使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂及其制备方法

摘要

本发明公开了使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂及其制备方法。该试剂，由使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的培养基和骨髓间充质干细胞组成；所述培养基，由溶质和溶剂组成，所述溶质由如下终浓度的七种物质组成：葡萄糖4.0g/L-5.0g/L，碳酸钠0.11g/L-0.19g/L，L-谷氨酰胺0.584g/L-0.702g/L，二甲基亚砜100ml/L-130ml/L，转铁蛋白50g/L-67g/L，胰岛素5g/L-6.6g/L，碱性成纤维细胞生长因子0.01g/L-0.05g/L；所述溶剂为注射用水。本发明的试剂，可使通过经脉注射的骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶，解决了目前通过冠状动脉内注射所留下的细胞量较少的问题。

权利要求

1.使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂，由使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的培养基和离体的骨髓间充质干细胞组成；所述使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的培养基，由溶质和溶剂组成；

所述溶质由如下终浓度的七种物质组成：葡萄糖4.0g/L-5.0g/L，碳酸钠0.11g/L-0.19g/L，L-谷氨酰胺0.584g/L-0.702g/L，二甲基亚砜100ml/L-130ml/L，转铁蛋白50g/L-67g/L，胰岛素5g/L-6.6g/L，碱性成纤维细胞生长因子0.01g/L-0.05g/L；所述溶剂为注射用水；

所述培养基和所述离体的骨髓间充质干细胞的配比为每毫升培养基

7 7

1.0×10-1.5×10 个所述离体的骨髓间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂，其特征在于：所述溶质由如下终浓度的七种物质组成：葡萄糖4.5g/L，碳酸钠0.11g/L，L-谷氨酰胺

0.584g/L，二甲基亚砜100ml/L，转铁蛋白50g/L，胰岛素5g/L，碱性成纤维细胞生长因子

0.01g/L。

3.根据权利要求1或2所述的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂，其特征在于：所述转铁蛋白为人转铁蛋白，所述胰岛素为人胰岛素，所述碱性成纤维细胞生长因子为人碱性成纤维细胞生长因子，所述离体的骨髓间充质干细胞为离体的人骨髓间充质干细胞。

4.根据权利要求1或2所述的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂，其特征在于：所述离体的人骨髓间充质干细胞为离体的人同种异体骨髓间充质干细胞。

5.使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的成套试剂，包括权利要求1-4中任一所述的试剂、细胞稀释液和细胞染液；所述细胞染液能区分活细胞和死细胞；所述细胞稀释液为注射用生理盐水。

6.使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的成套试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求5所述的成套试剂、细胞计数板、用于存放权利要求1-4中任一所述的试剂的瓶A、用于存放所述细胞染液的瓶B和用于存放所述细胞稀释液的瓶C。

7.根据权利要求6所述的成套试剂盒，其特征在于：所述成套试剂盒还包括用于吸取细胞悬液的吸管和用于将所述细胞悬液放入所述细胞计数板的虹吸管。

8.权利要求7所述的成套试剂盒的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1-4中任一所述的试剂单独包装于一个试剂盒；将权利要求5所述的细胞染液和权利要求5所述的细胞稀释液分别独立包装后，与权利要求7所述的吸管和虹吸管共同包装于另一个试剂盒内，得到由两个试剂盒组成的所述成套试剂盒。

说明书

使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂及其制备方

法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂及其制备方法。

背景技术

[0002] 虽然各种治疗方法不断在进步，心血管疾病仍然是导致死亡的一个主要原因。在发达国家，缺血性心脏病导致的死亡占由心血管疾病引起的死亡的50％以上。据美国国家健康和营养调查2005-2006年的数据，1/3或近80,000,000的美国成年人患有一种或多种心血管疾病，其中大约有38,100,000人年龄在60或60岁以上。死亡资料显示2005年美国以心血管疾病(包括先天性心血管缺陷)为潜在原因引起的死亡人数为864,480，占总死亡人数2,448,017的35.3％，或者说每2.8个死亡人数中有一个是以心血管疾病为潜在原因而死的。2005年心血管疾病的总死亡人数(1,372,000)大约占了所有死亡人数的56％。大约每天有2,400美国人死于心血管疾病，即每30秒就有一个人死于心血管疾病。每年死于心血管疾病的人几乎与死于癌症、慢性下呼吸道疾病、意外和糖尿病的人一样多(NCHS)。

