一种耳蜗大上皮嵴细胞系及其应用

摘要

本发明公开了一种保藏编号为CGMCC No.4719的耳蜗大上皮嵴细胞系。该细胞系通过病毒载体将SV40大T抗原转染入耳蜗大上皮嵴细胞，再将编码Math1基因的真核表达质粒prv5-EGFP导入，然后应用G418筛选获得抗G418阳性细胞并继续扩大培养，筛选得到耳蜗大上皮嵴细胞系。该细胞系生长速度快，易于培养，导入噪声致聋的耳蜗模型后，能够表达毛细胞特征性标记蛋白myosin VIIa，且能够发育成具有毛细胞特征的静纤毛簇。该细胞系便于推广，可应用于毛细胞分化、再生的研究。

权利要求

1.一种耳蜗大上皮嵴细胞系，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.4719。

2.一种耳蜗大上皮嵴细胞系的制备方法，其特征在于，通过病毒载体向耳蜗大上皮嵴TM细胞中转染SV40大T抗原，然后通过脂质体Lipoofectamine 2000介导转入含有Math1基因的质粒prv5-EGFP，经G418筛选获得耳蜗大上皮嵴细胞系。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述病毒载体为逆转录病毒载体。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括基因检测的步骤。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述基因检测为RT-PCR。

6.保藏编号为CGMCC No.4719的耳蜗大上皮嵴细胞系在毛细胞分化、再生研究中的应用。

说明书

一种耳蜗大上皮嵴细胞系及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞系构建领域，特别涉及一种耳蜗大上皮嵴细胞系及其应用。

背景技术

[0002] 耳聋是人类发病率最高的感官或功能缺陷性疾病，不仅严重影响患病人群的生活、学习、社会交往及家庭生活品质，而且给患者及其家庭带来生理上和心理上痛苦。耳聋分为传导性耳聋、感音神经性耳聋及混合性耳聋。我国卫生部2000年公布的调查结果显示，感音神经性聋约占耳聋患者的63％，其绝对数量超过8千万。目前，感音神经性聋的治疗多需要借助人工耳蜗。人工耳蜗植入及助听技术的临床应用部分改善了中重度感音神经性聋患者的听力障碍，一定程度上改善了患者的言语交流能力。但是人工耳蜗植入价格昂贵，限制了该技术在耳聋治疗中的广泛应用。

[0003] 研究表明，噪音、耳毒性药物、感染、中毒、老化以及各种疾病引起的毛细胞的缺失、变性和损伤是导致感音神经性耳聋的主要原因。毛细胞是内耳感觉上皮的终末分化细胞，当声波经过的时候，从细胞表面长出的静纤毛随声波运动，把刺激经由神经传给大脑。但是哺乳动物的毛细胞损伤后不能再生，因此，使毛细胞再生或恢复，成为治疗由毛细胞损伤所致的感音神经性聋的关键。但是耳蜗毛细胞为分化的终末细胞，不能传代，因此在体外不能培养，建立能够传代的细胞系更为困难。

[0004] 近年来，研究发现，位于感觉上皮外的大上皮嵴细胞经诱导能形成大量新生毛细胞，且当耳蜗组织过表达Math1后，会诱导大上皮嵴细胞区域产生异位毛细胞，即大上皮嵴柱状上皮细胞在Math1的作用下能分化成毛细胞。这些研究表明大上皮嵴细胞可能是耳蜗毛细胞的前体细胞之一。但是由于内耳中小的组织、复杂的体内骨结构以及缺乏由毛细胞的祖细胞构成的培养体系，获取大量此种耳蜗毛细胞的前体细胞非常困难。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明提供一种保藏编号为CGMCC No.4719的耳蜗大上皮嵴细胞系。该大上皮嵴细胞系能够稳定传代，可应用于毛细胞分化、再生的研究及制备治疗耳聋的相关药物。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明提供了一种耳蜗大上皮嵴细胞系，含有Math1基因，保藏编号为CGMCC No.4719。

