本发明提供了一种重组猪α-干扰素的制备方法，其是采用常规的PCR方法获得猪α-干扰素基因编码区，将其克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905A中，电转化毕赤酵母菌，筛选高抗性转化子，实现重组蛋白在毕赤酵母中的分泌表达，并得到具有抗病毒活性的重组蛋白。本发明通过优化毕赤酵母表达系统，提高了重组蛋白的抗病毒活性。
1.一种重组猪α-干扰素的制备方法，其特征在于，其是将猪α-干扰素基因克隆至载体pHBM905A中，并在毕赤酵母中进行诱导表达，包括以下步骤：
应用DNAstar基因分析软件，参照NCBI genbank上的猪α-干扰素基因成熟肽核苷酸序列AY331298，人工合成基因序列并应用软件设计扩增猪α-干扰素基因的特异性引物，引物首末为酵母表达载体pHBM905A连接位点，即下划线部分，引物序列5’-3’如下：
1：GTCAATGTGTGATTTGCCACAAACCCATTCACTTGCTCACACTAGAGC；
2：ATTCTTCTCATCTGAGCCAACAGTCTCAAAGCTCTAGTGTGAGCAAGT；
3：TTGGCTCAGATGAGAAGAATTTCTCCATTTTCTTGTTTGGATCATAGA；
4：CTTCATGTGGAGAACCGAAATCTCTTCTATGATCCAAACAAGAAAATG；
5：TCGGTTCTCCACATGAAGCTTTGGGTGGCAACCAAGTTCAAAAGGCCC；
6：GCAACATTTCGTGAACCAAAGCCATAGCTTGGGCCTTTTGAACTTGGT；
7：TTGGTTCACGAAATGTTGCAGCAAACTTTCCAATTGTTTTCTACTGAA；
8：ATTCATCCCATGCAGCAGCAGAACCTTCAGTAGAAAACAATTGGAAAG；
9：CTGCTGCATGGGATGAATCTTTGTTGCATCAATTTTGTACAGGTTTGG；
10：AGCTTCCAAGTCACGTAATTGCTGGTCCAAACCTGTACAAAATTGATG；
11：ATTACGTGACTTGGAAGCTTGTGTTATGCAGGAGGTTGGATTGGAAGG；
12：AAAATAGAATCTTCCTCCAACAATGGAGTTCCTTCCAATCCAACCTCC；
13：TGTTGGAGGAAGATTCTATTTTGGCTGTTAGGAAGTATTTTCATAGAT；
14：ACTTCTCTTGCAGGTACAATGGCAATCTATGAAAATACTTCCTAACAG；
15：ATTGTACCTGCAAGAGAAGTCTTACTCTCCATGTGCCTGGGAAATTGT；
16：GAAGAAAAAACTCTCATAACTTCAGCTCTAACAATTTCCCAGGCACAT；
17：TGAAGTTATGAGAGTTTTTTCTTCTTCCACTAACTTACAAGACAGATT；
18：GGCCATTATTCCTTCTTTCTCAATCTGTCTTGTAAGTTAGTGG；
通过PCR扩增以下反应体系，PCR加样如下：10mM引物1 1μl，10mM引物18 1μl，1mM引物2～17各1.5μl，2.5mM dNTP 4μl，5×PBS缓冲液10μl，Primestar 0.5μl，无菌水10μl，无需模板；
PCR反应条件：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸
10min；取10μL PCR产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收扩增产物进行测序，所得片段大小为615bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示；
载体pHBM905A用CpoI和NotI进行双酶切后检测回收，猪α-干扰素基因经PCR扩增，回收的目的片段用T4DNA聚合酶处理，反应体系为20μL，包括10×T4聚合酶缓冲液