[0003] 干细胞移植有可能修复和改善心脏状况，从而极大地帮助降低疾病的发生率和死亡率。Dib等人证实了自体成肌细胞移植的可行性、安全性和患者的成功生存，并指出干细胞移植可能是治疗末期心脏病的一个潜在的治疗方法。

[0004] 同种异体骨髓间充质细胞可以从骨髓中分离出来。它们可以通过培养大量增殖同时保持其多种潜能特性。它们是组织工程使用的初级细胞，可以表达多种细胞类型，组织工程是一个非常有前途有希望的领域，它让我们可以重建器官，修复病变和受损的组织。

[0005] 同种异体骨髓间充质细胞主要有两种：造血骨髓干细胞(单核)和骨髓间充质干细胞。人们用后肢缺血再灌注模型进行研究，对这两种干细胞进行了深刻的对比。间充质干细胞有更强的修复作用，因为它们分泌更多与血管生成有关的细胞因子。间充质干细胞有多向分化潜能，能逃过受体免疫系统的检查，甚至能降低T细胞的反应，这使我们可以使用多种异体干细胞进行治疗。

[0006] 目前所记载的研究大部分都将干细胞注射到冠状动脉内和肌肉内。一个有698位病人的研究分析显示使用冠状动脉内注射干细胞治疗急性心肌梗塞对于恢复心脏功能和心脏变形能达到相关的临床效果。使用细胞治疗的病人其目标血管重建的需求并没有增加，研究发现治疗是安全的。虽然乍一看，冠状动脉内注射是细胞应用的一种方式，但放射标记骨髓细胞显示：与肌肉内注射相比，冠状动脉内注射所留下的细胞量较少。但肌肉内注射只能对局部区域起作用。

发明内容

[0007] 本发明的一个目的是提供一种使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂。

[0008] 本发明所提供的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂，由使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的培养基和离体的骨髓间充质干细胞组成；所述使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的培养基，由溶质和溶剂组成，所述溶质由如下终浓度的七种物质组成：葡萄糖4.0g/L-5.0g/L，碳酸钠0.11g/L-0.19g/L，L-谷氨酰胺0.584g/L-0.702g/L，二甲基亚砜100ml/L-130ml/L，转铁蛋白50g/L-67g/L，胰岛素5g/L-6.6g/L，碱性成纤维细胞生长因子0.01g/L-0.05g/L，所述溶剂为注射用水。所述溶质具体可由如下终浓度的七种物质组成：葡萄糖4.5g/L，碳酸钠0.11g/L，L-谷氨酰胺0.584g/L，二甲基亚砜100ml/L，转铁蛋白50g/L，胰岛素5g/L，碱性成纤维细胞生长因子0.01g/L。

[0009] 其中，所述转铁蛋白可为人转铁蛋白，所述胰岛素可为人胰岛素，所述碱性成纤维细胞生长因子可为人碱性成纤维细胞生长因子，所述骨髓间充质干细胞可为人骨髓间充质干细胞。

[0010] 所述培养基和所述离体的骨髓间充质干细胞的配比可为每毫升培养基106-108个7
所述骨髓间充质干细胞，具体可为每毫升培养基10 个所述离体的骨髓间充质干细胞，如每
7 7
毫升培养基(1.0×10-1.5×10)个所述离体的骨髓间充质干细胞。

[0011] 所述离体的人骨髓间充质干细胞具体可为离体的人同种异体骨髓间充质干细胞。

[0012] 所述使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂，可按照包括如下步骤的方法制备：将所述离体的骨髓间充质干细胞和所述使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的培养基混合，得到所述的试剂。

[0013] 其中，所述骨髓间充质干细胞和所述使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的培6 8
养基可按照每毫升培养基10-10 个所述离体的骨髓间充质干细胞靶的比例混合。

[0014] 本发明另一个目的是提供一种使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的成套试剂。该成套试剂是单剂量静脉注射剂，可直接用于治疗缺血性心肌病。

