一种疟疾通用型及其分型的巢式PCR检测及荧光PCR检测试剂盒

摘要

本发明提供了一种疟疾通用型及其分型的巢式PCR及荧光PCR检测试剂盒，包括PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶混合物，还包括如SEQ ID NO：1-26所示的引物及探针。该试剂盒能检测疟原虫属特异性和恶性疟、间日疟、卵形疟、三日疟等四种疟原虫分型，用该试剂盒检测还发现了一例国内罕见的输入性卵形疟疾病例。该试剂盒能应用于临床、口岸中疟疾的检验。

权利要求

1.一种疟疾通用型及其分型的巢式PCR检测及荧光PCR检测试剂盒，包括PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶混合物，其特征在于，还包括核酸序列如SEQ ID NO:1-26所示的引物及探针，其中，W代表碱基A或T，Y代表碱基C或T，M代表碱基A或C，R代表碱基A或G；

所述分型包括：恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟四种型别；

所述核酸序列如SEQ ID NO:1-3所示的引物及探针用于疟疾通用型荧光PCR检测；

所述核酸序列如SEQ ID NO:4-6所示的引物及探针用于恶性疟的荧光PCR检测；

所述核酸序列如SEQ ID NO:7-9所示的引物及探针用于间日疟的荧光PCR检测；

所述核酸序列如SEQ ID NO:10-11所示的引物用于卵形疟的荧光PCR检测；

所述核酸序列如SEQ ID NO:12-14所示的引物及探针用于三日疟的荧光PCR检测；

所述核酸序列如SEQ ID NO:15-18所示的引物用于疟疾通用型巢式PCR检测；

所述核酸序列如SEQ ID NO:15-16及19-20所示的引物用于恶性疟巢式PCR检测；

所述核酸序列如SEQ ID NO:15-16及21-22所示的引物用于间日疟巢式PCR检测；

所述核酸序列如SEQ ID NO:15-16及23-24所示的引物用于卵形疟巢式PCR检测；

所述核酸序列如SEQ ID NO:15-16及25-26所示的引物用于三日疟巢式PCR检测。

说明书

一种疟疾通用型及其分型的巢式PCR检测及荧光PCR检测

试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学检测领域，特别涉及一种疟疾通用型及其分型的巢式PCR检测及荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒可检测疟原虫属特异性和恶性疟、间日疟、卵形疟、三日疟等四种疟原虫种特异性。

背景技术

[0002] 疟疾诊断金标准是镜检，它不但需要操作者具有丰富的经验，而且当原虫密度较低时，镜检容易出现漏诊；即使是有经验的专业镜检员检测原虫低密度样本，镜检的敏感性和特异性也会显著下降。对于国内少见的卵形疟和三日疟，容易发生错判。传统镜检法的局限性以及熟练镜检人员的缺乏导致疟疾病例的确诊与鉴别诊断困难，成为疟疾监测中新的挑战。而且发生疟原虫混合感染时，镜检不易将恶性疟的环状体或早期滋养体与间日疟的环状体区分开，特别是用药后虫体形态发生变化，虫种鉴别较难，容易出现误诊，这样影响了疟原虫感染后的治疗。因此，使用传统的镜检法作“金”标准已难于评价效率较高的诊断方法。

[0003] 近年来国内外将巢式PCR和实时荧光PCR技术应用于疟疾的快速检测和分型，它能准确判断疑似病例是否感染疟疾或携带疟原虫，以便及时发现和采取必要的防控措施，防止该传染病在国境口岸的传入和传出。但是，目前还缺乏可以检测疟原虫属特异性和恶性疟、间日疟、卵形疟、三日疟等四种疟原虫分型的方法和试剂盒。

发明内容

[0004] 本发明提供了一种疟疾通用型及其分型的巢式PCR及荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒能检测疟原虫属特异性和恶性疟、间日疟、卵形疟、三日疟等四种疟原虫分型，用该试剂盒检测还发现了一例国内罕见的输入性卵形疟疾病例。

