一种脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法

摘要

本发明公开了一种脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法。该方法的核心是采用疏水性试剂甲基丙烯酸缩水甘油酯对脂肪酶表面进行化学修饰，引入碳碳双键基团，然后无需中间产物分离步骤，直接加入含有碳碳双键的乙烯基单体为原料，引发自由基聚合得到目标产物。该方法生产条件温和，制备过程简单，可以有效避免中间修饰步骤的酶活损失，实现高酶活收率，同时显著提高脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒的热稳定性，并且新方法简化了中间产物分离步骤，降低生产成本，便于实现大规模工业制备。

权利要求

1.一种制备脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒的方法，其特征在于：所述脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒是以下述质量份的物质为原料制成的：脂肪酶10份、甲基丙烯酸缩水甘油酯2-200份、乙烯基单体75-375份和引发剂体系20-30份；

包括如下步骤：1）将所述脂肪酶和所述甲基丙烯酸缩水甘油酯加入pH值为3-8的缓冲溶液中，在0-50℃下反应0.5~3小时；

2）向步骤1）的反应液中加入所述乙烯基单体和所述引发剂体系，在0-50℃继续反应

5-12小时，即得到脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒；

所述乙烯基单体是丙烯酰胺；

所述引发剂体系由过硫酸铵和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺组成，其质量比为1.5:2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述缓冲溶液为下述至少一种物质的水溶液：乙酸、乙酸钠、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钠、硼酸、硼酸钠、硼酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述甲基丙烯酸缩水甘油酯是以甲基丙烯酸缩水甘油酯的二甲基甲酰胺溶液形式加入pH值为3-8的缓冲溶液中。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将步骤2）得到的含脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒的反应液进行截留分子量为10KDa的透析，并将透析后的液体冻干的步骤。

5.一种制备脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒的方法，其特征在于：所述脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒是以下述质量份的物质为原料制成的：脂肪酶10份、甲基丙烯酸缩水甘油酯2-200份、乙烯基单体75-375份和引发剂体系20-30份；

包括如下步骤：1）将所述脂肪酶、所述甲基丙烯酸缩水甘油酯和所述乙烯基单体加入pH值为3-8的缓冲溶液中，在0-50℃下反应0.5~3小时；

2）向步骤1）的反应液中加入所述引发剂体系，在0-50℃继续反应5-12小时，即得到脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒；

所述乙烯基单体是丙烯酰胺；

所述引发剂体系由过硫酸铵和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺组成，其质量比为1.5:2。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述缓冲溶液为下述至少一种物质的水溶液：乙酸、乙酸钠、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钠、硼酸、硼酸钠、硼酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述甲基丙烯酸缩水甘油酯是以甲基丙烯酸缩水甘油酯的二甲基甲酰胺溶液形式加入pH值为3-8的缓冲溶液中。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将步骤2）得到的含脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒的反应液进行截留分子量为10KDa的透析，并将透析后的液体冻干的步骤。

9.权利要求1-8中任一项所述方法制备得到的脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒。

10.根据权利要求9所述的脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒，其特征在于：所述脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒的粒径为20-50nm。

说明书

一种脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法。

背景技术

[0002] 脂肪酶(Lipase)作为应用最为广泛的工业酶之一，可以催化水解、酯化等多种反应过程，并且具有较高的手性/区域选择性。其常见应用领域包括有机合成、食品工业、洗涤剂工业、能源工业、生物转化、生物医药、生物传感器等等。化学修饰法是酶分子改造过程中的常见方法，且随着近年来纳米科技的发展，纳米高分子生物催化颗粒正逐渐成为生化催化领域一个新型课题。脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒不仅可以有效实现均相催化，解决现有固定化脂肪酶因高传质阻力而导致酶催化活性较低的问题，而且还可以有效提高热稳定性，增强有机溶剂耐受能力。传统两步法制备脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒采用丙烯酸琥珀酰亚胺酯作为第一步引入蛋白质表面双键基团的修饰剂，然后经过中间产物分离后进入第二步水相原位自由基聚合得到目标产物。该方法的修饰剂成本高，中间分离步骤耗时长，严重制约了其在实际工业生产中的应用。因此，开发一种原料成本低、工艺简单、能耗少的脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒的制备方法具有重要意义。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒及其制备方法。