2μL,dTTP 2μL,BSA 2μL,DNA片段8μL,T4DNA聚合酶0.2μL，三蒸水5.8μL；反应条件为12℃，30min，使目的基因两端形成与酶切后载体两端互补的粘性末端；将处理后的片段和载体连接，反应体系为4μL，DNA片段1.5μL，载体0.5μL，Solution Ⅰ2μL，反应条件为16℃，至少2个小时；连接后，转化至大肠杆菌工程菌DH10β；将重组子测序；经验证得到插入片段正确的重组子；摇菌，提质粒，经SalI酶切回收后进行巴斯德毕赤酵母（Pichia.pastoris）GS115的转化；
a)将10μL经酶切线性化的质粒与80μL的新鲜毕赤酵母感受态菌体混匀，转移至
c)所用电转化仪是美国的LIFE TECHNOLOGIES.INC公司的CELL-PORATOR，电转化使用的电压为412V；
d)电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至一个新的1.5ml的离心管中；
e)将菌体悬液涂布于MD平板上，每200μL涂布一块平板；
f)将平板置于30℃培养，2～3天后直至单菌落出现；
挑取转化子单菌落到BMGY平板上培养48小时，然后再点接到YPD或者MD平板上，以酵母菌为模板，做菌落PCR，10μL/管：50μL反应体系，引物P3、P4各1μL，2.5mM的dNTP
4μL，10×KOD DNA聚合酶缓冲液5μL，无菌水34μL，KOD DNA聚合酶5μL；
引物P3:5′-GTCAATGAAGATGGCTGGCCGCTTC-3′与引物P4:5′-GGCCATTAGGAGCTAGATTGTGGAGCAGGC-3′；
用BMGY液体培养基进行菌体的扩增培养，28-30℃，280-300rpm摇床培养至OD600=20-30；离心取菌体，转接到BMMY液体培养基中，25-28℃，280-300rpm摇床培养，每隔
一种重组猪α-干扰素的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程利用，具体地说，涉及一种重组猪α-干扰素的制备方法。
背景技术
[0002] 干扰素是动物中目前所知出现最早、作用最快的第一抵御病毒体系。已对人和鼠的干扰素进行了深入研究，但对于猪的干扰素研究相对较少。
[0003] 猪α干扰素是由10多个相关功能基因编码的蛋白质家族，猪α干扰素亚型与猪ω干扰素亚型之间有高度的同源性。天然猪α干扰素常常是猪α、ω干扰素功能基因表达产物的混合体。成熟的猪α-干扰素由166个氨基酸组成，诱导其分泌表达的信号肽由23个氨基酸组成。猪α干扰素无内含子，与人α干扰素基因的同源性最高。由于猪的病毒性疾病种类多、危害大，因此发展具广谱抗病毒效应的猪干扰素具有重要意义。但干扰素的传统提取方法产量低、操作繁琐，很难推广应用，因而寻找一种高效生产干扰素的方法成为亟待解决的问题。
[0004] 毕赤酵母表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统，可胞外表达外源蛋白。相比于大肠杆菌等原核表达系统，它具有完整的蛋白表达、加工和修饰功能，而与杆状病毒、哺乳动物细胞相比，它又具有培养成本低、产量高、便于产物的分离纯化等优点。近年来，甲醇营养型酵母表达系统的研究得到迅速发展，此系统具有高表达、高稳定、高分泌的特点，其宿主菌毕赤酵母自身蛋白分泌量少，高活性外源蛋白的分泌量大，利于下游分离纯化操作，能大规模发酵生产，是一种适宜表达外源基因的真核表达系统。
发明内容
[0005] 本发明旨在克服传统获得干扰素方法的不足，提供一种能够高效外源表达重组猪α-干扰素的真核表达系统。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的一种重组猪α-干扰素的制备方法，其是将猪α-干扰素基因克隆至载体pHBM905A中，并在毕赤酵母中进行诱导表达。其中，诱导表达的具体方法为：用BMGY液体培养基进行菌体的扩增培养，28-30℃，280-300rpm摇床培养至OD600＝20-30；离心取菌体，转接到BMMY液体培养基中，25-28℃，280-300rpm摇床培养，每隔24h补加甲醇至终浓度为0.5-1％。
