一种改良的农杆菌介导的小麦幼穗转化方法及其应用

摘要

本发明涉及一种改良的农杆菌介导的小麦幼穗转化方法，属于农业生物技术领域和植物基因工程领域。主要步骤包括：小麦种植后，选择合适的转化时期，所述转化时期选择在小麦抽穗前约10～15d，小麦旗叶全部抽出，叶环距2～5cm左右时；将含有目的基因的农杆菌菌液活化、重悬后注入旗叶包被的幼穗，整个幼穗注射过程可以在大田或温室中进行，无需在无菌条件下操作。对操作人员的技术要求低，易于掌握，可以简单、快速、高效地获得转基因植株，排除体细胞无性系变异对转基因植株的影响，克服小麦基因型对农杆菌转化的限制，对于小麦基因功能的验证及基因工程育种具有重要的作用及广阔的应用前景。

权利要求

1.一种改良的农杆菌介导的小麦幼穗转化方法，其特征在于，小麦种植后，选择合适的转化时期，所述转化时期选择在小麦抽穗前10～15d，小麦旗叶全部抽出，叶环距2～5cm时；将含有目的基因的农杆菌菌液活化、重悬后注入旗叶包被的幼穗，整个幼穗注射过程可以在大田或温室中进行，无需在无菌条件下操作；所述含有目的基因农杆菌的活化与重悬后注入旗叶包被的幼穗具体操作如下：挑取YEP固体培养基平皿上带有目的基因和/或选择标记基因，或T-DNA区含有目的基因和/或选择标记基因的根癌农杆菌单菌落，接种于含附加抗生素的YEP液体培养基中，28℃、200rpm震荡培养，经2-3次活化，当菌液OD600至1.2左右时，4℃、7000rpm离心5分钟收集菌体，去掉上清液，用含终浓度为200μM的乙酰丁香酮的的1/2MS营养液悬浮菌体至OD600约为0.6，加入终浓度为0.02％的Silwet L-77，即可用于转化；将重悬的菌液用注射器从顶部注入旗叶包被的幼穗处，每穗100-200μl；所述的根癌农杆菌是带有目的基因的GV3101或C58C1菌株；筛选剂筛选是在T0和T1代苗期进行，分子生物学鉴定是在T1代苗期进行。

2.根据权利要求1所述的转化方法在转基因小麦中的应用，其特征在于：小麦种植后，选择合适的转化时期，所述转化时期选择在小麦抽穗前10～15d，小麦旗叶全部抽出，叶环距2～5cm时；将含有目的基因的农杆菌菌液活化、重悬后注入旗叶包被的幼穗，整个幼穗注射过程可以在大田或温室中进行，无需在无菌条件下操作。

说明书

一种改良的农杆菌介导的小麦幼穗转化方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种改良的农杆菌介导的小麦幼穗转化方法及其应用，属于农业生物技术领域和植物基因工程领域。

背景技术

[0002] 从20世纪90年代开始，转基因技术在作物遗传改良上的应用成为人们关注的热点。转基因技术能打破物种界限，实现不同物种间基因的转移。

[0003] 目前常用的小麦转基因方法大体可以分为两大类：一是不依赖于组织培养的转化法，如花粉管通道法、显微注射法等；二是依赖组织培养的转化法，包括基因枪法、农杆菌介导法、电击穿孔法、PEG法等。应用较为广泛的是基因枪法和农杆菌介导法。

[0004] 小麦遗传转化方法是进行小麦基因功能分析和改良小麦性状的必要手段，目前大多数的转化方法都需要组织培养技术，熟练的操作人员和特殊的设备。

[0005] 1993年Vasil等通过基因枪将删Gus/bar基因导入小麦品种Pavon中，宣告世界上第一株转基因小麦问世，此后基因枪法一直占据着小麦转基因手段的重要位置。由于受体取材广泛，转化的方法相对也比较成熟，所以基因枪法在植物遗传转化中得到广泛应用。但是由于受小麦基因型、取材的季节性、组织培养的手段等的限制，而且存在转化成本高、嵌合体比率大、转化拷贝数多易造成基因沉默、重组机制并不清楚等诸多问题，在小麦转基因中的应用也受到制约。