[0004] 本发明所提供的脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒，是以下述质量份的物质为原料制成的：脂肪酶10份、甲基丙烯酸缩水甘油酯(酶修饰剂)2-200份、乙烯基单体75-375份和引发剂体系20-30份；具体制备方法包括如下步骤：1)将所述脂肪酶和所述甲基丙烯酸缩水甘油酯加入pH值为3-8的缓冲溶液中，在0-50℃下反应0.5～3小时；2)向步骤1)的反应液中加入所述乙烯基单体和所述引发剂体系，在0-50℃继续反应5-12小时，得到脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒。

[0005] 其中，所述酶修饰剂甲基丙烯酸缩水甘油酯是以甲基丙烯酸缩水甘油酯的二甲基甲酰胺溶液形式加入的，由于二甲基甲酰胺与修饰剂以及水的互溶性较好，所以作为修饰剂的溶剂，可促进其在水相中溶解并与脂肪酶反应。

[0006] 本发明中所述脂肪酶来源于商品酶、动物提取物或微生物提取物。

[0007] 本发明中，所述乙烯基单体是指可通过自由基聚合反应形成聚合物的乙烯基单体；所述乙烯基单体具体可选自下述至少一种：丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酰化聚乙二醇、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、N，N’-甲叉双丙烯酰胺、顺丁二烯和三羟基甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。

[0008] 本发明中，所述引发剂体系是指在0-50℃条件下能够引发产生自由基，导致乙烯基单体发生自由基聚合的热引发剂体系或氧化还原引剂体系。所述引发剂体系具体可由下述A和B中的物质组成，所述A选自下述至少一种：过硫酸钾、过硫酸铵、过氧化氢、叔丁基过氧化氢和过氧化苯二甲酰，所述B选自下述至少一种：亚铁盐、亚硫酸盐、N，N’-二甲基苯胺、氨水、N，N’-二甲基-对甲苯胺、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺、哌啶和N-甲基吗啉。所述引发剂体系优选由过硫酸铵和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺组成，其质量比可为1.5∶2。

[0009] 所述缓冲溶液可为下述至少一种物质的水溶液：醋酸、醋酸钠、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钠、硼酸、硼酸钠、硼酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾。

[0010] 所述方法还包括将步骤2)得到的含脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒的反应液进行透析，并将透析后的液体冻干的步骤。

[0011] 在本发明提供的制备方法中，乙烯基单体也可在步骤1中加入，具体方法如下：

[0012] 1)将所述脂肪酶、所述甲基丙烯酸缩水甘油酯和所述乙烯基单体加入pH值为3-8的缓冲溶液中，在0-50℃下反应0.5～3小时；2)向步骤1)的反应液中加入所述引发剂体系，在0-50℃继续反应5-12小时，得到脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒。

[0013] 上述先加入乙烯基单体的方法较后加入乙烯基单体的方法，聚合反应收率较低，从最终聚合产物收率方面考虑，优选后加入乙烯基单体的方法。

[0014] 本发明采用疏水性试剂甲基丙烯酸缩水甘油酯作为酶修饰剂，在脂肪酶表面引入碳碳双键基团，无需中间产物分离，直接加入含有碳碳双键的乙烯基单体引发自由基聚合，得到目标脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒。该脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒的粒径为20-50nm，其核心为脂肪酶，外壳为高分子材料，核壳之间有化学键连接。

[0015] 本发明方法核心在于新型疏水性修饰剂(甲基丙烯酸缩水甘油酯)的引入，可以有效实现脂肪酶活性的激发，得到高酶活收率，避免传统制备方法中修饰步骤对脂肪酶酶活造成的损失。同时，一锅法的制备过程可以显著提高生产效率，降低生产成本，并且制备得到具有更高热稳定性的100纳米以下尺度的脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒，更便于工业生产和放大。

