桃枝条溃疡病菌的特异性PCR鉴别方法

摘要

本发明涉及一种桃枝条溃疡病菌的特异性PCR鉴别方法，采用引物对4进行PCR扩增，其正向引物序列为Pa-F2：5’GCCGGCCCCCTTCTG 3’，反向引物序列为Pa-R2：5’GCCTGCCTCGTTTTTACACA3’；所述的桃枝条溃疡病菌为Phomopsis amygdali。本发明的桃枝条溃疡病菌的特异性PCR鉴别方法可作为一种鉴定桃枝条溃疡病菌Phomopsis amygdali，以及Phomopsis属内、属外其它菌种的有效手段。本发明的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、操作简便，所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。

权利要求

1.一种桃枝条溃疡病菌（Phomopsis amygdali）的特异性PCR鉴别方法，其特征在于，采用正向引物序列为Pa-F2：5’GCCGGCCCCCTTCTG 3’，反向引物序列为Pa-R2：

5’GCCTGCCTCGTTTTTACACA 3’的引物对进行PCR扩增。

2.权利要求1所述的特异性PCR鉴别方法在桃枝条溃疡病菌鉴别中的应用。

3.权利要求1所述的引物对在桃枝条溃疡病菌特异性PCR鉴别中的应用。

说明书

桃枝条溃疡病菌的特异性PCR鉴别方法

技术领域

[0001] 本发明属有害生物分子诊断领域，具体涉及一种桃枝条溃疡病菌(Phomopsis amygdali)的特异性PCR鉴别方法。

背景技术

[0002] 桃(Prunus persica)属温带落叶果树，是原产于我国的一种果树。桃树品种很多，世界上大约有3000余个品种，其中我国有1000种以上。根据它们对气候条件的适应性、生长特性和果实特点，可分为若干品种群。

[0003] 以果实性状和成熟期分类，具体如下：①按果形分为普通桃、扁形桃(即蟠桃)。②按果皮茸毛有无分为毛桃、油桃，其中油桃是普通桃的单项变异。③按核与果肉的粘离度分为离核、粘核和半粘核。其中粘核是进化类型，离核品种果肉组织较松，有成熟不匀的现象。粘核品种果肉较致密，纤维少，果肉成熟度较为均匀，宜加工制罐。④按果肉质地分为肉溶质、肉不溶质及硬肉桃3种类型。其中溶质型果实成熟时柔软多汁，适宜鲜食。溶质型又可分为软溶质型和硬溶质型。不溶质型果实成熟时质地坚韧，富弹性，适于加工制罐(但还要求果肉不染红色)。硬肉桃果实初熟时果肉硬而脆，完熟时呈粘质，并变面，故以完熟前食用品质为佳。⑤按果肉颜色分为白肉桃、黄肉桃和红肉桃。⑥按果实生长日期分为特早熟品种、早熟品种、中熟品种和晚熟品种、特晚熟品种。

[0004] 以生态分类，具体如下：①北方品种群。主要分布于华北、西北、华中一带。以山东、河北、北京、山西、河南、陕西、甘肃及新疆栽培较多。本品种群比较抗寒和耐旱，不耐温暖多湿气候。②南方品种群。主要分布于我国长江以南的江苏、浙江、四川、贵州、湖北及湖南等省。该地区属于北亚热带和中亚热带的湿润性气候。本品种群又可分为水蜜桃、硬肉桃和蟠桃3种类型。水蜜桃果实多圆形，顶部平圆，果皮易剥离，果肉柔软多汁，不耐贮运。硬肉桃果实顶端有短尖，缝合线浅，肉质硬脆质密，汁液较少，较耐贮运。蟠桃果肉柔软多汁，多为水蜜桃型。③南欧品种群。系由我国甘肃、新疆向西传入欧洲后经长期驯化形成的品种。主要分布在地中海沿岸诸国。该地区属地中海式气候，在我国北方栽培比较适宜。

[0005] 我国除黑龙江省外，其他各省、市、自治区都有桃树栽培，主要经济栽培地区在华北、华东各省，较为集中的地区有北京海淀区、平谷县，天津蓟县，山东肥城、益都、青岛，河南商水、开封，河北抚宁、遵化、深县、临漳，陕西宝鸡、西安，四川成都，辽宁大连，浙江奉化，上海南汇、奉贤，江苏无锡、徐州。据2007年资料统计全国栽培面积已超过900万亩，生产桃40万吨，居世界第一位。宁波奉化、无锡阳山水蜜桃以及上海南汇水蜜桃、奉贤黄桃名闻遐迩。种桃已成为我国各地农民重要的主要经济收入来源。

[0006] 桃树上传统的病害种类很多，如树脂病、缩叶病、褐腐病等等，已为我国广大果农所熟悉。2009年春季在浙江嘉兴锦绣黄桃基地、上海南汇水蜜桃基地的部分果园内发生严重的枝条溃疡病，株发病率达30-40％，导致严重的产量损失。该病害在秋季通过叶痕，在春季通过芽、芽鳞痕、花、果痕等侵染桃树树枝，溃疡主要以枝条上节点为中心，初期红褐色，逐渐下陷成茶褐色，病害发展到初夏时可以杀死幼嫩枝条导致枝枯，并由此导致发病枝条果实不能长大而失去商品性。