[0006] 农杆菌介导的遗传转化有其独特的价值，一方面它极大地促进人们对植物.微生物相互作用机制的认识；另一方面，由此转移的外源基因多以单拷贝或低拷贝数整合在受体细胞染色体上，有利于其产物的表达和在转基因植株后代中的遗传稳定。通常情况下，转化的对象是植物的原生质体、细胞和组织，再通过离体培养再生植株的试验程序获得转化体。虽然对某些植物这种转化方式十分有效，但步骤上的繁琐、过分依赖组织培养和植株再生技术，限制了它的应用范围，为此建立一些更方便高效的转化方法十分必要。

[0007] 基因枪转化法是一种DNA的直接转化法，而农杆菌转化法是一种生物转化，具有一定的主动性，且具有基因拷贝数低、发生转基因沉默相对较少、转移的基因片段较长、转化效率高等优点。尽管单子叶植物尤其是禾本科植物曾被认为不在农杆菌天然宿主范围之内，但近几年伴随着农杆菌介导的粳稻遗传转化体系的日趋成熟，表明单子叶植物也是能够被转化的。传统的农杆菌转化法大多采用侵染受体愈伤组织获得转化植株，很大程度上仍然要依赖组织培养和遗传转化的手段。目前研究表明，只有少数基因型材料能通过组织培养再生出大批植株，绝大多数具有重要经济价值的基因型仍难以利用。因此，选择合适的外植体作为农杆菌转化的受体，建立不受基因型限制的转化体系是目前农杆菌转化研究的重点。

[0008] 小麦是重要的粮食作物，但与水稻和玉米相比，小麦的遗传转化工作进展相对缓慢。小麦组织培养和植株再生技术体系尚不完善，植株再生对基因型依赖性很强，目前只有少数几个品种类型有较高的植株再生频率，大多数优良主栽品种植株再生频率极低，甚至完全不能分化再生植株；经继代的小麦愈伤组织，其生长较为缓慢，无论采用何种选择标记基因和筛选剂对小麦愈伤组织进行筛选都较为困难。因此，若能建立起不依赖植株再生技术的转化方法，将会极大地促进小麦遗传转化工作。

[0009] 依赖于组织培养的离体转化，必须使用选择标记基因和筛选剂，否则很难保证被转化的细胞正常生长直至最终再生植株。进行活体转化时，选择标记与选择剂仅仅起初步筛选的作用，考虑到目前所用的选择标记的环境与食品安全风险，可以从表达载体中去除选择标记基因，直接采用PCR初步鉴定转化体，这也是活体转化的另一个突出的优点。

[0010] 何道一等(2003)在小麦开花前的1-2d，将小花颖壳剪去约1/3，再将转化液悬浮的农杆菌滴入小花内。转化后对小麦幼胚和成熟中子分别进行卡那霉素筛选，获得可转化植株。

[0011] Janice等(Plant Cell Rep，2009，28：903-913)用处于开花还未露出叶鞘的小穗浸花的方法成功转化了六倍体小麦并能稳定表达外源基因。试验结果表明，不使用组织培养技术的浸花转基因方法，可以获得稳定遗传低拷贝数的转化株，在T5和T6代都观察到了基因的表达。

[0012] 上述的两种操作方法，均需要进行剪去颖壳或暴露小穗等操作。

发明内容

[0013] 本发明的技术效果能够克服上述缺陷，提供一种简便易行的小麦高效转基因方法，其弥补现行小麦转化操作繁琐的不足。

[0014] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：选择合适的转化时期；含有目的基因农杆菌的活化与重悬；利用小麦的天然生长状态进行幼穗转化；种子的收获及萌发；筛选、移栽及获得转基因植株子代；鉴定转基因植株及分析子代的遗传特性.[0015] 在小麦抽穗前约10～15d，小麦旗叶全部抽出，叶环距2～5cm左右时。此时小麦正处于花发育的减数分裂。幼穗包被于旗叶中。含有目的基因农杆菌的活化与重悬是指挑取YEP固体培养基平皿上带有双元载体——带有目的基因和/或选择标记基因，或共整合载体即T-DNA区含有目的基因和/或选择标记基因的根癌农杆菌单菌落，接种于含附加抗生素的YEP液体培养基中，28℃、200rpm震荡培养，经2-3次活化，当菌液OD600至1.2左右时，4℃、7000rpm离心5分钟收集菌体，去掉上清液，用含终浓度为200μM的乙酰丁香酮的的1/2MS营养液悬浮菌体至OD600约为0.6，加入终浓度为0.02％的Silwet L-77，即可用于转化；

