一种高效制备绵羊克隆胚胎的方法

摘要

本发明公开了一种高效制备绵羊优质克隆胚胎的方法，属于胚胎移植的方法领域。本发明通过搅拌筛选获得处于同一细胞周期的绵羊卵母细胞，将供体胞细胞核通过显微注射入移植入绵羊卵母细胞后，立即用融合液处理，处理后的胚胎放入成熟液培养形成融合胚胎，化学激活后启动重构胚胎卵裂。本发明通过搅拌法获得处于同一时期，成熟时间统一的绵羊卵母细胞，提供了新的挑选优质绵羊卵母细胞方法，提高了绵羊卵母细胞的成熟率。使用同一根注射针挤压去核同时注核的方法提高了核移植的操作效率。通过使用本发明开发的融合液可以使融合效率提高到95%以上，大大提高了克隆胚胎的成功率，且不影响后续的胚胎发育。本发明提供的方法降低了克隆胚胎制作过程中的胚胎损失，提高了生产绵羊克隆胚胎的效率，是一种高效制备绵羊优质克隆胚胎的方法，具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种高效制备绵羊克隆胚胎的方法，其特征在于通过搅拌筛选获得处于同一细胞周期的绵羊卵母细胞，将供体胞细胞核通过显微注射到所述绵羊卵母细胞后立即用融合液处理，融合后的胚放入成熟液培养形成融合胚胎；所述绵羊卵母细胞的制备方法为：预温的生理盐水清洗新鲜卵巢，收集卵巢表面2mm-6mm大小的卵泡于吸卵液中，卵泡液凝集为絮状后，用细棒轻柔搅拌使凝集物聚集，将凝集团撕碎并继续搅拌；在体视显微镜下收集卵丘-卵母细胞复合体，成熟液中洗3遍，置于成熟液微滴中，38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中成熟培养；所述融合液组成为：0.05-0.15g/LBSA，0.20-0.35M甘露醇，0.05-0.20mM醋酸钙，0.5-2 mM Hepes，超纯水溶解，不调pH值，调节渗透压为253-268 mOsm,0.22µm滤膜过滤，分装后4℃储存；所述吸卵液组成为：100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素，0.5%FBS，

25mg/ml肝素TCM199；所述成熟液组成为:15%PG处理后发情绵羊血清10 µg/ml FSH，20 µg/ml LH，1.5 µg/ml 17-ßE2溶于TCM199。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述供体细胞为成纤维细胞，来源于40天胚龄胎儿的头部。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于所述显微注射的具体步骤为：显微镜下筛选排出第一极体绵羊卵母细胞，置于覆盖有石蜡油10µl含10%FBS的H-M199的微滴中，通过显微注射将权利要求2所述供体细胞移植入去核绵羊卵母细胞透明带下，轻轻触压使供体细胞与细胞膜紧密接触，注射完成后立刻使用融合液处理。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于所述融合液组成为：0.1g/LBSA，0.28M甘露醇，

0.1mM醋酸钙，1 mM Hepes，超纯水溶解，不调pH值，调节渗透压为253-268 mOsm,0.22µm滤膜过滤，分装后4℃储存。

说明书

一种高效制备绵羊克隆胚胎的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种高效制备绵羊克隆胚胎的方法，属于胚胎移植的方法领域。

背景技术

[0002] 目前，生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。克隆羊“多莉”，以及其后各国科学家培育的各种克隆动物，采用的都是细胞核移植技术。所谓细胞核移植，是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微注射和细胞融合方法移植到卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。与胚胎分割技术不同，细胞核移植技术，特别是细胞核连续移植技术可以产生无限个遗传相同的个体。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，故人们往往把它称为动物克隆技术。

[0003] 目前细胞核移植过程中，操作人员大都仅凭主观判断来挑选用作成熟的卵母细胞，所有关于猪，山羊，绵羊、牛（Keefer， CL, H., Baldassarre, R.,Keyston. 2001. Generation of dwarf goat (Capra hircus) clones following nuclear transfer with transfected and nontransfected fetal fibroblasts and in vitro-matured oocytes. Biology of Reproduction, vol. 64 no. 3 849-856; 翁凡,郑小亮,刘哲.哺乳动物卵母细胞去核方法的研究进展[J],安徽农学通报.2007年21期; 桑国俊，牛卵母细胞及体外胚培养技术研究[D].甘肃农业大学.2008年; 吴志南，山羊卵泡卵体外成熟、体外受精及冷冻保存方法的研究[D].扬州大学.2005年）的卵母细胞筛选的报道和论文都是采取在体视显微镜下挑选有2-3层颗粒细胞的卵丘-卵母细胞复合体的方法，并不进行初步的筛选。且胚胎融合率较低，导致大量胚胎浪费及高昂成本，因此急需开发一套高效制备绵羊克隆胚胎的方法，包括优质核供体细胞的制备方法、通过搅拌法初步筛选绵羊卵母细胞以提高绵羊卵母细胞的成熟效率，提高核移植操作的效率，提高融合效率。