[0007] 本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
[0008] 1、毕赤酵母重组表达载体的构建及筛选
[0009] 首先将载体pHBM905A用CpoI和NotI双酶切后检测回收，猪α-干扰素基因经PCR扩增，回收的目的片段用T4DNA聚合酶处理，将处理后的片段和载体连接，经验证得到插入正确的重组毕赤酵母载体。将重组毕赤酵母载体经SalI部分酶切回收后即可进行毕赤酵母的转化。
[0010] 挑取转化子单菌落到BMGY平板上培养48小时，然后再点接到含有底物的BMMY平板上，甲醇诱导(每块平板每24小时补加250μl甲醇)，通过单菌落在平板上产生的水解圈的大小来筛选重组毕赤酵母。
[0011] 2、猪α-干扰素基因在毕赤酵母中的诱导表达
[0012] 根据重组毕赤酵母在功能平板上的筛选，依据水解圈的大小，将有大的水解圈的重组酵母转化子进行摇瓶培养。首先用BMGY液体培养基进行菌体的扩增培养，30℃连续培养48小时左右。离心取菌体，转接到BMMY液体培养基，25℃培养，每隔24h补加100％甲醇至终浓度为1％，每隔24h取1mL进行SDS-PAGE分析表达水平。
[0013] 3、活性检测：在毕赤酵母中进行诱导表达，每12h取样一次，离心取上清，检测活性。从第一天到第四天，绘制诱导时间和活性大小的关系图。
[0014] 4、发酵工艺：将酵母克隆划线接种到平板上培养，挑取菌落培养，在无菌条件下取样检测，镜检无杂菌即可作为菌种。将种子菌种接种培养基培养，添加甲醇至终浓度为0.5％，在不同的培养时间检测其生物活性，处理菌液提取猪α-干扰素原液。
[0015] 5、猪α-干扰素对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的防治试验：进行动物实验以检测猪α-干扰素在预防和治疗猪繁殖与呼吸综合征中的作用。
[0016] 本发明采用常规的PCR方法获得猪α-干扰素基因编码区，克隆入毕赤酵母分泌型表达载体中，电转化毕赤酵母菌，筛选高抗性转化子，实现重组蛋白在毕赤酵母中的分泌表达，并得到具有抗病毒活性的重组蛋白。另外，本发明通过优化毕赤酵母表达系统，提高了重组蛋白的抗病毒活性。
具体实施方式
[0017] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0018] 实施例1毕赤酵母重组表达载体的构建
[0019] 1)引物的设计与合成
[0020] 应用DNAstar基因分析软件，参照NCBI genbank上的猪α-干扰素基因成熟肽核苷酸序列(AY331298)，人工合成基因序列并应用软件设计扩增猪α-干扰素基因的特异性引物，引物首末为酵母表达载体PHBM905a连接位点(下划线部分)。引物序列(5’-3’)如下：
[0021] 1：GTCAATGTGTGATTTGCCACAAACCCATTCACTTGCTCACACTAGAGC
[0022] 2：ATTCTTCTCATCTGAGCCAACAGTCTCAAAGCTCTAGTGTGAGCAAGT
[0023] 3：TTGGCTCAGATGAGAAGAATTTCTCCATTTTCTTGTTTGGATCATAGA
[0024] 4：CTTCATGTGGAGAACCGAAATCTCTTCTATGATCCAAACAAGAAAATG
[0025] 5：TCGGTTCTCCACATGAAGCTTTGGGTGGCAACCAAGTTCAAAAGGCCC
[0026] 6：GCAACATTTCGTGAACCAAAGCCATAGCTTGGGCCTTTTGAACTTGGT
[0027] 7：TTGGTTCACGAAATGTTGCAGCAAACTTTCCAATTGTTTTCTACTGAA
[0028] 8：ATTCATCCCATGCAGCAGCAGAACCTTCAGTAGAAAACAATTGGAAAG
[0029] 9：CTGCTGCATGGGATGAATCTTTGTTGCATCAATTTTGTACAGGTTTGG