附图说明

[0016] 图1为利用传统两步法丙烯酸琥珀酰亚胺酯(NAS)修饰，新两步法甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)修饰，新一锅法甲基丙烯酸缩水甘油酯(One-Pot)修饰，三种方法双键修饰度(Acryloylation％)，及各步产物剩余活性比较(Intermediate ProductRA％/CRL-pAM nanogel RA％)。

[0017] 图2为本发明甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)修饰法所得目标产物，传统丙烯酸琥珀酰亚胺酯(NAS)修饰法得到产物，以及天然脂肪酶的各酶动力学参数(Km，Vmax，Kcat)对比图；图中NAS：CRL-pNIPAAM以及GMA：CRL-pNIPAAM是指以N-异丙基丙烯酰胺为乙烯基单体制备的催化颗粒。

[0018] 图3为本发明制备方法(One-pot)，传统两步法(Two-step)与天然脂肪酶在50℃、60℃下热稳定性比较图。

[0019] 图4为本发明制备方法(One-pot)工艺过程与传统两步法(Two-step)工艺过程的流程示意图比较。

[0020] 图5为实施例3在不同修饰剂投料量范围下的脂肪酶纳米凝胶产物聚合产物收率及剩余活性收率比较图。

[0021] 图6为实施例4在不同单体投料量范围下的脂肪酶纳米凝胶产物聚合产物收率及剩余活性收率比较图。

[0022] 图7为实施例5在不同pH范围下的脂肪酶纳米凝胶产物聚合产物收率及剩余活性收率比较图。

具体实施方式

[0023] 下面结合实施例对本发明方法做进一步地说明，但本发明并不局限于此。

[0024] 实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例中使用脂肪酶为Lipase from Canadida rugosa，脂肪酶来自sigma公司，商品目录号为L1754，Type VII，≥700unit/mg。

[0025] 上述脂肪酶在使用前需进行纯化，具体方法如下：将上述100份脂肪酶溶解于pH值3～8的缓冲液中，在0～30℃下离心5～20min，取上清液置于截留分子量为10KDa的透析袋中，在pH为3～8、50mM缓冲液中透析24小时，测量蛋白浓度确定脂肪酶蛋白含量。下述实施例中所用的脂肪酶的量以脂肪酶蛋白质量计。

[0026] 实施例1、One-pot法制备脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒

[0027] 原料为重量份计：脂肪酶10份，酶修饰剂(甲基丙烯酸缩水甘油酯)200份，乙烯基单体(丙烯酰胺)250份，引发剂体系为15份过硫酸铵和12份N，N，N’，N’-四甲基乙二胺的混合物。

[0028] 将上述脂肪酶溶解在5000质量份pH为4、50mM乙酸缓冲液中，加入酶修饰剂(50％v/v二甲基甲酰胺溶液)，在30℃条件下反应2小时。加入250份丙烯酰胺溶解后及加入上述引发剂体系后，在搅拌条件下于30℃继续反应12小时，然后将反应液置于截留分子量为10KDa的透析袋中，在pH为7、50mM磷酸缓冲液中透析24小时，收集透析后液体冻干即可得到目标产物脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒。

[0029] 以对硝基酚棕榈酸酯类作为底物测量脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒的生物催化活性总收率(RA％＝待测脂肪酶酶活力/天然脂肪酶活力*100％)为108％，聚合反应收率为50％。

[0030] 具体活性测定方法如下：

[0031] 采用对硝基酚棕榈酸酯作为底物测定酶活时，首先将对硝基酚棕榈酸酯溶解在丙酮中，然后在搅拌下缓慢加入到含有1.25％(w/v)的Triton X-100的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(50mM，pH 7.0)中配制成0.5mM的底物溶液，溶液中丙酮浓度控制在5％(v/v)。测酶活时，一定量酶液加入到底物溶液中，混合10秒后在紫外分光光度计上测定348nm处的吸收值变化，通过计算斜率得到脂肪酶的水解相对活性。1分钟内催化对硝基酚棕榈酸酯水解产生1μmol棕榈酸所需的酶量定义为一个酶活单位。