[0005] 本发明采用如下的技术方案：

[0006] 本发明的疟疾通用型及其分型的巢式PCR检测及荧光PCR检测试剂盒，包括PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶混合物，还包括如表1所列的引物及探针(如SEQ ID NO：1-26所示)，其中，W代表A或T，Y代表C或T，M代表碱基A或C，R代表碱基A或G。所述分型包括：恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟四种型别。所述核酸序列如SEQ ID NO：1-3所示的引物及探针用于疟疾通用型荧光PCR检测。所述核酸序列如SEQ ID NO：4-6所示的引物及探针用于恶性疟的荧光PCR检测，所述核酸序列如SEQ ID NO：7-9所示的引物及探针用于间日疟的荧光PCR检测，所述核酸序列如SEQ ID NO：10-11所示的引物用于卵形疟的荧光PCR检测，所述核酸序列如SEQ IDNO：12-14所示的引物及探针用于三日疟的荧光PCR检测。所述核酸序列如SEQ ID NO：15-18所示的引物用于疟疾通用型巢式PCR检测，所述核酸序列如SEQ ID NO：15-16及19-20所示的引物用于恶性疟巢式PCR检测，所述核酸序列如SEQ ID NO：15-16及21-22所示的引物用于间日疟巢式PCR检测，所述核酸序列如SEQ ID NO：15-16及23-24所示的引物用于卵形疟巢式PCR检测，所述核酸序列如SEQ IDNO：15-16及
25-26所示的引物用于三日疟巢式PCR检测。

[0007] 通用型巢式PCR检测用rPLUout-FP、rPLUout-RP、rPLUin-FP、rPLUin-RP引物；分型巢式PCR检测用rPLUout-FP、rPLUout-RP及检测恶性疟、间日疟、卵形疟、三日疟的特异性引物；荧光PCR检测分别用通用型或恶性疟、间日疟、三日疟特异性的引物及荧光标记探针；卵形疟荧光检测用OVA-FP和OVA-RP引物。各引物探针序列(为5’-3’)如下表1所示，表1是疟原虫巢式PCR及荧光PCR检测的引物和探针。

[0008] 表1

[0009]

[0010] 使用了如下的软件进行上述引物探针的设计：使用Lasergene软件包的EditSeq和MegAlign工具进行DNA序列分析和同源性比较。用Primer Express3.0软件设计实时荧光RT-PCR检测所需的特异性引物和FAM荧光探针，用Primer Premier 5.0软件设计一般的PCR引物。

[0011] 上述试剂盒的使用方法：

[0012] (1)通用型巢式PCR检测用rPLUout-FP、rPLUout-RP、rPLUin-FP、rPLUin-RP引物；

[0013] 进行巢式PCR第一次扩增时，使用rPLUout-FP、rPLUout-RP进行PCR反应，PCR反应程序为：94℃2min；94℃1min，52℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min；4℃。

[0014] 进行巢式PCR第二次扩增时，使用rPLUin-FP、rPLUin-RP引物，PCR反应程序为：94℃2min；94℃1min，58℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃。

[0015] (2)分型巢式PCR检测用rPLUout-FP、rPLUout-RP及检测恶性疟、间日疟、卵形疟、三日疟的特异性引物；

[0016] 进行巢式PCR第一次扩增时，使用rPLUout-FP、rPLUout-RP进行PCR反应，PCR反应程序为：94℃2min；94℃1min，52℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min；4℃。

[0017] 进行巢式PCR第二次扩增时，使用恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟特异性引物，PCR反应程序为：94℃2min；94℃1min，58℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃。

[0018] (3)荧光PCR检测分别用通用型或恶性疟、间日疟、三日疟特异性的引物及荧光标记探针；

[0019] 使用 Fast Universal PCR Master Mix进行体系配置，反应总体积20μl，包括主反应混合液10μl、10μM正向引物1μl、10μM反向引物1μl、5μM探针
1μl、DNA 7μl，同时分别以DEPCH2O和DNA阳性模板作为阴性和阳性对照。扩增和检测在ABI 7900HTFast荧光定量PCR仪器上进行，反应程序为：95℃20s；95℃1s，58℃20s，40个循环，在58℃收集荧光。

[0020] (4)卵形疟荧光检测用OVA-FP和OVA-RP引物

[0021] 进行卵形疟的实时荧光PCR检测时：采用染料掺入法进行卵形疟的实时荧光PCR检测。反应引物为OVA-FP和OVA-RP，实时荧光PCR反应程序为：95℃15min；94℃15s，50℃30s，72℃30s(收集荧光)，40个循环；最后对PCR产物进行熔解曲线分析。