[0030] 10：AGCTTCCAAGTCACGTAATTGCTGGTCCAAACCTGTACAAAATTGATG
[0031] 11：ATTACGTGACTTGGAAGCTTGTGTTATGCAGGAGGTTGGATTGGAAGG
[0032] 12：AAAATAGAATCTTCCTCCAACAATGGAGTTCCTTCCAATCCAACCTCC
[0033] 13：TGTTGGAGGAAGATTCTATTTTGGCTGTTAGGAAGTATTTTCATAGAT
[0034] 14：ACTTCTCTTGCAGGTACAATGGCAATCTATGAAAATACTTCCTAACAG
[0035] 15：ATTGTACCTGCAAGAGAAGTCTTACTCTCCATGTGCCTGGGAAATTGT
[0036] 16：GAAGAAAAAACTCTCATAACTTCAGCTCTAACAATTTCCCAGGCACAT
[0037] 17：TGAAGTTATGAGAGTTTTTTCTTCTTCCACTAACTTACAAGACAGATT
[0038] 18：GGCCATTATTCCTTCTTTCTCAATCTGTCTTGTAAGTTAGTGG
[0039] 2)PCR合成猪α-干扰素基因
[0040] 通过PCR扩增以下反应体系，PCR加样如下：引物11μl(10mM)，引物181μl(10mM)，引物2～17各1.5μl(1mM)，dNTP 4μl(2.5mM)，5X PS缓冲液10μl，Primestar(TaKara公司)0.5μl，无菌水10μl，无需模板。
[0041] PCR反应条件：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。取10μLPCR产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收扩增产物进行测序，所得片段大小为615bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示。
[0042] 4)猪α-干扰素基因重组毕赤酵母表达载体的构建
[0043] 载体pHBM905A用CpoI和NotI进行双酶切后检测回收，猪α-干扰素基因经PCR扩增，回收的目的片段用T4DNA聚合酶处理(反应体系为20μL，包括10×T4聚合酶缓冲液2μL，dTTP 2μL，BSA 2μL，DNA片段8μL，T4DNA聚合酶0.2μL，三蒸水5.8μL；反应条件为12℃，30min)，使目的基因两端形成与酶切后载体两端互补的粘性末端。将处理后的片段和载体连接(反应体系为4μL，DNA片段1.5μL，载体0.5μL，Solution I(TaKara公司)2μL，反应条件为16℃，至少2个小时)。连接后，转化至大肠杆菌工程菌10β。将重组子测序。经验证得到插入片段正确的重组子。摇菌，提质粒，经SalI酶切回收后即可进行毕赤酵母的转化，转化使用的是市售巴斯德毕赤酵母(Pichia.pastoris)GS115。
[0044] a)将10μL经酶切线性化的质粒与80μL的新鲜毕赤酵母感受态菌体混匀，转至住0.2cm预冷的电转化杯中；
[0045] b)将质粒与感受态混合物冰浴5min；
[0046] c)所用电转化仪是美国的LIFE TECHNOLOGIES.INC公司的CELL-PORATOR，电转化使用的电压为412V；
[0047] d)电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至一个新的1.5ml的离心管中；
[0048] e)将菌体悬液涂布于MD平板上，每200μL涂布一块平板；
[0049] f)将平板置于30℃培养，2～3天后直至单菌落出现。
[0050] 5)重组毕氏酵母的筛选及鉴定
[0051] 挑取转化子单菌落到BMGY平板上培养48小时，然后再点接到YPD或者MD平板上，以酵母菌为模板，做菌落PCR(10μL/管)：50μL反应体系，引物P3、P4各1μL，2.5mM的dNTP 4μL，10×kod缓冲液5μL，无菌水34μL，kod酶5μL。