[0032] 聚合物反应收率以280nm紫外检测下的体积排阻色谱图为准。其中，酶纳米凝胶产物聚合收率％＝聚合物出峰面积/总峰面积×100％。

[0033] 对比例1、传统两步法

[0034] 原料为重量份计：脂肪酶10份，酶修饰剂(丙烯酸琥珀酰亚胺酯)15份，乙烯基单体(丙烯酰胺)250份，引发剂体系为15份过硫酸铵和12份N，N，N’，N’-四甲基乙二胺的混合物。

[0035] 将上述脂肪酶溶解在5000质量份pH为4、50mM乙酸缓冲液中，加入酶修饰剂(2％二甲基亚砜)，在30℃条件下反应6小时，在pH为7、50mM磷酸缓冲液中透析24h除去过量修饰剂。加入250份丙烯酰胺，温度保持30℃，磁力搅拌，加入上述引发剂体系，温度保持30℃，继续反应12小时，然后将反应液置于截留分子量为10KDa的透析袋中，在pH为7、50mM磷酸缓冲液中透析24小时，收集透析后液体冻干即得传统丙烯酸琥珀酰亚胺酯修饰下两步法制备的脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒。

[0036] 对比例2、新修饰剂下两步法

[0037] 原料为重量份计：脂肪酶10份，酶修饰剂(甲基丙烯酸缩水甘油酯)200份，乙烯基单体(丙烯酰胺)250份，引发剂体系为15份过硫酸铵和12份N，N，N’，N’-四甲基乙二胺的混合物。

[0038] 将上述脂肪酶与酶修饰剂(50％v/v二甲基甲酰胺溶液)加入pH为4的50mM乙酸缓冲液中，在30℃条件下反应2小时，在缓冲液中透析24h除去过量修饰剂。加入250份丙烯酰胺溶解后及加入上述引发剂体系后，在搅拌条件下继续反应12小时，然后将反应液置于截留分子量为10KDa的透析袋中，在pH为7、50mM磷酸缓冲液中透析24小时，收集透析后液体冻干即得到目标产物脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒。

[0039] 对实施例1、对比例1、对比例2分别利用TNBS法测定双键修饰度，和以对硝基酚棕榈酸酯类作为底物的测定各步产物的生物催化活性收率，其对比结果如图1所示。由图1可知，实施例1方法可以有效实现脂肪酶酶活的激发，得到高酶活收率。

[0040] 进一步检测新修饰剂对于酶学基本性能的影响，采用上述酶活测定方法，分别在0.1～0.9mM底物浓度溶液中测定脂肪酶酶解反应起始反应速率，根据米氏方程以底物倒-1
数为横坐标，初始反应速率倒数为纵坐标进行双倒数作图，计算得到Km(斜率 )，Vmax(截-1
距 )，Kcat＝Vmax/[E]total，如图2所示，发现原修饰剂修饰后产物(CRL-NAS)及聚合产物(NANOGEL(N))的Km，Vmax，Kcat值均有所下降，而新修饰剂修饰后产物(CRL-GMA)及聚合产物(NANOGEL(G))的Km和Vmax值略有上升，同时Kcat值显著提高。说明新疏水性修饰剂会在一定程度上影响酶与底物结合的紧密程度，但其形成的疏水性通道却可以有效提高酶的最大反应速率，显著改善催化效率，降低聚合物壳层的引入对酶催化效率的不利影响。

[0041] 分别在50℃和60℃下测定天然脂肪酶，传统两步法丙烯酸琥珀酰亚胺酯修饰目标产物，和本发明One-pot法制备得到的脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒热稳定性比较，如图3所示。根据图3以及半衰期计算公式：t1/2＝-ln2/k(其中k为ln(RA％)～t斜率)可以得到如下结果：