[0008] 哺乳动物内耳的形态生成和毛细胞的产生是由局部的细胞间相互影响及特异的基因调控的，其中最关键的就是“碱性螺旋-环-螺旋”(basic helix-loop-helix，bHLH)基因转录调控因子，如Math1(mammalian atonal homologl)是毛细胞分化的正向调控因子。Math1是一种果蝇atonal的鼠类同源基因，对于毛细胞分化是必须的。发育中的毛细胞表达Math1，而非感觉细胞则不表达。试验证明，Math1基因敲除后鼠无法形成毛细胞，新生鼠内耳组织培养物过表达Math1会引起大上皮嵴(greater epitheliaridge，GER)区域额外毛细胞的产生。通过腺病毒载体转染Math1基因至成熟豚鼠耳蜗内淋巴囊从而构建Math1在耳蜗非感觉细胞的过表达模型，结果显示Corti器、内沟细胞以及Hense细胞区域产生了不成熟毛细胞，并且听觉神经轴突伸向一部分的新生毛细胞，说明新生毛细胞吸引了听觉神经元。因此，成熟耳蜗的非感觉细胞有形成新生毛细胞的能力，同时，Math1具有诱导非感觉细胞分化成毛细胞的功能。因此，本发明提供的永生化耳蜗大上皮嵴细胞系中，导入了Math1基因，用来诱导耳蜗大上皮嵴细胞分化成毛细胞。

[0009] 本发明还提供了一种耳蜗大上皮嵴细胞系的制备方法，通过病毒载体向耳蜗大TM上皮嵴细胞中转染SV40大T抗原，然后通过脂质体Lipoofectamine 2000介导转入包含Math1基因的质粒prv5-EGFP，G418筛选获得耳蜗大上皮嵴细胞系。

[0010] 作为优选，上述病毒载体为逆转录病毒载体。

[0011] 优选地，转染SV40大T抗原的方法为用含有SV40大T抗原的逆转录病毒与大上皮嵴细胞共培养，同时加入EGF(上皮生长因子)及polybrene(聚凝胺)。在两次感染后，换成10％DMEM培养基(加入EGF)培养。利用0.125％胰酶消化作用，将培养物转移至24孔培养板中。通过每日倒置显微镜观察，数天后可以看到感染细胞的克隆，在0.125％胰酶消化作用的同时，利用吸管进行单克隆的提取进而获得细胞的纯化。将提取的细胞单克隆接种至96孔培养板进行增殖和传代。

[0012] 表皮细胞生长因子(EGF)是一种由53个氨基组成的活性物质，能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。

[0013] 聚凝胺(polybrene)又名为溴化己二甲铵(hexadimethrine bromide)，是一种阳离子聚合物，在细胞培养中主要通过中和细胞表面的唾液酸和病毒粒子之间的电荷排斥，提高逆转录病毒感染细胞的效率。

[0014] 优选地，转染Math1基因的方法包括：

[0015] 步骤1：转染有SV40大T抗原的耳蜗大上皮嵴细胞生长至80％融合时进行转染，转染前2h，换无血清培养基。

[0016] 步骤2：取prv5-EGFP质粒和LipoofectamineTM 2000分别溶于转染用培养液中，TM将二者逐滴混匀，室温下静置，形成DNA-Lipoofectamine 2000复合物。

[0017] 步骤3：向转染有SV40大T抗原的耳蜗大上皮嵴细胞中加入上述复合物，并轻轻震摇，37℃培养6h后，去除培养液，换完全培养液。

[0018] 作为优选，上述筛选包括抗性筛选和Math1基因检测。

[0019] G418筛选方法包括：

[0020] 步骤1：将G418溶于HEPES中，过滤消毒，制得G418溶液。

[0021] 步骤2：用培养基按浓度梯度稀释G418溶液，制成筛选培养基。

[0022] 步骤3：将上述转染有SV40大T抗原、Math1基因的耳蜗大上皮嵴细胞制备成细胞悬液，培养约6h后，吸出培养基，PBS洗涤之后，换用筛选培养基，根据培养基颜色和细胞生长情况，每3～5d更换一次筛选培养基。

[0023] 步骤4：10～14d后，能够杀死所有细胞的G418最小浓度即为最佳筛选浓度。

[0024] 步骤5：将上述转染有SV40大T抗原、Math1基因的耳蜗大上皮嵴细胞培养待密度增至50～70％时，吸出培养液，按最佳筛选浓度配置好的G418筛选培养基，根据培养基颜色和细胞生长情况，每3～5d更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半以维持筛选。筛选10～14d后，可见有抗性的单克隆出现，停药培养，挑单克隆。

[0025] 传代50代后，上述单克隆仍能够稳定传代，具有生物特异性，鉴于该单克隆能够稳定传代，本发明获得耳蜗大上皮嵴细胞系。

[0026] 作为优选，本发明提供的耳蜗大上皮嵴细胞系的制备方法中，还包括基因检测的步骤。

[0027] 上述基因检测为对所述耳蜗大上皮嵴细胞系中Math1基因进行RT-PCR检测。

[0028] 优选地，耳蜗大上皮嵴细胞系的细胞大量扩增后，提取总RNA，RT-PCR检测Math1基因是否存在。本发明还提供了一种含有Math1基因、保藏编号为CGMCC No.4719的耳蜗大上皮嵴细胞系在毛细胞的分化、再生研究中的应用。