[0022] 上述试剂盒可以应用在临床、口岸检验中。

[0023] 本发明的试剂盒能检测疟原虫属特异性和恶性疟、间日疟、卵形疟、三日疟等四种疟原虫分型，而且还能发现一例国内罕见的输入性卵形疟疾病例。该试剂盒能应用于临床、口岸中疟疾的检验。

附图说明

[0024] 图1为疟原虫通用型巢式PCR检测的一个优选实施例的结果图；

[0025] 图2为疟原虫的特异性巢式PCR检测的一个优选实施例的结果图；

[0026] 图3为疟原虫的镜检与荧光PCR比较检测的一个优选实施例的结果图；

[0027] 图3-1为40份镜检阳性的样本的荧光PCR检测结果图；

[0028] 图3-2为20份镜检阴性的样本的荧光PCR检测结果图；

[0029] 图4为疟原虫的荧光PCR分型检测结果图；

[0030] 图4-1为三日疟的引物探针的荧光PCR检测结果图；

[0031] 图4-2为恶性疟的荧光PCR检测结果图；

[0032] 图4-3为间日疟的荧光PCR检测结果图；

[0033] 图4-4为输入性卵形疟的荧光PCR检测结果图；

[0034] 图4-5为输入性卵形疟的熔解曲线分析图。

具体实施方式

[0035] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0036] 本发明所用的样本、试剂及疟原虫DNA的提取方法等说明如下：

[0037] 样本来源

[0038] 30份疟疾镜检阳性血样由云南省寄生虫病防治所提供，10份疟疾镜检阳性血样和20份疟疾镜检阴性血样为国境口岸入境发热患者的抗凝血，由发明人实验室保存。样本采集均为静脉取血，2％EDTA-Na2抗疑，-20℃低温保存。

[0039] 试剂

[0040] 全血DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Extraction Minikit)和染料掺入法荧光PCR试剂(QuantiTect SYBR Green PCR Kit)购自Qiagen公司，探针法荧光PCR试剂( Fast Universal PCRMaster Mix)购自ABI公司，Taq DNA聚合酶购自Roche公司，100bpDNA Ladder Marker、DL2000DNA Marker和琼脂糖购自TaKaRa公司。

[0041] 疟原虫DNA提取

[0042] 参照全血DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Blood ExtractionMinikit)说明书进行，提取的总DNA于-20℃低温保存。

[0043] (1)在1.5ml离心管底加入20μl蛋白酶K。

[0044] (2)加200μl血样至离心管中，如果样本不足200μl，用PBS补齐。

[0045] (3)加200μl缓冲液AL至离心管中，脉冲振荡15s混匀。

[0046] (4)56℃孵育10min。

[0047] (5)短暂离心。

[0048] (6)加入200μl无水乙醇，脉冲振荡15s混匀。短暂离心。

[0049] (7)将第六步的混合液吸至过滤柱上，6000g离心1min。将过滤柱置于干净的收集管上。

[0050] (8)打开过滤柱盖子，加入500μl洗液AW1，盖上盖子，6000g离心1min。将过滤柱置于干净的收集管上。

[0051] (9)打开过滤柱盖子，加入500μl洗液AW2，盖上盖子，20000g离心3min。将过滤柱置于干净的收集管上。

[0052] (10)20000g离心1min.

[0053] (11)将过滤柱置于1.5ml离心管上，打开盖子，加入200μl缓冲液AE或无菌双蒸水，室温放置1min，6000g离心1min。

[0054] (12)洗脱下来的液体即为疟疾的DNA。

[0055] 扩增产物电泳分析

[0056] 取5μl扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，GelGreen染色，凝胶成像系统观察结果并拍照。

[0057] DNA序列测定

[0058] 扩增的PCR片段由上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，再对碱基组成进行BLAST比较分析。

[0059] 实施例1：本发明的试剂盒及在疟疾通用型巢式PCR检测中应用的一个优选实施例

[0060] 本发明的的疟疾通用型及其分型的巢式PCR检测及荧光PCR检测试剂盒的一个优选实施例，包括PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶混合物，还包括如表1所列的引物及探针(如SEQ ID NO：1-26所示)，其中，W代表A或T，Y代表C或T，M代表碱基A或C，R代表碱基A或G。

