大豆疫霉无毒基因Avr5的标记

摘要

本发明涉及了一种大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)无毒基因Avr5的特异分子标记CAPS-80316和CAPS-80295，属于生物技术领域。通过利用CAPS(Cleaved AmplifiedPolymorphic Sequence)分子标记技术，对大豆疫霉病菌两个亲本菌株(P6497，P7064)及其94个杂交后代群体进行无毒基因分子标记的筛选和鉴定；获得2个与大豆疫霉无毒基因Avr5共分离的分子标记。本发明不仅可以研究无毒基因Avr5在自然群体中的分布情况，揭示大豆疫霉菌在田间致病型分化变异的特点，而且可以为克隆该无毒基因、并最终鉴定大豆抗疫霉菌基因Rps5提供便利。

权利要求

1.一种检测大豆疫霉菌株中无毒基因Avr5的分子标记引物，其特征在于：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种检测大豆疫霉菌株中无毒基因Avr5的分子标记引物，其特征在于：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种鉴定大豆疫霉菌株中无毒基因Avr5基因型的分子标记方法，其特征在于：利用权利要求1所述的引物扩增待测大豆疫霉菌基因组DNA，对扩增产物用ScaI酶进行酶切，如果仅获得475bp的片段，表明待测大豆疫霉菌基因组含Avr5的纯合体；若获得157bp和

318bp的两种片段，表明待测大豆疫霉菌基因组不含有Avr5；若获得157bp、318bp和475bp三种片段，表明待测大豆疫霉菌基因组是含有Avr5的杂合子。

4.一种鉴定大豆疫霉菌株中无毒基因Avr5基因型的分子标记方法，其特征在于：利用权利要求2所述的引物扩增待测大豆疫霉菌基因组DNA，对扩增产物用EcoRI酶进行酶切，如果仅获得373bp的片段，表明待测大豆疫霉菌基因组含Avr5的纯合体；若获得150bp和

217bp的两种片段，表明待测大豆疫霉菌基因组不含有Avr5；若获得150bp、217bp和373bp三种片段，表明待测大豆疫霉菌基因组是含有Avr5的杂合子。

说明书

大豆疫霉无毒基因Avr5的标记

技术领域

[0001] 本发明涉及大豆疫霉无毒基因的标记，具体涉及与大豆疫霉无毒基因Avr5紧密联锁的两个分子标记基因CAPS-80316和CAPS-80295，以及在无毒基因标记过程中所用的标记方法。

背景技术

[0002] 大豆疫霉菌属于鞭毛生物界卵菌门霜霉亚纲、腐霉目、腐霉科、疫霉属(Tyler，2007).疫霉属包含有80多个疫霉种，很多种都是农业生产上重要的病原菌。与多数疫霉种不同，大豆疫霉菌的寄主范围非常窄，主要侵染大豆，此外仅能侵染羽扇豆属(Lupinus spp.)的几种植物。大豆疫霉菌侵染大豆，引起幼苗的猝死和成株的根腐，是世界范围内大豆生产的主要威胁之一。每年给世界范围内的大豆生产造成直接经济损失高达十几亿美元(Tyler，2007)。该病于1948年首次在美国的印地安那州发现，而后相继在澳大利亚、加拿大、巴西、阿根廷、日本、意大利、新加坡、俄罗斯、白俄罗斯、乌克兰、哈萨克斯坦、匈牙利、德国、英国、法国、瑞士、新西兰、埃及、尼日利亚、印度等国家都发现了该病害(Schmitthenner，1985；Wrather et al.，2001)。我国1989年由沈崇尧和苏彦纯(1991)首次在东北大豆主产区分离到该病原菌，之后在黑龙江、吉林、北京、山东、安徽、河南、江苏、浙江、内蒙古、湖北、福建、新疆、四川、天津和贵州(苏彦纯等，1993；朱振东等，2003；徐静静等，2009；唐庆华等，2009)等15个省(市区)也相继被报道分离鉴定到大豆疫霉菌。其中在黑龙江和福建两省发生较为严重，其他省份零星发生，目前仍是我国重要的对外检疫对象。