[0029] 本发明公开了一种Math1基因、保藏编号为CGMCC No.4719的耳蜗大上皮嵴细胞系。该细胞系通过病毒载体将SV40大T抗原转染入耳蜗大上皮嵴细胞，再将编码Math1基因的真核表达质粒prv5-EGFP导入，然后应用G418筛选获得抗G418阳性细胞并继续扩大培养，筛选得到耳蜗大上皮嵴细胞系。该细胞系生长速度快，易于培养，导入噪声致聋的耳蜗模型后，能够表达毛细胞特征性标记蛋白myosin VIIa，且能够发育成具有毛细胞特征的静纤毛簇。该细胞系便于推广，可应用于毛细胞分化、再生的研究。本发明提供的大上皮嵴细胞系分化得到的毛细胞是感觉细胞，其功能是将声音信号转变为生物电信号，然后由螺旋神经节神经元将信号传入听觉中枢产生听觉。生物保藏说明

[0030] 生物材料：CEC-M-6；分类命名：大鼠耳蜗上皮细胞系；2011年4月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市中关村中国科学院微生物所内，保藏编号为CGMCCNo.4719。

附图说明

[0031] 图1示本发明提供的耳蜗大上皮嵴细胞系中Math1基因的检测结果。利用管家基因DAPDH作为内参，对Math基因的表达量进行半定量检测。从左至右，第一泳道为培养24h后提取总RNA经RT-PCR后的电泳图；第二泳道为培养48h后提取总RNA经RT-PCR后的电泳图；第三泳道为培养72h后提取总RNA经RT-PCR后的电泳图；第四泳道为培养96h后提取总RNA经RT-PCR后的电泳图。

[0032] 图2示损伤的耳蜗模型导入本发明提供的耳蜗大上皮嵴细胞系1月后电镜图，有静纤毛簇产生，表明有毛细胞产生。

[0033] 图3示损伤的耳蜗模型导入本发明提供的耳蜗大上皮嵴细胞系1月后电镜图，生成的细胞表面有成团状的纤毛产生。

具体实施方式

[0034] 本发明公开了一种含有Math1基因、保藏编号为CGMCC No.4719的大上皮嵴细胞系及其在毛细胞分化、再生研究上的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0035] 本发明提供了一种耳蜗大上皮嵴细胞系，含有Math1基因，保藏编号为CGMCC No.4719。

[0036] 本发明还提供了一种耳蜗大上皮嵴细胞系的制备方法，通过病毒载体向耳蜗大TM上皮嵴细胞中转染SV40大T抗原，然后通过脂质体Lipoofectamine 2000介导转入包含Math1基因的质粒prv5-EGFP，G418筛选筛选获得永生化耳蜗大上皮嵴细胞系。

[0037] 作为优选，上述病毒载体为逆转录病毒载体。

[0038] 逆转录病毒载体是一种人工改建的感染性RNA病毒，可以将非病毒基因整合于有丝分裂期宿主细胞，从而使靶细胞获得对目的基因的稳定、永久性的转染。由于逆转录病毒结构中除包含SV40大T抗原外，同时编码了一段温度依赖性蛋白(tsA58)，在33℃时，大T抗原活性最强，所以当培养物被转移至非许可温度(39℃)时，大T功能失活，细胞将停止增殖。另外，作为标记基因的Neo基因，是一种最常用的供阳性筛选的标记基因，该酶对G418(新霉素的衍生物)具有抗性，正常情况下，G418可使培养细胞死亡，而经Neo基因转染成功的细胞能在含G418的培养基中生长，由此可供阳性筛查。故对于本研究中细胞系的纯化方法，可以利用G418对培养细胞中已实现SV40大T抗原稳定表达的细胞进行筛选及纯化。

[0039] G418是一种氨基糖苷类抗生素，在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。它通过抑制转座子Tn601，Tn5的基因，干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞产生毒素，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。当neo基因被整合进真核细胞DNA后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

[0040] 由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/mL，在100μg/mL～1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10～14d内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

[0041] 由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24h之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3～5d都要更换一次含有G418的筛选液。

[0042] 为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增加阳性克隆的得率，可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔做个标记。然后刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养；或用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。