[0042]

[0043] 由此可见，本发明相比天然酶和传统方法，能够有效提高酶活半衰期，所制备的脂肪酶纳米凝胶具有更好的热稳定性。

[0044] 图4表明了比较例1和实施例1制备流程示意图的对比，说明新方法可以在温和恒定温度固定反应器中进行，并且有效节省中间产物分离步骤，降低生产成本，提高生产效率(缩短生产时间约24小时/批次)。

[0045] 实施例2、One-pot法改变单体投料时间制备脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒[0046] 原料为重量份计：脂肪酶10份，酶修饰剂(甲基丙烯酸缩水甘油酯)200份，乙烯基单体(丙烯酰胺)为250份，引发剂体系为15份过硫酸铵和12份N，N，N’，N’-四甲基乙二胺的混合物。

[0047] 将上述脂肪酶、酶修饰剂(50％v/v二甲基甲酰胺溶液)与250份丙烯酰胺加入pH为4的50mM乙酸缓冲液中，在30℃条件下反应2小时。后加入上述引发剂体系引发自由基聚合，在搅拌条件下继续反应12小时，然后将反应液置于截留分子量为10KDa的透析袋中，在pH为7、50mM磷酸缓冲液中透析24小时，收集透析后液体冻干即可得到目标产物脂肪酶纳米高分子生物催化颗粒。

[0048] 以对硝基酚棕榈酸酯类作为底物测量纳米高分子生物催化颗粒的生物催化活性总收率为94％，聚合反应收率约为45％。

[0049] 实施例3、One-pot法改变修饰剂投料量

[0050] 将实施例1中的修饰剂投料量分别改为2-200份甲基丙烯酸缩水甘油酯，其余配方和步骤与实施例1相同。此时，得到的产物以对硝基酚棕榈酸酯类作为底物测量纳米高分子生物催化颗粒的生物催化活性总收率和聚合反应收率如图5所示。

[0051] 其中，整体聚合反应收率(Nanogel yield％)相当，生物催化活性总收率体现在产物的剩余相对酶活(CRL-pAM nanogel RA％)上。在低修饰剂投料下，由于酶活激活现象不显著，因此获得脂肪酶纳米凝胶的收率较低，当修饰剂投料量超过50份后，酶活激活现象开始显现，酶活收率开始提高，当修饰剂投料量增至200份时，可以得到相当于天然酶酶活114％的酶纳米凝胶酶活收率。

[0052] 实施例4、One-pot法改变单体投料量

[0053] 将实施例1中的单体投料量分别改为75、150、225、300、375份丙烯酰胺，其余配方和步骤与实施例1相同。此时，得到的产物以对硝基酚棕榈酸酯类作为底物测量纳米高分子生物催化颗粒的生物催化活性总收率和聚合反应收率如图6所示。

[0054] 脂肪酶纳米凝胶的聚合反应收率(Nanogel yield％)随单体投料量的增大而提高，当投料量超过300份时达到饱和。而产物的生物催化活性总收率(CRL-pAM nanogelRA％)亦会在单体投料量在225～300份时达到最高收率。

[0055] 实施例5、One-pot法改变体系pH值

[0056] 将实施例1中的反应体系缓冲液分别改为pH值为3.0、4.0、6.0、8.0，其余配方和步骤与实施例1相同。此时，得到的产物以对硝基酚棕榈酸酯类作为底物测量纳米高分子生物催化颗粒的生物催化活性总收率和聚合反应收率如图7所示。

[0057] 当pH＞3时，脂肪酶纳米凝胶的聚合反应收率(yield％)有明显提高，后保持一定。而生物催化活性总收率(RA％)则在pH6附近达到最佳收率。

[0058] 本发明可用其它的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含有和范围内的任何改变，都应当认为是包括在权利要求书的范围内。