[0016] 将重悬的菌液注入旗叶包被的幼穗处，每穗100-200μl。然后挂牌做标记。待抽穗后套袋，继续培养，收获T0种子。T0种子经消毒后播种，苗期用合适的筛选剂涂抹小麦心叶或喷洒整个植株，去掉对筛选剂敏感的植株，保留抗性植株并收获T1种子；T1种子经消毒后播种，生长至一叶一心期时用合适的筛选剂涂抹小麦心叶或喷洒整个植株，筛选获得抗性植株，然后进行分子生物学鉴定。整个幼穗注射过程可以在大田或温室中进行，无需在无菌条件下操作。

附图说明

[0017] 图1为T0植株盆栽涂抹巴龙霉素筛选；

[0018] 图2为T1筛选后的植株PCR扩增(M为分子量Marker；P为阳性质粒对照；1-21为转化的小麦，其中除了第10、11、13、15、17、21号植株外，均扩增出了约380bp的目的带；-CK为非转基因小麦对照；最后一个加样孔为以ddH2O为模板扩增的产物)。

具体实施方式

[0019] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

[0020] 小麦反义TaCKX1基因导入

[0021] 1.1实验材料及表达载体

[0022] 材料：本实验采用小麦济麦20.

[0023] 载体：带有反义TaCKX1基因的植物表达载体，筛选标记基因为NptII基因。

[0024] 1.2试验方法

[0025] 1.2.1基因导入

[0026] 于实验区内进行小麦转基因操作。

[0027] 转化时期为小麦抽穗前约10～15d，小麦旗叶全部抽出，叶环距2～5cm左右时。此时小麦正处于花发育的减数分裂。幼穗包被于旗叶中。整个幼穗注射过程可以在大田或温室中进行，无需在无菌条件下操作。

[0028] 含有目的基因农杆菌的活化与重悬：菌液为含有目的基因反义TaCKX1基因的农杆菌。挑取YEP固体培养基平皿上带有双元载体——带有目的基因和/或选择标记基因，或共整合载体即T-DNA区含有目的基因和/或选择标记基因的根癌农杆菌单菌落，例如带有目的基因的GV3101或C58C1菌株，接种于含卡那霉素的YEP液体培养基中，28℃、200rpm震荡培养，经2-3次活化，当菌液OD600至1.2左右时，4℃、7000rpm离心5分钟收集菌体，去掉上清液，用含终浓度为200μM的乙酰丁香酮的的1/2MS营养液悬浮菌体至OD600约为0.6，加入终浓度为0.02％的Silwet L-77，即可用于转化；

[0029] 将重悬的菌液从旗叶上方注入旗叶包被的幼穗处，每穗100-200μl。然后挂牌做标记。待抽穗后套袋，继续培养，收获T0种子。

[0030] T0种子经70％乙醇表面消毒1-2分钟，2％次氯酸钠消毒15分钟，无菌水冲洗4-5次，然后播种至营养钵中，生长至一叶一心期时用2％(W/V)的巴龙霉素(添加0.2％Tween-20)涂抹小麦心叶或喷洒整个植株，两天后去掉对筛选剂敏感的植株，保留抗性植株并收获T1种子；T1种子经消毒后播种，生长至一叶一心期时用2％(W/V)的巴龙霉素涂(添加0.2％Tween-20)抹小麦心叶或喷洒整个植株，筛选获得抗性植株，然后进行分子生物学鉴定。

[0031] 1.2.2PCR鉴定转化体

[0032] 采用CTAB法快速小量提取抗性植株小麦叶片DNA，制备出PCR模板。10μl体系内含DNA模板0.5μl、10μM的TaCKX1特异引物各0.5μl、Bioteck产2×PCR MasterMix5μl。PCR程序为95℃预变性3min；然后94℃30sec，56℃30sec，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸5min。转基因的TaCKX1特异扩增产物为380bp，小麦内源TaCKX1基因由于具有内含子序列，扩增产物为480bp。经琼脂糖凝胶电泳检测有预期长度的PCR产物后，PCR产物直接测序。阳性对照以带有反义TaCKX1基因的质粒做模板，阴性对照取未注射的相应小麦DNA做模板。

[0033] 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。