[0043] 作为优选，本发明提供的耳蜗大上皮嵴细胞系的制备方法中，还包括对基因检测的步骤。

[0044] 上述基因检测为对所述耳蜗大上皮嵴细胞系中Math1基因进行RT-PCR检测。

[0045] 优选地，耳蜗大上皮嵴细胞系的细胞大量扩增后，提取总RNA，RT-PCR检测Math1基因是否存在。

[0046] 本发明还提供了一种含有Math1基因、保藏编号为CGMCC No.4719的耳蜗大上皮嵴细胞系在毛细胞的分化、再生研究中的应用。该细胞系生长速度快，易于培养，导入噪声致聋的耳蜗模型后，能够表达毛细胞特征性标记蛋白myosin VIIa，且能够发育成具有毛细胞特征的静纤毛簇。该细胞系便于推广，可应用于毛细胞分化、再生的研究。

[0047] 本发明中，Math1基因由美国基因公司高维强教授提供。

[0048] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0049] 实施例1 分离耳蜗大上皮嵴细胞

[0050] 取P0-P3大鼠于75％酒精浸泡5min，沿头颈相接处断头，眼科剪自枕骨大孔去除大部分顶骨及全部脑组织，暴露颅中窝和颅后窝，完整取出听泡；将听泡置于pH＝7.4的PBS溶液中，在解剖显微镜下(Olympus公司)打开听泡，剥离蜗壳，去除骨性耳蜗，自底转逐渐剥离基底膜(撕除螺旋韧带及螺旋神经节)；立即将基底膜移入0.5mg/mL嗜热菌蛋白酶(Sigma公司)溶液(由pH＝7.4的0.01mol/L的PBS溶液配制而成，同时加入5U/μL的DNase(Promage公司)中，37℃孵育27min；在高倍显微镜下，将基底膜上的上皮细胞薄片用钨丝针从所连接的结缔组织上撕下；将分离除的上皮薄片接种于96孔培养板，并用吸管进行轻柔的吹打，使用10％DMEM培养基，同时加入20ng/mL的EGF。每2d换液一次，进行原代培养4d以淘汰内外毛细胞。

[0051] 实施例2 建立耳蜗大上皮嵴细胞系

[0052] 用含有SV40大T抗原的逆转录病毒与大上皮嵴细胞共培养，同时加入20ng/mL EGF及8μg/mL polybrene。在两次感染后(各6h)，换成10％DMEM培养基(加入20ng/mL的EGF)。培养10d后，利用0.125％胰酶消化作用，将培养物转移至24孔培养板中。通过每日倒置显微镜观察，数天后可以看到感染细胞的克隆，在0.125％胰酶消化作用的同时，利用吸管进行单克隆的提取进而获得细胞的纯化。将提取的细胞单克隆接种至96孔培养板进行增殖和传代。

[0053] 转染：24孔培养板内细胞生长至80％融合时进行转染，转染前2h，每孔换400μLTM无血清培养基；取1μg prv5-EGFP质粒和2μL Lipoofectamine 2000分别溶于100μL转TM
染用培养液中，将二者逐滴混匀，室温下静置20min，以形成DNA-Lipoofectamine 2000复合物；每一24孔培养板细胞中加入100μL复合物，并轻轻震摇，37℃培养6h后，去除培养液，换完全培养液。

[0054] G418筛选法纯化细胞：

[0055] G418的配制：取1g G418溶于1mL 1mol/L的HEPES液中，加蒸馏水至10mL，过滤消毒，4℃保存。

[0056] 细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6h左右开始加药。

[0057] 制备筛选培养基：按梯度浓度100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、300μg/mL，用培养基稀释G418制成筛选培养基。

[0058] 加G418筛选：吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。

[0059] 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3d更换一次筛选培养基。

[0060] 确定最佳筛选浓度：在筛选14d内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度，最佳筛选浓度为150μg/mL。

[0061] 转染后的细胞培养24h或者更长，到细胞增长接近汇合时按1∶4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50-70％汇合时；加G418去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3d更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选10-14d后，可见有抗性的克隆出现，停药培养；

[0062] 挑单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10μL。在96孔板中加入培养基150μL/孔，再加入细胞悬液10μL/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖，得到永生化耳蜗大上皮嵴细胞系。