[0052] 引物P3：5′-GTCAATGAAGATGGCTGGCCGCTTC-3′与引物P4：5′-GGCCATTAGGAGCTAGATTGTGGAGCAGGC-3′。
[0053] 实施例2外源基因在毕赤酵母中的高密度诱导表达
[0054] 1)挑取待表达的重组毕赤酵母单菌落于BMGY液体培养基(按≤10％装瓶)，28℃，280rpm。摇床培养至对数期(OD600＝2)。
[0055] 2)转接1mL培养液至100mLBMGY液体培养基(按≤10％装瓶)，28℃，280rpm摇床培养至对数中期(OD600＝20)。
[0056] 3)室温4,000rpm离心5min，收集菌体，去上清，细胞沉淀全部转移至100mL BMMY液体培养基中，28℃，280rpm摇床培养。
[0057] 4)每隔24h补加100％甲醇至终浓度为0.5％。
[0058] 5)从细胞沉淀转至BMMY液体培养基诱导开始，每隔24h取样1mL分析表达水平，确定最佳诱导时间为84h。
[0059] 6)选择最佳的诱导时间收集样品，室温12000r/min离心15min，取上清液进行SDS-PAGE电泳及Western-blot分析。
[0060] 实施例3外源基因在毕赤酵母中的高密度诱导表达
[0061] 1)挑取待表达的重组毕赤酵母单菌落于BMGY液体培养基(按≤10％装瓶)，30℃，300rpm。摇床培养至对数期(OD600＝6)。
[0062] 2)转接1mL培养液至100mLBMGY液体培养基(按≤10％装瓶)，28-30℃，300rpm摇床培养至对数中期(OD600＝30)。
[0063] 3)室温4,000rpm离心5min，收集菌体，去上清，细胞沉淀全部转移至100mL BMMY液体培养基中，28℃，300rpm摇床培养。
[0064] 4)每隔24h补加100％甲醇至终浓度为0.5％。
[0065] 5)从细胞沉淀转至BMMY液体培养基诱导开始，每隔24h取样1mL分析表达水平，确定最佳诱导时间为72h。
[0066] 6)选择最佳的诱导时间收集样品，室温12000r/min离心15min，取上清液进行SDS-PAGE电泳及Western-blot分析。
[0067] 实施例4外源基因在毕赤酵母中的高密度诱导表达
[0068] 1)挑取待表达的重组毕赤酵母单菌落于BMGY液体培养基(按≤10％装瓶)，29℃，290rpm。摇床培养至对数期(OD600＝4)。
[0069] 2)转接1mL培养液至100mLBMGY液体培养基(按≤10％装瓶)，29℃，290rpm摇床培养至对数中期(OD600＝25)。
[0070] 3)室温4,000rpm离心5min，收集菌体，去上清，细胞沉淀全部转移至100mL BMMY液体培养基中，28℃，290rpm摇床培养。
[0071] 4)每隔24h补加100％甲醇至终浓度为0.5％。
[0072] 5)从细胞沉淀转至BMMY液体培养基诱导开始，每隔24h取样1mL分析表达水平，确定最佳诱导时间为72h。
[0073] 6)选择最佳的诱导时间收集样品，室温12000r/min离心15min，取上清液进行SDS-PAGE电泳及Western-blot分析。
[0074] 实施例5表达蛋白纯化及活性检测
[0075] 1)表达产物的蛋白质含量测定
[0076] 对发酵诱导表达产物上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳后，进行R-250染色、脱色，置于薄层扫描仪(UVP凝胶成像分析系统)进行灰度扫描，通过Labwork软件系统来分析，利用牛血清蛋白做定量对照，计算样品总蛋白及总蛋白中PoIFN-α的有效含量。并用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度。结果如表1所示，蛋白浓度最高可达4.993mg/mL。
[0077] 2)表达产物的抗病毒活性检测