发明内容

[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种高效制备绵羊克隆胚胎的方法，以提高绵羊克隆胚胎制作效率。

[0005] 为解决上述技术问题，本发明通过搅拌筛选提高绵羊卵母细胞的体外成熟效率；选取长势良好的生长汇合的成纤维细胞作为核供体；采取挤压去核同时注核的方法提高核移植效率；通过优化融合液配方提高胚胎融合效率。

[0006] 具体实施步骤为：

[0007] 成熟绵羊卵母细胞的制备：将采集的卵巢置于30℃-35℃的灭菌生理盐水中，1h-2h内运回实验室。用预温的生理盐水清洗卵巢，用带8#针头的10ml注射器，内有吸卵液(含青霉素(100IU/ml)、链霉素(100IU/ml)，0.5%FBS，25mg/ml肝素TCM199（Tissue Culture Medium 199）)，吸取卵巢表面2mm-6mm大小的卵泡，卵泡液收集于烧杯中，静置
5min后卵泡液凝集为絮状，用细棒轻柔搅拌凝集物，待凝集物聚集成团后将凝集团扯碎并继续搅拌。将搅拌后卵泡液放在体视显微镜下收集有两层以上卵丘细胞包裹的绵羊卵母细胞用于成熟，将收集的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus Oocyte Complexes，COCs) 在成熟液中洗3遍，置于100µl成熟培养液微滴中，每滴放15个COCs，置于38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中成熟培养。

[0008] 供体细胞的准备：剖腹取40天胚龄的绵羊胎儿头部皮肤，尽量撕碎，将组织块按5mm左右间隔，接种在50 ml卡氏培养瓶的瓶底，每个瓶接种约25块左右，要尽量将组织块的切面贴在瓶底上，使组织块粘附在瓶底，放入培养箱，静置3h-4h，加5ml含15%FBS（fetal calf serum）的DMEM/F12 (Dulbecco's modified Eagle's medium mixed 1:1 with Ham's F-12)培养液，放入37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内静置培养3d后，换5ml含15%FBS的DMEM/F12新鲜培养液。以后每3d换培养液一次，3-4d可明显看到组织块周围有细胞长出，细胞向周围扩展，5d-8d由组织块长出的细胞汇合，用0.05%TE（胰蛋白酶－EDTA）消化传代，筛选长势旺盛的成纤维细胞，取5代以内的自然生长汇合的成纤维细胞作为核供体，用
0.05%TE 37℃消化1min，离心收集细胞后用操作液清洗3次放4℃冰箱备用。

[0009] 克隆胚胎的制备：

[0010] 1.将成熟培养22h-24h后的绵羊卵母细胞置于无血清的H-M199（HEPES-TCM199）中，用移液器反复吹吸成熟绵羊卵母细胞，待成熟绵羊卵母细胞周围的卵丘细胞部分脱落，再将成熟绵羊卵母细胞移入含0.25%透明质酸酶的H-M199中作用5min，然后用含10%FBS的 H-M199反复吹吸绵羊卵母细胞，直到无卵丘细胞为止。以排出第一极体为成熟标准，于显微镜下检查成熟情况。

[0011] 2．选取5代以内的自然生长汇合的成纤维细胞作为核供体，用0.05%TE37℃消化1min，终止消化后，离心收集细胞，用操作液清洗3次放4℃冰箱备用。

[0012] 3. 挑选排放第一极体并且形态正常的绵羊卵母细胞，置于7.5µg/ml细胞松弛素（CCB）中，作用5min，然后用含10%FBS的 H-M199清洗3遍，置于覆盖有石蜡油10µl含10%FBS的H-M199的微滴中，并将核供体细胞也置于微滴中，在显微操作系统下，用持卵针吸住绵羊卵母细胞，使极体处在5点钟的位置，用内径为20µm去核针扎破透明带挤出第一极体及其附近少量胞质，从破口处将供体成纤维细胞直接注射到去核绵羊卵母细胞透明带下，轻轻触压使供体细胞与细胞膜紧密接触。

[0013] 重构胚胎的融和及体外培养：供体细胞注射完成后立即用融合液融合，融合后放入成熟液中，培养4h后，用含5mM离子霉素5%FBS的H-M199中激活5min，移入含有2mM6-DMAP（6-二甲基氨基）的输卵管上皮培养液（SOFaa）中培养4h。将重构胚置于100µl的SOFaa培养液微滴中培养，每个微滴放入15枚重构胚，置于38.5℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，48h后检查卵裂情况，连续培养7d检查囊胚情况。