[0003] 在植物与卵菌的长期协同进化过程中，卵菌为了成功侵染植物，分泌大量效应分子(effectors)到植物细胞的不同部位来破坏或延缓植物的防卫反应(Birch et al.，2006；Kamoun，2006；Vleeshouwers et al.，2008)。大量研究表明大部分卵菌病害的发生符合Flor的“基因对基因”假说，因此，与很多植物病原细菌和真菌一样，卵菌中也存在一类效应分子可以被寄主植物的抗病基因产物(R protein)识别，从而引发强烈的植物免疫反应进而阻止病害的发生，而编码这类效应分子的基因被称为无毒基因(Avr gene)。卵菌分泌的Avr protein与寄主植物的R protein之间的相互作用直接决定着卵菌病害的发生，因此，围绕Avr基因的研究一直是卵菌病害研究的重点之一。以前，卵菌Avr基因的研究主要集中在Avr基因的鉴定以及分子标记上，最近，由于疫霉菌基因组序列的公布以及基因枪等新技术的广泛使用，十多个卵菌Avr基因陆续被克隆。目前，已经克隆到的卵菌NdWsB
Avr基因包括来自来Hyaloperonospora arabidopsis的ATR1 和ATR13；自P.infestans的PiAvr3a、PiAvr4、PiAvrblb1和PiAvrblb2，以及来自P.sojae的PsAvr1b，PsAvr1a，PsAvr3a、PsAvr3c和PsAvr4/6(Allen et al.，2004；Shan et al.，2004；Armstrong etal.，
2005；Rehmany et al.，2005；van Poppel et al.，2008；Vleeshouwers et al.，2008；Dong etal.，2009；Qutob et al.，2009；Sang-Keun et al.，2009；Dou et al.，2010)。此外这些Avr基因在基因和基因组结构上的特征、进入植物细胞的转运机理以及在植物病害中具有的毒性功能研究也成为研究热点。从卵菌无毒基因的克隆入手，探索无毒基因的起源和进化，明确其在病菌致病过程中的功能，了解无毒基因和抗病基因之间的协同进化机理，对于近一步认识和防治该类病害具有重要意义。

[0004] 前人发现大豆疫霉菌无毒基因Avr5和Avr3a位于同一个连锁群上，两者之间的遗传距离为4.5cM(May et al，2002)。Avr3a最近已经被克隆，该基因编码一个长度为112氨基酸的外泌蛋白，这为进一步寻找无毒基因Avr5提供了线索。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、快速鉴定大豆疫霉无毒基因Avr5的分子标记、方法及其引物，筛选获得与无毒基因Avr5紧密连锁的分子标记。

[0006] 本发明提供的技术方案是：一种检测大豆疫霉菌株中无毒基因Avr5的分子标记引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0007] 一种大豆疫霉菌株中无毒基因Avr5的分子标记方法，利用上述的引物扩增待测大豆疫霉菌基因组DNA，对扩增产物用ScaI酶进行酶切，如果仅获得475bp的片段，表明待测大豆疫霉菌基因组含Avr5的纯合体；若获得157bp和318bp的两种片段，表明待测大豆疫霉菌基因组不含有Avr5；若获得157bp、318bp和475bp三种片段，表明待测大豆疫霉菌基因组是含有Avr5的杂合子。

[0008] 本发明提供另一种检测大豆疫霉菌株中无毒基因Avr5的分子标记引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0009] 本发明提供另一种大豆疫霉菌株中无毒基因Avr5的分子标记方法，利用上述的引物扩增待测大豆疫霉菌基因组DNA，对扩增产物用EcoRI酶进行酶切，如果仅获得373bp的片段，表明待测大豆疫霉菌基因组含Avr5的纯合体；若获得150bp和217bp的两种片段，表明待测大豆疫霉菌基因组不含有Avr5；若获得150bp、217bp和373bp三种片段，表明待测大豆疫霉菌基因组是含有Avr5的杂合子。