[0061] 疟疾通用型巢式PCR检测中，可用外引物和疟疾的通用型内引物，引物序列(为5’-3’)如下：

[0062] 外引物：

[0063] rPLUout-FP TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGA

[0064] rPLUout-RP CCTGTTGTTGCCTTAAACTTCC

[0065] 检测疟疾的通用型内引物：

[0066] rPLUin-FP AAGGATAACTACGGAAAAGCTGT

[0067] rPLUin-RP TACCCGTCATAGCCATGTTAGGCCAATACC。

[0068] 实施例2：本发明的试剂盒及在疟疾通用型巢式PCR检测中应用的一个优选实施例

[0069] 本发明的的疟疾通用型及其分型的巢式PCR检测及荧光PCR检测试剂盒的一个优选实施例，包括PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶混合物，还包括如表1所列的引物及探针(如SEQ ID NO：1-26所示)，其中，W代表A或T，Y代表C或T，M代表碱基A或C，R代表碱基A或G。

[0070] 疟疾通用型巢式PCR检测中，可用外引物和检测恶性疟、间日疟、卵形疟、三日疟的特异性引物，引物序列(为5’-3’)如下：

[0071] 外引物：

[0072] rPLUout-FP TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGA

[0073] rPLUout-RP CCTGTTGTTGCCTTAAACTTCC

[0074] 检测恶性疟的引物：

[0075] rFAL-FP TTAAACTGGTTTGGGAAAAC

[0076] rFAL-RP ACAATGAACTCAATCATGACTACC

[0077] 检测间日疟的引物：

[0078] rVIV-FP CTTCTAGCTTAATCCACATAACTG

[0079] rVIV-RP ACTTCCAAGCCRAAGCAAAGAAAGTCC

[0080] 检测卵形疟的引物：

[0081] rOVA-FP CGGGGAAATTTCTTAGATTGC

[0082] rOVA-RP GAGAAACAGCATGAATTGCG

[0083] 检测三日疟的引物：

[0084] rMAL-FP AACAWAGTTGTACRTTAAGAATAAACGC

[0085] rMAL-RP AATTCCCATGCATAAAAAATTAYACAAA。

[0086] M代表碱基A或C，R代表碱基A或G，W代表A或T，Y代表C或T。

[0087] 实施例3：本发明的试剂盒及在卵形疟实时荧光PCR检测中应用的一个优选实施例

[0088] 本发明的的疟疾通用型及其分型的巢式PCR检测及荧光PCR检测试剂盒的一个优选实施例，包括PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶混合物，还包括如表1所列的引物及探针(如SEQ ID NO：1-26所示)，其中，W代表A或T，Y代表C或T，M代表碱基A或C，R代表碱基A或G。

[0089] 卵形疟实时荧光PCR检测中，可用卵形疟实时荧光PCR检测的引物，引物序列(为5’-3’)如下：

[0090] 卵形疟实时荧光PCR检测的引物：

[0091] OVA-FP ATTAATGTGTCCTTTTCCCTATTCT

[0092] OVA-RP GCTTTACAATCAAACGAATACATTC。

[0093] 实施例4：本发明的试剂盒及在荧光PCR通用型及分型检测疟疾中应用的一个优选实施例

[0094] 本发明的的疟疾通用型及其分型的巢式PCR检测及荧光PCR检测试剂盒的一个优选实施例，包括PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶混合物，还包括如表1所列的引物及探针(如SEQ ID NO：1-26所示)，其中，W代表A或T，Y代表C或T，M代表碱基A或C，R代表碱基A或G。

[0095] 卵形疟实时荧光PCR检测中，可用通用型引物探针或恶性疟、间日疟、三日疟特异性的引物及荧光标记探针。引物探针序列(为5’-3’)如下：

[0096] 通用型的荧光检测引物及探针如下：

[0097] Plas-FP AGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGA

[0098] Plas-RP TCATCCAAMRCCTAGTCGGCATAGTTTAT

[0099] Plas-Pro FAM-ACCGTCGTAATCTT-MGB

[0100] M代表碱基A或C，R代表碱基A或G。

[0101] 恶性疟的荧光检测引物及探针如下：

[0102] FAL-FP CTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAA

[0103] FAL-RP TATTCCATGCTGTAGTATTCAAACACAA

[0104] FAL-Pro：

[0105] FAM-TGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCA-BHQ1

[0106] 间日疟的荧光检测引物及探针如下：

[0107] VIV-FP ACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACT

[0108] VIV-RP ACTTCCAAGCCRAAGCAAAGAAAGTCC

[0109] VIV-Pro FAM-TTCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGC-BHQ1

