叶基座的中央部位，刀刃向基部方向轻轻斜拉出，纵切伤口长度优选为1-2mm。刀刃不能穿透叶基座。在整个致伤过程中，小麦的幼苗植株是完整的，所以本发明中小麦纵切转化后植株的生长状态良好，能够得到高转化效率的转基因后代。

[0017] 在本发明中，纵切小麦幼苗的叶基座，在其中间位置制造伤口，基座内部的叶原基被分割成两部分，在后来的生长发育过程中，原来的小麦幼苗发育成一个由2个并行植株组成的小麦。所以，采用本发明转化小麦所得到的T0代转基因小麦为2个并行植株组成的小麦。因为纵切力度的不同和位置的偏差， T0 转基因小麦的2个并行植株存在3种情况：一种是2个并行植株大小差别不大，并行生长；另外一种是2个并行植株中一个生长比较健壮，另一个生长相对弱小，并行生长；还有一种是2个并行植株中一个生长健壮，另一个生长弱小，随着生长发育的进行，弱小的植株逐渐退化。

[0018] 本发明所提供的纵切小苗幼苗叶基座转化小麦的转基因方法是一种农杆菌介导的活体转化方法，操作简便、转化效率高、不需经过复杂而漫长的组织培养阶段、转化后小麦生长状态良好，具有非常大的实际应用价值和市场推广前景。为了便于理解，下面将结合附图和实施例进一步诠释本发明。具体实例和附图仅是为了更好的阐述本发明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

[0019] 图1为T0代转基因小麦草丁膦涂抹实验筛选结果示图，其中A图为转基因阴性植株，B图为转基因阳性植株。红色箭头所指方向为草丁膦涂抹的叶片部位。

[0020] 图2为由2个并行植株组成的T0代转基因小麦的三种存在状态。其中图A所示为2个并行植株大小差别不大，并行生长；图B所示为2个并行植株中一个生长比较健壮，另一个生长相对弱小，并行生长；图C所示的情况为2个并行植株中一个生长健壮，另一个生长弱小，随着生长发育的进行，弱小的植株逐渐退化。

[0021] 图3为T1代转基因小麦草丁膦喷洒实验筛选结果，红色箭头标注的为筛选到的转基因阳性植株。

[0022] 图4为T1代转基因小麦的PCR检测结果，其中泳道M为marker，+是以质粒为模板的正对照，-为野生型负对照，1～7为检测的7个转基因小麦。

[0023] 图5为T1代转基因小麦的southern检测结果，其中泳道1～7为转基因小麦，+为质粒的正对照，-为野生型负对照。

具体实施方式

[0024] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell, David W.，rd
Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3 edition，2001，NY，Cold Spring Harbor）。
所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。

[0025] 实施例 一、纵切幼苗叶原基转化小麦

[0026] 1. 实验材料

[0027] 质粒：含有bar基因，带有潮霉素筛选标记基因的pcambia1300-bar载体，具有抗草铵磷除草剂。PCR扩增bar基因连接到pcambia1300（购自Invitrogen公司）载体上得到pcambia1300-bar载体。

[0028] 农杆菌菌株：AGL0。

[0029] 供转化的小麦品种：京麦9158

[0030] 2.农杆菌的培养

[0031] 挑取甘油冻存的含有目的基因的农杆菌，于YEB平板上画线，28℃黑暗培养箱培养2天。挑取单菌落接种于40ml 抗性YEB液体培养基中，28℃黑暗摇床200rpm摇过夜，至OD600≈1。吸取上述培养物250～300μl涂布于平板直径为15cm 的YEB固体培养基上，28℃黑暗培养箱培养2天后，此备用的新鲜平板当天使用，约20℃室温黑暗待用，不要继续存留于28℃黑暗培养箱或转存于4℃冰箱。

[0032] 3. 渗透培养基的制备

[0033] 首先按照下述配方配制AA培养基。

[0034] AA培养基配制(1L)：

[0035] MgSO4 0.12209g

[0036] KCl 2.95g

[0037] NaH2PO4·2H2O 0.15g

[0038] 肌醇 0.1g

[0039] 谷氨酸 0.876g

[0040] 天门冬氨酸 0.266g

[0041] 精氨酸 0.174g

[0042] 酪蛋白水解物 0.3g

[0043] 蔗糖 20g

[0044] 铁盐溶液 5ml ①EDTA-2Na 7.46g/L 调pH=8.0

[0045] ②再加4.5ml/L 5M NaCl

[0046] ③FeSO4·7H2O 5.56g/L

[0047] CaCl2溶液 4.5ml 25.06g/L

[0048] VB1溶液 10ml 1g/L

[0049] VB6溶液 1ml 1g/L

[0050] 烟酸溶液 1ml 0.1g/L

[0051] B5微量 1ml MnSO4·H2O 7.58g/L

[0052] ZnSO4·7H2O 2.0g/L

[0053] H3BO3 3.0g/L[0054] KI 0.75g/L

[0055] Na2MoO4·2H2O 0.25g/L

[0056] CuSO4·5H2O 0.025g/L

[0057] CoCl2·6H2O 0.025g/L

[0058] 在1L AA培养基中添加下列成分：

[0059] As（100～200μM ）； KT（0.2mg）； 2,4-D（1mg）；DTT（1mM ）； L-Cysteine（200～400mg）；silwet-L77（100～400μl）。