[0015] 该成套试剂包括上述使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂、细胞稀释液和细胞染液；所述细胞染液能区分活细胞和死细胞；所述细胞稀释液为注射用生理盐水。

[0016] 本发明的另一个目的是提供一种使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的成套试剂盒。

[0017] 该成套试剂盒包括所述的成套试剂、细胞计数板、用于存放所述使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂的瓶A、用于存放所述细胞染液的瓶B和用于存放所述细胞稀释液的瓶C。

[0018] 所述成套试剂盒还可包括用于吸取细胞悬液的吸管和用于将所述细胞悬液放入所述细胞计数板的虹吸管。

[0019] 所述成套试剂盒可按照包括如下步骤的方法制备：将所述使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂单独包装于一个试剂盒；将所述细胞染液和所述细胞稀释液分别独立包装后，与所述吸管和虹吸管共同包装于另一个试剂盒内，得到由两个试剂盒组成的所述成套试剂盒。

[0020] 上述同种异体骨髓间充质干细胞可从商业途径获得，也可从同种异体的离体组织中分离得到。

[0021] 在实际应用中，每位患者，以骨髓间充质干细胞计，可一次性静脉注射1亿个上述骨髓间充质干细胞。

[0022] 本发明的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂，可使通过静脉注射的骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶，解决了目前通过冠状动脉内注射所留下的细胞量较少的问题。动物实验证明，本发明的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂可使心肌梗死的部位获得足够的干细胞进而分化成新生的心肌细胞。本发明的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂，临床使用操作非常方便且精确。为了进一步提高上述静脉注射剂的使用便捷度，方便储存和运输，供用户随时随地使用，本发明还提供了试剂盒。

附图说明

[0023] 图1为左心室扫描图(上面标注的是：＞＝15.0mV；下面的是：＜＝5.0mV)[0024] A为注射本发明的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂前[0025] B为注射本发明的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂后[0026] 图2为心肌梗死动物模型心脏冠状切片TTC染色

[0027] 白色区域为心肌坏死区，粉红色区域为正常心肌。

[0028] a、治疗组动物注射本发明的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂7天后的心肌切片

[0029] b、对照组动物注射细胞稀释液后7天后的心肌切片

[0030] 图3为两组动物的心肌缺血面积比较

[0031] 图4为治疗组的免疫组织化学荧光染色结果

具体实施方式

[0032] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0034] 下述实施例中的人同种异体骨髓间充质干细胞(Human Mesenchymal Stem Cells，来自美国Stemedica Cell Technologies，Inc.，MM0013.01。人胰岛素来自Sigma，I0908；人转铁蛋白来自Sigma，T3309；人碱性成纤维细胞生长因子来自Peprotech，100-18B。

[0035] 实施例1、使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的成套试剂盒的制备[0036] 本实施例提供的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的成套试剂盒的组成如下：用于存放使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂的瓶A、用于存放细胞染液的瓶B，用于存放所述细胞稀释液的瓶C、细胞计数板、用于吸取细胞悬液的吸管和用于吸取细胞悬液放入所述细胞计数板的虹吸管。

[0037] 1)瓶A内盛放的物质是使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的培养基M1和人同种异体骨髓间充质干细胞。每瓶20ml，-80℃保存。其中，培养基M1和人同种异体骨髓7
间充质干细胞的配比为每毫升培养基1.5×10 个人同种异体骨髓间充质干细胞。培养基M1，由溶质和溶剂组成，溶质由如下终浓度的七种物质组成：葡萄糖4.5g/L，碳酸钠0.11g/L，L-谷氨酰胺0.584g/L，二甲基亚砜100ml/L，人转铁蛋白50g/L，人胰岛素5g/L，人碱性成纤维细胞生长因子0.01g/L。溶剂为注射用水。

[0038] 2)瓶B内盛放的物质是能区分活细胞和死细胞的细胞染液。该细胞染液是0.4％的台盼兰溶液。每瓶0.5mL，室温保存。

[0039] 3)瓶C内盛放的物质是细胞稀释液。该细胞稀释液是注射用生理盐水，即0.9％NaCl水溶液。每瓶100mL，室温保存。

[0040] 4)细胞计数板(沪食药监械(准)字2006第2410370号)：计数板的计数区经特殊的镀膜工艺处理，在显微镜下的网格非常清晰，大大减轻视疲劳。

[0041] 5)吸管：1个(ModelS1，上海医疗用品公司)