[0010] 利用已经完成测序并公布的大豆疫霉菌基因组数据库(http://genome.jgi-psf.org/annotator/servlet/jgi.annotation.Annotation？pDb＝Physo1_1)，确定已知无毒基因Avr3a在基因组数据库中的序列位置为Scaffold_80：300039-300374，Avr5和Avr3a之间的遗传距离为4.5cM。

[0011] 利用大豆疫霉菌基因组数据库的查询和下载功能，下载Scaffold_80：280000-320000的40kb基因组区域内的核苷酸序列，通过其网站找到基因间隔区(Intergenic Region)，并针对这些区域设计扩增长度为1000bp的引物并进行PCR扩增，通过PCR扩增从两个亲本菌株的基因组DNA分别纯化回收产物，送公司测序。

[0012] 通过测序回来的结果，利用Lasergene中的Seqman程序寻找序列的替代突变，或者插入/缺失突变位点，再通过SeqBuilder软件寻找差异的酶切位点，然后对先前对应的PCR产物进行酶切，电泳确定差异片段从而获得优质CAPS分子标记。

[0013] 同时利用分别含有Avr5和不含有Avr5基因的大豆疫霉菌株杂交产生F1代杂合子，再自交产生94个F2代，将这些F2代菌株接种到L85-3059(含Rps5抗病基因)的大豆上，确定这些菌株的毒性，同时利用已经获得的CAPS分子标记在F2代不同位点上进行标记。

[0014] 综合致病性测定和CAPS标记结果对F2代表现型和基因型进行比较，发现CAPS-80316和CAPS-80295两个分子标记和Avr5的表现型在94个F2代中是完全一致的，从而确定这两个分子标记与该无毒基因Avr5紧密联锁。

[0015] 与现有的分子标记技术相比，其优点和积极效果表现在：

[0016] 本发明不仅可以研究无毒基因Avr5在自然群体中的分布情况，揭示大豆疫霉菌在田间致病型分化变异的特点；比较国内外大豆疫霉菌在此位点上的差异，澄清中国大豆疫霉群体起源于国外；可以研究无毒基因Avr5及共同连锁的Avr3a无毒基因的起源、进化、变异的过程；本发明确定的两个标记可以为克隆无毒基因Avr5提供良好的线索、并最终鉴定大豆抗疫霉菌基因Rps5提供科学帮助，有助于科学家进行大豆抗病品种的选育。

附图说明

[0017] 图1：CAPS-80316和CAPS-80295分子标记的酶切图谱。

[0018] 图2：CAPS-80295在R2(P6497)菌株和R7(P7064)菌株中核苷酸序列的比对。

[0019] 图3：CAPS-80316在R2(P6497)菌株和R7(P7064)菌株中核苷酸序列的比对。

具体实施方式

[0020] 下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

[0021] 实施例1

[0022] 1、供试菌株

[0023] 大豆疫霉全基因组测序菌株R2(P6497)和R7(P7064)为Mark Gijzen研究员(加拿大农业部南方作物保护研究所)馈赠，由南京农业大学植病系真菌分子生物学实验室保存。该两个菌株公开于Qutob D，Tedman-Jones J，Dong S，Kuflu K，Pham H，et al.(2009)Copy number variation and transcriptional polymorphisms of Phytophthora sojaeRXLR effector genes Avrla and Avr3a.PLoS One 4：e5066。菌株保存于10％V8固体培养基，保存温度为14℃。