[0110] R代表碱基A或G。

[0111] 三日疟的荧光检测引物及探针如下：

[0112] MAL-FP CCGACTAGGTGTTGGATGATAGAGTAAA

[0113] MAL-RP AACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAA

[0114] MAL-Pro FAM-CTATCTAAAAGAAACACTCAT-MGB。

[0115] 实施例5：疟原虫通用型巢式PCR检测的应用

[0116] 巢式PCR两次扩增的体系和条件略有不同。第一次扩增时，PCR缓冲液2.5μl，10mM dNTP 0.5μl，10mM rPLUout-FP和rPLUout-RP引物各0.5μl，Taq DNA聚合酶
0.25μl，双蒸水15.75μl，DNA模板5μl，总体系25μl，混匀后进行PCR反应。PCR反应程序为：94℃2min；94℃1min，52℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min；4℃。进行第二次扩增时，取2μl的第一次PCR产物作为模板，上下游引物换为rPLUin-FP和rPLUin-RP的上下游引物，双蒸水增加至18.75μl，其余同第一次PCR扩增；PCR反应程序也略有不同：
94℃2min；94℃1min，58℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃。

[0117] 疟原虫通用型巢式PCR扩增结果如图1所示，泳道1为100bpDNA标志物；泳道2为疟疾阳性血样PCR结果；泳道3为PCR阳性对照；泳道4为PCR阴性对照，阴性对照使用无菌水，阳性对照使用合成的疟疾DNA片段。60份血样经通用型巢式PCR检测，有40份血样扩增出了预期大小的240bp特异性扩增条带，为疟原虫阳性；20份样本没有预期大小的扩增条带，为疟原虫阴性。

[0118] 实施例6：疟原虫的分型巢式PCR检测的应用

[0119] 巢式PCR两次扩增的体系和条件略有不同。第一次扩增时，PCR缓冲液2.5μl，10mM dNTP 0.5μl，10mM rPLUout-FP和rPLUout-RP引物各0.5μl，Taq DNA聚合酶
0.25μl，双蒸水15.75μl，DNA模板5μl，总体系25μl，混匀后进行PCR反应。PCR反应程序为：94℃2min；94℃1min，52℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min；4℃。进行第二次扩增时，取2μl的第一次PCR产物作为模板，上下游引物为检测分型的上下游引物，双蒸水增加至18.75μl，其余同第一次PCR扩增；PCR反应程序也略有不同：94℃2min；94℃1min，
58℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃。

[0120] 使用种特异性引物对疟原虫阳性的血样进行巢式PCR扩增结果见图2，图2为疟原虫的特异性巢式PCR检测结果图，泳道1：100bpDNA标志物；泳道2：阳性血样恶性疟PCR扩增；泳道3：阴性对照恶性疟PCR扩增；泳道4：阳性对照恶性疟PCR扩增；泳道5：阴性对照间日疟PCR扩增；泳道6：阳性血样间日疟PCR扩增；泳道7：阳性对照间日疟PCR扩增；泳道8：阴性对照三日疟PCR扩增；泳道9：阳性对照三日疟PCR扩增；泳道10.阳性血样卵形疟PCR扩增；泳道11：阳性对照卵形疟PCR扩增；泳道12：阴性对照卵形疟PCR扩增。恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟阳性血样的预计扩增条带分别为204bp、119bp、456bp和141bp。结果有22份为恶性疟感染，13份为间日疟感染，1份为卵形疟感染；3份为恶性疟/间日疟混合感染。阴性对照使用无菌水，阳性对照使用合成的疟疾DNA片段。