[0042] 6)虹吸管：1个(Model U2，上海医疗用品公司)

[0043] 瓶A的包装盒：钢精铝质圆筒，直径6cm，高10cm，泡沫塑料内架设置凹槽(直径2.5cm，高8cm)安放瓶A并将瓶A完全包埋在内架中央。此包装盒适于-80℃保存及干冰冷冻运输。

[0044] 瓶B、瓶C、细胞计数板、吸管和虹吸管均包装在另一个盒内，室温保存。

[0045] 实施例2、用实施例1的试剂盒治疗心肌梗死

[0046] 一、细胞复苏及细胞计数

[0047] 在实际操作中，冻存的干细胞要进行复苏活化的原则为快速解冻，使之迅速通过细胞最易受损的-5～0℃，以避免冰晶重新结晶而对干细胞造成伤害导致干细胞的死亡。

[0048] 干细胞复苏的主要操作过程如下：

[0049] 1.从-80℃冰箱中取出瓶A包装，将瓶A和周围包裹的保温泡沫塑料一同从包装桶中取出；操作人员应带有防护眼睛和手套。

[0050] 2.将瓶A和周围包裹的保温泡沫塑料迅速放入盛有36℃～37℃水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻。

[0051] 3.去除保温泡沫塑料，取出瓶A，轻轻反复摇匀。用70％酒精擦拭消毒后，净化台上打开盖，用吸管吸出0.5mL干细胞母液，注入瓶B的台盼兰溶液中，适当吹打使干细胞和染液充分悬浮。

[0052] 4.在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。用玻璃虹吸管吸取干细胞悬液，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹槽处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。

[0053] 5.置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。

[0054] 6活细胞不染色，而死细胞被染成蓝色。只计活细胞数，按下式确定复苏后干细胞4
母液的浓度：母液干细胞浓度＝(4个大格细胞总数/4)×10 个/ml

[0055] 7.注意事项：

[0056] (1)务必使分散成单个细胞，取样计数前，充分混匀细胞悬液。

[0057] (2)显微镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果2 2
细胞团＞10％，说明细胞分散不充分；或细胞数＜200个/10mm 或＞500个/10mm 时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。

[0058] 二、治疗剂量及细胞静脉注射液制备

[0059] (1)成人同种异体骨髓间充质细胞单剂量静脉注射剂治疗缺血性心脏病的剂量是根据患者的体重来计算的。根据临床试验的结果，治疗缺血性心脏疾病的剂量范围是500,000/kg～1,500,000/kg体重，最佳剂量是每公斤体重100万个干细胞。但一次静脉输入的干细胞数量最多不能超过1亿个。

[0060] (2)根据成活细胞计数的结果，以下列公式确定从A瓶中的取出的干细胞母液量：

[0061] 干细胞母液量＝计划静脉输入干细胞数÷母液干细胞浓度

[0062] 实施例1的试剂盒的活细胞计数的结果得出母液干细胞浓度是1.0×107个/mL，8
注射1亿(10)个干细胞就从A瓶中吸取10mL干细胞母液。

[0063] (3)将10mL干细胞母液注入C瓶，摇匀，就制成了110mL含有1亿个人同种异体骨髓间充质细胞的静脉注射液。

[0064] 三、干细胞静脉注射

[0065] 用实施例1的试剂盒治疗表1中的患者，具体方法如下：在第一天时，将在上肢静脉插入静脉点滴针头，注射生理盐水保证静脉通畅。在一小时内，把含有1亿个的成人同种异体骨髓间充质细胞的110ml生理盐水在50分钟之内完成静脉输入。具体的疗效如表1所示，心功能在输入干细胞3个月之后晋升一级，接近正常(图1)。生活质量改善，6分钟行走测试ECG呈现正常。

[0066] 表1、临床实例

[0067]