[0014] 本发明通过搅拌法筛选的绵羊卵母细胞大部分处于同一时期，成熟的时间统一，成熟过度的绵羊卵母细胞均凝集，质量差的卵丘细胞完全脱落，便于筛选，提高成熟率。采用本发明制作的成纤维细胞活力好，生长旺盛，接触性抑制可以将细胞周期调整到G0期，可以在卵细胞中启动重编程，发育到囊胚。本发明提供的融合液可以使融合效率提高到95%以上，大大提高了克隆胚胎的成功率，且不影响后续的胚胎发育。采用本发明提供的方法降低了克隆胚胎制作过程中的胚胎损失，提高了克隆胚胎的效率，是一种高效制备绵羊优质克隆胚胎的方法。

具体实施方式

[0015] 实施例1绵羊卵母细胞的成熟

[0016] 将新鲜采集的绵羊卵巢置于30℃-35℃的灭菌生理盐水中，1h-2h内运回实验室。用预温的生理盐水清洗卵巢，用带8#针头的10ml注射器，内有吸卵液(含青霉素(100IU/ml)、链霉素(100IU/ml)，0.5%FBS，25mg/ml肝素的TCM199)，吸取卵巢表面2mm-6mm大小的卵泡，卵泡液收集于烧杯中，静置5min后卵泡液凝集为絮状，用细棒轻柔搅拌凝集物，待凝集物聚集成团后将凝集团扯碎并继续搅拌。将搅拌后卵泡液放在体视显微镜下收集有两层以上卵丘细胞包裹的绵羊卵母细胞用于成熟，将收集的COCs 在成熟液中洗3遍，置于
100µl成熟培养液微滴中，每滴放15个COCs，置于38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中成熟培养。培养17h后第一极体排出率90.9%(1504/1654)。

[0017] 成熟液:15%PG处理后发情绵羊血清10 µg/ml FSH，20 µg/ml LH，1.5 µg/ml17-ßE2溶于TCM199。

[0018] 实施例2 供体细胞的准备

[0019] 剖腹取40天胚龄的绵羊胎儿头部皮肤，尽量撕碎，将组织块按5mm左右间隔，接种在50 ml卡氏培养瓶的瓶底，每个瓶接种约25块左右，要尽量将组织块的切面贴在瓶底上，使组织块粘附在瓶底，放入培养箱，静置3h-4h，加5ml含15%FBS的DMEM/F12培养液，放入37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内静置培养3d后，换5ml含15%FBS的DMEM/F12新鲜培养液。以后每3d换培养液一次，3d-4d可明显看到组织块周围有细胞长出，细胞向周围扩展，5d－8d由组织块长出的细胞汇合，可消化传代，筛选长势旺盛的成纤维细胞，鉴定核型，制作生长曲线，选取5代以内的自然生长汇合的成纤维细胞作为核供体，用0.05%TE37℃消化
1min，离心收集细胞后用操作液清洗3次放4℃冰箱备用。

[0020] 实施例3 克隆胚胎的制作

[0021] 1.将成熟培养22h-24h后的绵羊卵母细胞置于无血清的H-M199中，用移液器反复吹吸成熟绵羊卵母细胞，待成熟绵羊卵母细胞周围的卵丘细胞部分脱落，再将成熟绵羊卵母细胞移入含0.25%透明质酸酶的H-M199中作用5min，然后用含10%FBS的 H-M199清洗绵羊卵母细胞，直到无卵丘细胞为止。以排出第一极体为成熟标准，于显微镜下检查成熟情况。

[0022] 2.选取5代以内的自然生长汇合的成纤维细胞作为核供体，用0.05%TE37℃消化1min，终止消化后，离心收集细胞，用操作液清洗3次放4℃冰箱备用。

[0023] 3.挑选排放第一极体并且形态正常的绵羊卵母细胞，置于7.5µg/mlCCB中，作用5min，然后用含10%FBS的 H-M199清洗3遍，置于覆盖有石蜡油10µl含10%FBS的H-M199的微滴中，并将核供体细胞也置于微滴中，在显微操作系统下，用持卵针吸住绵羊卵母细胞，使极体处在5点钟的位置，先用内径为20µm的注射针吸取多个形态良好，表面粗糙的核供体细胞，用注核针扎破透明带然后用注射针挤压透明带外第一极体上方位置，挤出第一极体及其附近少量胞质，从破口处将去注核针内的供体成纤维细胞直接注射到去核绵羊卵母细胞透明带下，轻轻触压使供体细胞与细胞膜紧密接触。

[0024] 实施例4 重构胚胎的融和及体外培养

[0025] 供体细胞注射完成后立即用特制融合液融合，融合后放入成熟液中，4h后，用含5mM离子霉素5%FBS的H-M199中激活5min，移入含有2mM 6-DMAP的SOFaa培养液中培