[0121] 实施例7：荧光PCR通用型检测的应用

[0122] 使用 Fast Universal PCR Master Mix进行体系配置，反应总体积20μl，包括Master Mix 10μl、10μM正向引物1μl、10μM反向引物1μl、5μM探针
1μl、DNA 7μl，同时分别以DEPC H2O和DNA阳性模板作为阴性和阳性对照。扩增和检测在ABI 7900HT Fast荧光定量PCR仪器上进行，反应程序为：95℃20s；95℃1s，58℃20s，
40个循环，在58℃收集荧光。

[0123] 通用型的荧光检测引物及探针如下：

[0124] Plas-FP AGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGA

[0125] Plas-RP TCATCCAAMRCCTAGTCGGCATAGTTTAT

[0126] Plas-Pro FAM-ACCGTCGTAATCTT-MGB。

[0127] M代表碱基A或C，R代表碱基A或G。

[0128] 将60份样本进行疟疾通用型实时荧光PCR检测，检测时间约需20min。图3为疟原虫的镜检与荧光PCR比较检测的一个优选实施例的结果图，其中，图3-1为40份镜检阳性的样本的荧光PCR检测结果，结果显示39份镜检阳性样本的荧光PCR检测均为阳性；图3-2为20份镜检阴性的样本的荧光PCR检测结果；泳道1：阳性对照；泳道2、3和4分别为
55、45和58号样本荧光PCR检测结果；在20份镜检阴性的样本中，有3份样本为实时荧光PCR阳性，其余17份样本为实时荧光PCR阴性。

[0129] 实施例8：荧光PCR分型检测的应用

[0130] 使用 Fast Universal PCR Master Mix进行体系配置，反应总体积20μl，包括Master Mix 10μl、10μM正向引物1μl、10μM反向引物1μl、5μM探针
1μl、DNA 7μl，同时分别以DEPC H2O和DNA阳性模板作为阴性和阳性对照。扩增和检测在ABI 7900HT Fast荧光定量PCR仪器上进行，反应程序为：95℃20s；95℃1s，58℃20s，
40个循环，在58℃收集荧光。

[0131] 特异性的引物及荧光标记探针。引物探针序列分别(为5’-3’)如下：

[0132] 恶性疟的荧光检测引物及探针如下：

[0133] FAL-FP CTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAA

[0134] FAL-RP TATTCCATGCTGTAGTATTCAAACACAA

[0135] FAL-Pro：

[0136] FAM-TGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCA-BHQ1

[0137] 间日疟的荧光检测引物及探针如下：

[0138] VIV-FP ACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACT

[0139] VIV-RP ACTTCCAAGCCRAAGCAAAGAAAGTCC

[0140] VIV-Pro FAM-TTCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGC-BHQ1

[0141] 三日疟的荧光检测引物及探针如下：

[0142] MAL-FP CCGACTAGGTGTTGGATGATAGAGTAAA

[0143] MAL-RP AACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAA

[0144] MAL-Pro FAM-CTATCTAAAAGAAACACTCAT-MGB。

[0145] 采用染料掺入法进行卵形疟的实时荧光PCR检测。反应体系为25μl，包括2×PCR缓冲液12.5μl、10mM上下游引物OVA-FP和OVA-RP各0.75μl、无菌双蒸水9μl以及疟原虫模板DNA 2μl。实时荧光PCR反应程序为：95℃15min；94℃15s，50℃30s，72℃30s(收集荧光)，40个循环；最后对PCR产物进行熔解曲线分析，程序为94℃15s，60℃60s，95℃15s。

[0146] 图4为疟原虫的荧光PCR分型检测结果图；图4-1为三日疟的引物探针的荧光PCR检测结果图，泳道1和2分别为恶性疟和三日疟体系的荧光PCR检测；泳道3和4分别为恶性疟和三日疟阴性对照。图4-2为恶性疟的荧光PCR检测结果图，图4-3为间日疟的荧光PCR检测结果图，图4-4为输入性卵形疟的荧光PCR检测结果图，图4-5为输入性卵形疟的熔解曲线分析图。结果发现24份恶性疟(图4-2)、11份间日疟(图4-3)、1份恶性疟/间日疟混合感染、1份卵形疟感染(图4-4)、3份未能分型。