[0063] 单克隆鉴定：细胞培养24h、48h、72h、96h后，提取总RNA，做RT-PCR检测。Math1基因表达如图1所示。

[0064] 图1表明，本发明中制得的耳蜗大上皮嵴细胞系中，转有Math1基因。

[0065] 实施例3 建立耳蜗大上皮嵴细胞系

[0066] 用含有SV40大T抗原的逆转录病毒与大上皮嵴细胞共培养，同时加入20ng/mL EGF及8μg/mL polybrene。在两次感染后(各6h)，换成10％DMEM培养基(加入20ng/mL的EGF)。培养10d后，利用0.125％胰酶消化作用，将培养物转移至24孔培养板中。通过每日倒置显微镜观察，数天后可以看到感染细胞的克隆，在0.125％胰酶消化作用的同时，利用吸管进行单克隆的提取进而获得细胞的纯化。将提取的细胞单克隆接种至96孔培养板进行增殖和传代。

[0067] 转染：24孔培养板内细胞生长至80％融合时进行转染，转染前2h，每孔换400μLTM无血清培养基；取1μg prv5-EGFP质粒和2μL Lipoofectamine 2000分别溶于100μL转TM
染用培养液中，将二者逐滴混匀，室温下静置20min，以形成DNA-Lipoofectamine 2000复合物；每一24孔培养板细胞中加入100μL复合物，并轻轻震摇，37℃培养6h后，去除培养液，换完全培养液。

[0068] G418筛选法纯化细胞：

[0069] G418的配制：取1g G418溶于1mL 1mol/L的HEPES液中，加蒸馏水至10mL，过滤消毒，4℃保存。

[0070] 细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6h左右开始加药。

[0071] 制备筛选培养基：按梯度浓度100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、300μg/mL，用培养基稀释G418制成筛选培养基。

[0072] 加G418筛选：吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。

[0073] 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每5d更换一次筛选培养基。

[0074] 确定最佳筛选浓度：在筛选10d内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度，最佳筛选浓度为150μg/mL。

[0075] 转染后的细胞培养24h或者更长，到细胞增长接近汇合时按1∶4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50-70％汇合时；加G418去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。根据培养基的颜色和细胞生长情况，每5d更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选14d后，可见有抗性的克隆出现，停药培养；

[0076] 挑单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10μL。在96孔板中加入培养基150μL/孔，再加入细胞悬液10μL/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖，得到耳蜗大上皮嵴细胞系。

[0077] 单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测。检测结果同实施例2，表明本发明中制得的耳蜗大上皮嵴细胞系中，转有Math1基因。

[0078] 实施例4 对本发明制得的耳蜗大上皮嵴细胞系进行检测

[0079] 选取本发明制得永生化耳蜗大上皮嵴细胞系的第20代细胞，以1×104/mL接种于24孔培养板，于接种后第2d进行逆转录病毒的感染；随机选取10个培养孔，吸除培养液，加入ad-Math1-EGFP逆转录病毒悬液(1∶2稀释)，

[0080] 覆盖皿底即可，于5％CO2/95％空气、37℃培养箱中孵育2～3h后，吸除病毒液，加入150μg/mLG418筛选培养基，于5％CO2/95％空气、37℃培养箱中孵育培养，每隔2d换液，每日观察培养基颜色、透明度及细胞生长情况。对ad-Math1-EGFP组及ad-EGFP组标本均选择感染后第4d进行固定，使用4％多聚甲醛固定40min后，进行抗myosin VIIa抗体的免疫细胞组化荧光染色，用荧光显微镜观测结果。结果显示，本发明提供的耳蜗大上皮嵴细胞系能够表达毛细胞的标记蛋白Myosin VIIa。

[0081] 实施例5 本发明制得的耳蜗大上皮嵴细胞系导入噪声致聋的耳蜗模型分化获得毛细胞

[0082] 制备噪声致聋的耳蜗模型：成年大鼠体重150～200g，ABR基线阈值正常(15-50dB SPL)，脉冲声(电火花脉冲发声器)爆震动物200发，压力峰值为145.0dB SPL，脉宽80ms。噪声致聋7天后测ABR阈值，阈值引不出或在100dB SPL以上者为备选动物。

[0083] 将实施例2制得的永生化耳蜗大上皮嵴细胞系经骨阶导入上述噪声致聋的耳蜗模型，在解放军总医院动物所常规饲养，分别在14天和1月后处死取材。

[0084] 将实施例2制得的耳蜗大上皮嵴细胞系经骨阶导入上述噪声致聋的耳蜗模型后，该耳蜗大上皮嵴细胞能够成活，且表达毛细胞的标记蛋白Myosin VIIa，同时发育成具有毛细胞特征的静纤毛簇，结果见图2、图3。进一步表明，本发明提供的耳蜗大上皮嵴细胞系能够产生毛细胞。

[0085] 因此，本发明提供的耳蜗大上皮嵴细胞系可以应用于毛细胞的分化、再生的研究。

[0086] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。