[0060] 将培养好的农杆菌用上述渗透培养基悬浮，使悬浮菌液的OD600值为0.4～0.7，pH至5.0～5.5，转化渗透培养液制备完毕。

[0061] 4. 植株选择准备

[0062] 浸泡小麦种子使之吸水饱和后25 ℃，14小时光照10小时黑暗，保湿条件下萌发3～4天，每天早晚各清洗一次，至胚轴长至1～2cm。

[0063] 5. 农杆菌菌液浸染小麦幼苗叶基座

[0064] （1）幼苗浸泡在上述渗透培养基中，用11号手术刀的刀尖插入叶基座的中央部位，刀刃向基部方向轻轻斜拉出，纵切伤口长度为1-2mm，不要穿透叶基座，使小麦植株是完整的；

[0065] （2）致伤处理后的小麦幼苗浸没在渗透培养基中，28℃，24小时黑暗条件下140～170rpm培养 15～30min；

[0066] （3）侵染后的小麦幼苗在吸水纸上空干，随后种入湿润的蛭石+营养土（2：1）混合土中，覆土，25～28℃，24小时黑暗条件下培养2天，然后移栽到大棚中培养。

[0067] 实施例 二、小麦转基因阳性植株的检测以及获得

[0068] 1、T0代转基因阳性苗的筛选以及获得

[0069] 用农杆菌介导的纵切小麦幼苗叶基座的转基因方法得到的T0代转基因植株为嵌合体，植株的部分器官含有目的表达，具有目标表型。因载体含有目的基因bar，如果转基因成功，bar插入小麦基因组，使转基因阳性植株的部分器官具有草铵磷抗性。所以，我们通过草丁膦检测实施例一中的转基因小麦的叶片来筛选T0代阳性转基因植株。在叶片中部用Mark笔横道标记，用棉签沾取草丁膦溶液(Basta 100mg/L + silwet-L77 200μl/L)均匀涂抹在标记的外端，涂抹第3片到第六片真叶，每次的涂抹量使叶片湿润而不溢流。5-6天后不具抗性的植株表现萎蔫、枯黄等明显的药害反应。三片真叶均表现草铵磷药害反应的，认定为转基因阴性植株，有一片及以上叶片表现草丁膦抗性的，认定为转基因阳性植株（图1）。T0代的转基因小麦是由2个并行植株组成的小麦。因为纵切力度的不同和位置的偏差， T0 转基因小麦的2个并行植株存在3种情况：一种是2个并行植株大小差别不大，并行生长；另外一种是2个并行植株中一个生长比较健壮，另一个生长相对弱小，并行生长；
还有一种是2个并行植株中一个生长健壮，另一个生长弱小，随着生长发育的进行，弱小的植株逐渐退化（见图2）。

[0070] 我们利用涂抹法筛选得到320株T0代阳性植株。得到的将阳性植株移栽入土壤中，在大棚条件下培养，直至种子成熟收获T1代种子。

[0071] 2. T1代筛选除草剂抗性植株

[0072] 将收获的T1代种子播种到适于小麦生长的土壤中(播种量达20Kg/亩)，待第3片真叶完全展开，喷洒草丁膦溶液(Basta 150mg/L + silwet-L77 200μl/L，除草剂喷洒量达到90L/亩)，7-10天后药害情况稳定，对草丁膦表现抗性的植株为转基因阳性植株（图3）

[0073] 3. T1代转基因植株的PCR检测

[0074] 对T1代草丁膦筛选的抗性植株，进行PCR检测实验进一步验证转基因是否成功。转基因阳性植株因成功转化bar基因而表现草丁膦抗性。根据bar基因的序列，设计PCR扩增引物，进一步验证转基因株系的阳性。每株取一片次新完全展开叶片采用CTAB法提取植物基因组DNA。根据bar基因的序列，设计PCR扩增引物序列如下：

[0075] 引物1（上游）： 5´ TCATCAGATTTCGGTGACGG 3´

[0076] 引物2（下游）： 5´ TCAACTTCCGTACCGAGCCG 3´

[0077] 分别利用引物1和引物2，以抗性植株基因组DNA模板，扩增bar基因片段。

[0078] 扩增体系和程序为：

[0079] 10X Buffer ： 2ul；

[0080] 10mM dNTP ： 0.5ul；

[0081] 10uM引物1 ： 0.5ul；

[0082] 10uM引物2 ： 0.5ul；

[0083] genomic DNA ： 10pg；

[0084] Taq DNA Polymerase(5U/ul)：0.4ul；

[0085] ddH2O：补足 20ul。

[0086] PCR反应条件为：

[0087] 预变性： 95℃, 5min；

[0088] 变性： 94℃, 20sec；

[0089] 退火： 55℃， 30sec；

[0090] 延伸： 72℃， 1min；

[0091] 30个循环；

[0092] 再延伸： 72℃， 10min。

[0093] 反应结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，可以检测到450bp的目的片段（结果见图4）。我们对10个株系进行了PCR实验，结果全部呈阳性。这进一步证明了我们获得的抗性植株为转基因阳性株系。

[0094] 4. T1代阳性植株的Southern blot检测

[0095] 为了确定目标bar基因确实整合到了小麦的基因组上，以及整合的拷贝数，我们进一步进行Southern blot检测。根据bar基因的序列，设计Southern blot的探针模板引物如下：

[0096] 引物3（上游）： 5´ TCATCAGATTTCGGTGACG 3´

[0097] 引物4（下游）： 5´ ATGAGCCCAGAACGACGC 3´

[0098] 取小麦新长出的嫩叶，CTAB法提取植物基因组DNA。利用引物3和引物4扩增得到的片段制作bar探针,PCR扩增反应条件同上。Southern检测为本领域常规做法。我们检测了7个T1代小麦，得到了5个单拷贝插入的转基因阳性植株，检测结果如图5示。