[0147] 通过血样的巢式PCR检测和荧光PCR检测，发现了一例输入性卵形疟病例。其巢式PCR扩增大小约为450bp；图4-4为输入性卵形疟的荧光PCR检测结果图；荧光PCR扩增为明显的S形曲线，泳道1：58号血样的卵形疟荧光PCR检测；泳道2：阳性对照荧光PCR检测；泳道3：阴性对照荧光PCR检测。图4-5为输入性卵形疟的熔解曲线分析，泳道1：58号血样扩增片段的熔解曲线；泳道2：阳性对照扩增片段的熔解曲线；泳道3：阴性对照扩增片段的熔解曲线；由图可见，扩增片段的熔解曲线Tm值为72.5℃；将输入性卵形疟的巢式PCR扩增片段送去测序，序列分析表明，扩增片段长度为434bp，序列的碱基组成如下：

[0148] CGGGGAAATTTCTTAGATTGCTTCCTTCAGTACCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGCGAGTATTCGCGCAAGCGAGAAAGTTAAAAGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCTTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACTAGTTTAAGACAAGAGTAGGATTGACAGATTAATAGCTCTTTCTTGATTTCTTGGATGGTGATGCATGGCCGTTTTTAGTTCGTGAATATGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGATCTTAACCTGCTAATTAGCGGCGAATACGTTATATTCCTACTTGAAATTGAATATAGCTGAATTTGCTTATTTTGAAGAATATATTAGGATGCATTATAGTGTCCTTTTCCCTTTTCTACTTAATTCGCAATTCATGCTGTTTCTC

[0149] 下划线碱基为扩增的上下游引物部位。将该序列递交到GenBank上，GenBank登录号为JF505386。

[0150] 实施例9：疟原虫镜检和巢式PCR扩增方法的比较

[0151] 将疟原虫镜检和巢式PCR扩增方法进行比较(表2)，18份恶性疟、11份间日疟和17份阴性血样的两种检测结果一致，2份镜检为间日疟和2份镜检为阴性的样本经巢式PCR扩增显示为恶性疟，2份镜检为恶性疟的样本经巢式PCR扩增显示为间日疟，1份镜检为阴性的样本经巢式PCR扩增显示为卵形疟，2份镜检为恶性疟和1份镜检为间日疟的样本经巢式PCR扩增显示为恶性疟/间日疟混合感染，1份镜检间日疟阳性血样经巢式PCR未能分型，2份镜检为恶性疟和1份镜检为间日疟的样本经巢式PCR扩增显示为阴性。

[0152] 表2血样的疟原虫巢式PCR和镜检结果比较

[0153]

[0154] 将与镜检结果不一致的血样的特异性巢式PCR扩增条带进行序列测定，将测序结果进行NCBI数据库的blast分析，结果发现序列均为扩增的相应疟原虫的SSU rDNA基因序列，证实巢式PCR扩增结果是正确的。