[0024] 其中，R2菌株系含有Avr5的纯合体，R7菌株系不含有Avr5的纯合体。

[0025] 2、设计CAPS标记

[0026] 利用大豆疫霉菌基因组数据库的查询和下载功能，下载Avr3a所在区域Scaffold_80：280000-320000的40kb基因组区域内的核苷酸序列，通过其网站找到基因间隔区(Intergenic Region)，并针对这些区域设计能扩增1000bp产物的引物并进行PCR扩增，通过PCR扩增从两个亲本菌株的基因组DNA分别纯化回收产物，测序。通过测序结果，利用Lasergene中的Seqman程序寻找序列的替代突变，或者插入/缺失突变位点，再通过SeqBuilder软件寻找差异的酶切位点，然后对先前对应的PCR产物进行酶切，电泳确定差异片段从而获得如表1所示优质CAPS分子标记及引物。CAPS-80316的标记引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。CAPS-80295标记的引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。CAPS-80295标记在R2(P6497)菌株中的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，在R7(P7064)菌株中的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；CAPS-80316标记在R2(P6497)菌株中的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，在R7(P7064)菌株中的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

[0027] 表1

[0028]

[0029] 3、供试大豆幼苗的准备

[0030] 鉴别寄主大豆播种于装有蛭石(d＝2-4mm)的塑料花盆(d＝10cm)中，每盆种12粒种子，放入24-28℃、14h光照(强光照射)/10h黑暗的温室中生长，7天后两片真叶长出但未展开，间苗使每盆10颗幼苗并充分浇水用于接种。所用大豆鉴别寄主L85-3059由加拿大农业部南方作物保护研究所Mark Gijzen实验室提供，感病对照品种为Williams。

[0031] 4、大豆疫霉菌致病性的测定

[0032] 采用下胚轴伤口接种法(Qutob et al，2009)，测定大豆疫霉菌株对鉴别寄主的毒性。大豆疫霉菌株在LBA平板上黑暗25℃培养7天，之后切成2mm×3mm的小块作为接种体；用解剖刀在大豆幼苗的子叶下1cm处向下划约0.5cm长的伤口，然后将接种体菌丝面朝内贴在伤口处。接种后保湿12h，然后放入24-28℃、14h光照(强光照射)/10h黑暗的温室中，5天后调查结果。每个鉴别寄主接种10株，以植株死亡率作为抗感的分类标准，植株死亡率≤30％，记为抗病(A)；植株死亡率≥70％，记为感病(V)；植株死亡率在30％-70％之间，记为中间类型(I)(Ryley et al.，1998)。致病性试验结果重复3次。

[0033] 5、基因组DNA的提取

[0034] 采用 CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide) 法提 取 大豆 疫 霉基 因 组DNA(Doyle&Doyle，1987)，具体操作如下：

[0035] (1)取大约50mg冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml EP管中，加入900μl 2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液(2％CTAB；100mmol/L Tris-HCl，PH 8.0；20mmol/L EDTA，PH8.0；1.4mol/L NaCl)和90μl 10％SDS(十二烷基苯磺酸钠)后漩涡混合器上充分混匀；

[0036] (2)55-60℃水浴1h，每15min振荡混匀一次；

[0037] (3)12000rpm/min离心10min，取上清液，加等体积的酚\氯仿\异戊醇(25∶24∶1)提1次；

[0038] (4)12000rpm/min离心10min，吸取上清液，加等体积氯仿抽提1次；

[0039] (5)12000rpm/min离心10min，吸取上清液，加0.1×体积的3MNaAC溶液和2×体积的冰无水乙醇过夜沉淀基因组DNA；

[0040] (6)用预冷的70％乙醇洗涤两次，然后置37℃下干燥；

[0041] (7)干燥后的DNA用40μl 1×TE(10mmol/L Tris-HCL，0.1mmol/L EDTA，PH8.0)溶解后(TE中含50μg/ml RNase)，于37℃静置1h降解RNA；

[0042] (8)取2μl DNA样品在1％的Agarose胶上电泳，紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并稀释至约25ng/μl后-20℃冰箱中备用。