[0068] 实施例3、实施例1的试剂盒的动物实验

[0069] 材料与方法

[0070] 1、实验动物：Wistar雄性大鼠，240-260g，来源于首都医科大学实验动物科学部(生产许可证号：SCXK(京)2005-0006)。

[0071] 2、仪器及材料：HX-300小动物呼吸机、BL-420F生物机能实验系统为成都泰盟科技有限公司产品。TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑，2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，购自Sigma公司)；BrdU(购自Sigma公司)，抗-BrdU抗体购自武汉博士德公司。

[0072] 3、待测注射液：

[0073] 实施例2步骤二中(3)制备的人同种异体骨髓间充质细胞的静脉注射液(108个细胞/110mL)。

[0074] 4、干细胞BrdU标记：

[0075] 在干细胞注射前，步骤3的待测注射液，掺入BrdU(使终浓度为10μmol/L)后置于37℃培养箱2小时进行标记。

[0076] 5、心肌缺血再灌注损伤的动物模型

[0077] 术前禁食12小时后，10％水合氯醛(0.4mL/100g)麻醉。颈部气管插管，并连接呼吸机，参数为：呼吸频率60次/分；呼吸比2∶3；潮气量为9ml。腋下横切口，依次剪开皮肤、皮下组织、胸前肌肉及筋膜，暴露心包。剪开包膜，在左心耳下方2mm处穿线结扎左冠状动脉，小心缝合心包膜和胸壁各层。

[0078] 6、心肌缺血干细胞治疗：将20只心肌缺血大鼠分成干细胞治疗组和对照组，每组10只动物。治疗组动物每只经尾静脉注射BrdU标记的骨髓间充质干细胞静脉注射液1mL(细胞浓度106个/mL)；对照组则每只经尾静脉注射瓶C中的细胞稀释液1mL。

[0079] 7、心肌缺血区测量：注射七天以后，深度麻醉下处死动物，快速取出心脏，在心室部分切成一系列2mm厚的冠状切片，取中间的一片留作免疫组化，其余所有切片都浸入2％TTC溶液置于37℃培养箱2小时孵育10min。此时心肌缺血区呈白色，正常心肌区域呈红色。将心肌切片用4％多聚甲醛液固定1天后，用图像分析计算积极性观察测量缺血面积的大小与整片心肌的面积，计算缺血面积的百分比(％)。

[0080] 8、免疫组化：将未经TTC染色的一片心肌组织经4％的多聚甲醛固定、石蜡包埋后，冠状位5μm连续切片。组织切片脱水后，经3％H2O2孵育、抗原修复后，滴加抗BrdU一抗(1∶200)4℃湿盒中过夜。PBS缓冲液充分冲洗后，FITC荧光标记的二抗孵育1h，荧光倒置显微镜观察并照相记录。

[0081] 结果

[0082] 1、TTC染色显示干细胞治疗使心肌缺血损伤减小

[0083] TTC染色结果如图2所示，左前降支支配的左心室及大部的左心房显示白色的梗死区。a显示使用本发明的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂治疗7天后，梗死区占心肌切片面积约1/3，比对照组动物心肌梗死区明显缩小；b显示只使用细胞稀释液治疗的对照组动物心肌梗死区占了心肌切片面积50％。

[0084] 2、心肌缺血区测量定量分析

[0085] 对照组动物平均心肌缺血面积为心脏的47.37±10.43％(均值±SD，n＝10)，而经过注射本发明的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂的治疗组动物平均心肌缺血面积为心脏的29.11±13.24％(均值±SD，n＝10)，说明本发明的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂能有效地修复心肌梗死，展现很好的治疗效果，两组的数据经统计学检测具有极显著的差异(t-test，P＜0.001)(图3)。图3中，***表示统计学检测具有极为显著的差异，t-test，P＜0.001

[0086] 3、免疫荧光心肌组织中干细胞的浸润

[0087] 本试验用BrdU标记的干细胞在荧光显微镜下，呈绿色荧光。从免疫组织化学荧光染色的结果看，治疗组动物的心肌缺血区内有大量的经荧光标记的干细胞浸润(如图4)。

[0088] 结论

[0089] 本实验通过大鼠的心肌缺血模型证实，本发明的骨髓间充质干细胞静脉注射液能有效地修补心肌梗死，使心肌梗死的面积大大地减小，促进心肌的康复。从动物实验方面验证了临床试验的结果。