[0155] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

[0156] 序列表

[0157] <120>一种疟疾通用型及其分型的巢式PCR检测及荧光PCR检测试剂盒[0158] <160>26

[0159] <170>PatentIn version 3.2

[0160] <210>1

[0161] <211>25

[0162] <212>DNA

[0163] <213>人工序列Plas-FP

[0164] <400>1

[0165] AGTTAAGGGA GTGAAGACGATCAGA 25[0166] <210>1

[0167] <211>29

[0168] <212>DNA

[0169] <213>人工序列Plas-RP

[0170] <400>2

[0171] TCATCCAAMR CCTAGTCGGC ATAGTTTAT 29[0172] <210>1

[0173] <211>14

[0174] <212>DNA

[0175] <213>人工序列Plas-Pro

[0176] <400>3

[0177] ACCGTCGTAA TCTT 14[0178] <210>1

[0179] <211>29

[0180] <212>DNA

[0181] <213>人工序列FAL-FP

[0182] <400>4

[0183] CTTTTGAGAG GTTTTGTTAC TTTGAGTAA 29[0184] <210>1

[0185] <211>28

[0186] <212>DNA

[0187] <213>人工序列FAL-RP

[0188] <400>5

[0189] TATTCCATGC TGTAGTATTC AAACACAA 28[0190] <210>1

[0191] <211>35

[0192] <212>DNA

[0193] <213>人工序列FAL-Pro

[0194] <400>6

[0195] TGTTCATAAC AGACGGGTAG TCATGATTGA GTTCA 35[0196] <210>1

[0197] <211>26

[0198] <212>DNA

[0199] <213>人工序列VIV-FP

[0200] <400>7

[0201] ACGCTTCTAG CTTAATCCAC ATAACT 26[0202] <210>1

[0203] <211>27

[0204] <212>DNA

[0205] <213>人工序列VIV-RP

[0206] <400>8

[0207] ACTTCCAAGC CRAAGCAAAG AAAGTCC 27[0208] <210>1

[0209] <211>27

[0210] <212>DNA

[0211] <213>人工序列VIV-Pro

[0212] <400>9

[0213] TTCGTATCGA CTTTGTGCGC ATTTTGC 27[0214] <210>1

[0215] <211>25

[0216] <212>DNA

[0217] <213>人工序列OVA-FP

[0218] <400>10

[0219] ATTAATGTGT CCTTTTCCCT ATTCT 25[0220] <210>1

[0221] <211>25

[0222] <212>DNA

[0223] <213>人工序列OVA-RP

[0224] <400>11

[0225] GCTTTACAAT CAAACGAATA CATTC 25[0226] <210>1

[0227] <211>28

[0228] <212>DNA

[0229] <213>人工序列MAL-FP

[0230] <400>12

[0231] CCGACTAGGT GTTGGATGAT AGAGTAAA 28[0232] <210>1

[0233] <211>26

[0234] <212>DNA

[0235] <213>人工序列MAL-RP

[0236] <400>13

[0237] AACCCAAAGA CTTTGATTTC TCATAA 26[0238] <210>1

[0239] <211>21

[0240] <212>DNA

[0241] <213>人工序列MAL-Pro

[0242] <400>14

[0243] CTATCTAAAA GAAACACTCAT 21[0244] <210>1

[0245] <211>24

[0246] <212>DNA

[0247] <213>人工序列rPLUout-FP

[0248] <400>15

[0249] TCAAAGATTA AGCCATGCAA GTGA 24[0250] <210>1

[0251] <211>22

[0252] <212>DNA

[0253] <213>人工序列rPLUout-RP

[0254] <400>16

[0255] CCTGTTGTTG CCTTAAACTT CC 22[0256] <210>1

[0257] <211>23

[0258] <212>DNA

[0259] <213>人工序列rPLUin-FP

[0260] <400>17

[0261] AAGGATAACT ACGGAAAAGC TGT 23[0262] <210>1

[0263] <211>30

[0264] <212>DNA

[0265] <213>人工序列rPLUin-RP

[0266] <400>18

[0267] TACCCGTCAT AGCCATGTTA GGCCAATACC 30[0268] <210>1

[0269] <211>20

[0270] <212>DNA

[0271] <213>人工序列rFAL-FP

[0272] <400>19

[0273] TTAAACTGGT TTGGGAAAAC 20[0274] <210>1

[0275] <211>24

[0276] <212>DNA

[0277] <213>人工序列rFAL-RP

[0278] <400>20

[0279] ACAATGAACT CAATCATGAC TACC 24[0280] <210>1

[0281] <211>24

[0282] <212>DNA

[0283] <213>人工序列rVIV-FP

[0284] <400>21

[0285] CTTCTAGCTT AATCCACATA ACTG 24[0286] <210>1

[0287] <211>27

[0288] <212>DNA

[0289] <213>人工序列rVIV-RP

[0290] <400>22

[0291] ACTTCCAAGC CRAAGCAAAG AAAGTCC 22[0292] <210>1

[0293] <211>21

[0294] <212>DNA

[0295] <213>人工序列rOVA-FP

[0296] <400>23

[0297] CGGGGAAATT TCTTAGATTG C 21[0298] <210>1

[0299] <211>20

[0300] <212>DNA

[0301] <213>人工序列rOVA-RP

[0302] <400>24

[0303] GAGAAACAGC ATGAATTGCG 20[0304] <210>1

[0305] <211>28

[0306] <212>DNA

[0307] <213>人工序列rMAL-FP

[0308] <400>25

[0309] AACAWAGTTG TACRTTAAGA ATAAACGC 28[0310] <210>1

[0311] <211>28

[0312] <212>DNA

[0313] <213>人工序列rMAL-RP

[0314] <400>26

[0315] AATTCCCATG CATAAAAAAT TAYACAAA 28