[0078] 生物学活性测定参照2002年中华人民共和国药典三部，附录XC细胞活性抑制法，用PK15细胞(ATCC Number：CCL-33)-水泡性口炎病毒(Vesicular stomatits virus，VSV)(ATCC Number：VR-1238AF)系统，采用CPE(细胞致病变效应)抑制为基础的抑制微量测定法，以每毫升干扰素检验品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50％)免受病毒攻击的稀释度的倒数为干扰素单位。
[0079] 具体方法为：取PK15细胞在96孔板中培养至全部贴壁生长后，去除培养液，分两组，一组将猪α-干扰素标准品稀释成1000U/ml，每孔加入0.1ml 4倍倍比稀释，一组每孔加入0.1ml 4倍倍比稀释的试验干扰素溶液，10小时后，用100TCID50剂量的水泡性口炎病毒进行攻毒，对照孔加无病毒的培养液，同时设立阴性对照(只家经倍比稀释的重组干扰素，不加病毒)、阳性对照(不加干扰素，只加病毒)、空白对照(不加干扰素，不加病毒)，在倒置显微镜下观察标准品1U/ml的孔出现50％病变的时候判断结果，经结晶紫染色后在波长570nm处测定吸光度，
[0080] 引进病毒滴度测定的Reed-Muench法计算干扰素效价(U/ml)，国际上最常采用的判定干扰素活性的方法是在标本的梯次稀释度中，仍能保护半数细胞免受攻击病毒损害的最高稀释度的倒数即为干扰素的效价。该方法的步骤为：
[0081] (1)根据酶标仪测定570nm光吸收进行计算
[0082] OD保护＝OD实测-OD病毒对照。
[0083] OD破坏＝OD细胞对照-OD实测。
[0084] (2)累积和计算保护百分比
[0085] 保护累积是由下向上累积。
[0086] 破坏累积是由上向下累积。
[0087] 保护百分比＝OD累积保护/(OD累积保护+OD累积破坏)×100％。
[0088] (3)计算IFN效价
[0089] Logx(样品IFN效价)＝(高于50％的百分数-50％)/(高于50％的百分数-低于50％的百分数)+logx(1/稀释度)
[0090] 式中X为IFN梯次稀释的稀释倍数，稀释度为高于50％的百分数所对应的稀释度。检测结果如表1所示。
[0091] 表1发酵液蛋白浓度及比活性检测结果
[0092]
[0093] 实施例6重组毕赤酵母的发酵
[0094] 1)种子液制备
[0095] 将酵母克隆划线接种到YPDS-zeocin平板上28-30℃培养72小时后，挑取菌落接种到YPD液体培养基中培养，在无菌条件下取样检测，镜检无杂菌即可作为菌种。发酵使用的种子液保存在4℃冰箱，应在48h内使用。
[0096] 2)发酵条件
[0097] 发酵培养基为BMGY，培养温度为28-30℃培养72小时，24h添加100％甲醇至终浓度为0.5％，接种量占培养基总体积的15％，280-300rpm培养后，检测其生物活性。
[0098] 3)提取工艺
[0099] 将重组毕赤酵母发酵后的发酵液离心处理，10000rpm//min 4℃离心，经0.22μm滤膜过滤后进行膜包超滤，取清澈液体，再进行浓缩过滤，无菌条件下收集猪-α干扰素原液。
[0100] 实施例7猪α-干扰素对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的防治试验[0101] 取经临床鉴定为患有猪流行性腹泻的21日龄大约克仔猪，70日龄杜洛克保育猪，5月龄大约克育成猪各10头，分为治疗组和对照组，每组每种各取5只，每组共15只。治疗组每天按剂量注射猪α-干扰素，对照组只注射等量的生理盐水，连续注射3天，每天观察并对临床症状经行评分，具体评分规则如表2所示，评分结果如表3所示。该结果表明，治疗组和对照组临床症状统计学评分存在显著差异。猪α-干扰素可以有效地治疗猪流行性腹泻，治疗过的发病猪病情明显好转，具体表现为白细胞数目上升至正常或接近正常，发热，呕吐，腹泻症状消失；而注射生理盐水的对照组症状无改善。
[0102] 表2临床症状评分规则
[0103]
[0104]
[0105] 表3治疗猪流行性腹泻的临床症状评分统计结果
[0106]
[0107] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