[0043] 6、PCR扩增和酶切检测

[0044] 采用含CAPS标记CAPS-80316和CAPS-80295的两对CAPS分子标记引物扩增获得的分子标记在两个亲本中进行与无毒基因Avr5连锁标记的筛选。CAPS标记的PCR反应体系为：反应总体积25ul，其中2.5ul PCR Buffer，0.5ul Mg2+，两条引物(各0.25ul)，rTaq酶(TAKARRA)0.1ul，dNTP 0.4ul，基因组模板0.1-0.5ng，ddH2O为20ul.具体反应程序为：98℃30s，58℃30s，72℃40s，扩增35个循环。取5ul PCR产物，加入内切酶0.2ul，酶切Buffer 1ul，ddH2O为3.8ul，37℃反应2个小时，取产物5ul上样于0.8％的琼脂糖胶电泳分析。

[0045] 通过筛选获得两个CAPS分子标记：CAPS-80316和CAPS-80295。以疫霉菌基因组DNA为模板和CAPS-80316的一对引物扩增结果为475bp，用ScaI酶切R2产物仍然获得475bp片段，酶切R7产物获得157bp和318bp的两种片段，酶切杂合子产物获得157bp、318bp和475bp三种片段(见图1)。以疫霉菌基因组DNA为模板和CAPS-80295的一对引物扩增结果为373bp，用EcoRI酶切R2产物仍然获得373bp片段，酶切R7产物获得150bp和217bp的两种片段，酶切杂合子产物获得150bp、217bp和373bp三种片段(见图1)。

[0046] 以上结果说明两个分子标记CAPS-80316和CAPS-80295的电泳图谱与大豆疫霉菌是否携带Avr5的表现型，完全匹配。与R2一样说明是含有Avr5的纯合体，与R7一样说明是不含有Avr5的纯合体，与F1一样说明是含有Avr5的杂合体。

[0047] 实施例2

[0048] 为进一步验证上述CAPS标记，对来源于R2(P6497)和R7(P7064)的有性交配的F1和F2后代进行检测。

[0049] 1、大豆疫霉F1后代的产生

[0050] F1后代来源于R2(P6497)和R7(P7064)的有性交配：分别将两种菌丝切5mm的小块放在同一块含2.5％(v/v)V-8和10μg/ml β-sitosterol的琼脂平板上，25℃黑暗生长至少30天挑取单卵孢子，提取单卵孢子基因组DNA，用CAPS标记确认是杂合子。将杂合子F1代菌丝切5mm的小块放在含2.5％(v/v)V-8和10μg/ml β-sitosterol的琼脂平板上。

[0051] 2、大豆疫霉菌F2的获得和致病性测定

[0052] 将F1代自交产生F2代，随机挑选94个F2后代菌株并按照顺序1-94排列编号，94个F2后代菌株接种到不含任何抗病基因的Williams大豆品种上都能够致病，说明后代致病力没有受到影响。接种到含有抗病基因Rps5的大豆品种L85-3059上发现有69个不能够致病，25个能够致病，进一步说明Avr5是一个单显基因控制。

[0053] 3、F2中CAPS-80316和CAPS-80295标记和Avr5的表现型相吻合

[0054] 分别提取了1-94号F2后代菌株的基因组DNA。以R2和R7亲本菌株和F1代杂合子为对照，将每一个F2后代菌株的基因型(CAPS-80316和CAPS-80295标记类型)和表现型(在含抗性基因Rps5的大豆L85-3059上的毒性)进行了比对，发现69个不能够致病的F2代菌株的CAPS-80316和CAPS-8029两个标记均显示为R2或者H(F1杂合子)类型，25个能够致病的F2代菌株的CAPS-80316和CAPS-8029两个标记均显示为R7类型，以上数据说明CAPS-80316和CAPS-80295标记与无毒基因Avr5是紧密连锁的。