[0007] 桃树枝条溃疡是一种由Phomopsis amygdali病菌侵染所致的真菌病害，目前在我国还未见报道。国际上该病于1934年在美国新泽西州首次发现，随后在上世纪40-50年代相继在马里兰、特拉华、弗吉尼亚、纽约、马萨诸塞等州发现，上世纪90年代后在阿拉巴马、佐治亚和南卡罗来那等美国东南部地区也有发现。

[0008] 本发明经对我国上海、浙江嘉兴等地的水蜜桃、黄桃枝条溃疡的病原进行研究，发现其病原一致，均为Phomopsis amygdali病菌，但该病菌危害桃枝条的情况在我国至今还未见报道。由于桃果实腐烂的发生也很严重，本发明同时还对其也进行了研究，发现其病原并不是Phomopsis amygdali，而是Phomopsis属内的其它菌种，且存在不同种病原真菌的混合侵染现象。危害桃枝条溃疡、桃果实腐烂的病菌虽然是同属不同种，其菌落、孢子形态相似，但在分子水平却有明显差异。因此，建立桃枝条溃疡病菌的快速检测方法，对于该病的快速诊断及防治具有非常重要的现实意义和应用价值。

发明内容

[0009] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种桃枝条溃疡病菌(Phomopsis amygdali)的特异性PCR鉴别方法，以弥补现有技术的空白。

[0010] 本发明从引起上海等地区水蜜桃、黄桃溃疡、腐烂的果实上分离得到多种Phomopsis属的病原真菌(Phomopsis spp.)，发现它们的病原菌与桃枝条溃疡病菌Phomopsis amygdali的形态相似。将这些病原真菌委托上海生工生物工程有限公司测序，分别获得了水蜜桃、黄桃枝条溃疡病菌株，水蜜桃、黄桃果腐病菌株等多种Phomopsis属病原真菌，经DNA相似性比对，发现水蜜桃和黄桃枝条溃疡病病原菌其分子特征序列相似性达99％的，而水蜜桃、黄桃果腐病病菌与枝条溃疡病菌相似性仅在89-95.9％。这说明桃枝条溃疡病菌与桃果腐病菌虽然在形态上相似而难以区分，但是通过分子特征序列是可以辨别区分的。

[0011] 因此，本发明提供一种桃枝条溃疡病菌的特异性PCR鉴别方法，针对桃枝条溃疡病菌与桃果腐病菌的分子特征序列差异，设计多个引物对，分别对桃枝条溃疡病菌、桃果实腐烂病菌进行特异性PCR扩增反应。

[0012] 其中扩增反应体系为20μl，包括模板DNA 1μL，引物对(正、反向引物)各2μL，dNTP混合物(2.0mM/每种)2μL，PCR反应缓冲液(10×)2μL，MgCl2溶液(25mmol/L)2μL，Taq酶(1u/μL)0.4μl，补充去离子水至20μl。

[0013] 扩增反应条件为：95℃ 3min 1个循环；95℃ 45sec，55-60℃ 30sec，72℃30sec，35循环；72℃ 10min 1个循环。

[0014] 将上述PCR扩增产物经Agrose凝胶电泳后分析，结果发现：仅有引物对4的PCR扩增方法可以特异性扩增出桃枝条溃疡病菌(Phomopsis amygdali)在326bp的目标片段，但不能在所有相似的桃果腐烂病菌以及美国的Phomopsis sp.菌中扩增出目标片段；采用引物对6的PCR扩增方法虽然可以扩增出桃枝条溃疡病菌(Phomopsis amygdali)在309bp的目标片段，但是在1个果腐Phomopsis病菌菌株和1个来自美国的Phomopsis菌株中也扩增出相同的309bp片段，同时在另1个果腐Phomopsis菌株中扩增出750-1000bp的片段。由此说明：引物对4可以用于桃枝条溃疡病菌的特异性PCR扩增检测以及水蜜桃、黄桃枝条溃疡病菌和其他Phomopsis属内、属外的病原真菌的鉴别，而引物对6却不能。

[0015] 所述引物对4和引物对6的序列分别如下：

[0016] 引物对4：

[0017] 正向引物Pa-F2：5’GCCGGCCCCCTTCTG 3’

[0018] 反向引物Pa-R2：5’GCCTGCCTCGTTTTTACACA 3’

[0019] 引物对6：

[0020] 正向引物Pa-F3：5’GGCCCCTCGTTCCTGAC 3’

[0021] 反向引物Pa-R2：5’GCCTGCCTCGTTTTTACACA 3’

[0022] 本发明的桃枝条溃疡病菌的特异性PCR鉴别方法可作为一种鉴定桃枝条溃疡病菌Phomopsis amygdali，以及Phomopsis属内、属外其它菌种的有效手段。

[0023] 本发明的优点：

[0024] 1)鉴别快速：完成鉴定时间仅需3-4小时；传统形态鉴定方法需要时间长，对于本发明涉及的拟茎点属病原真菌其形态鉴定仅仅所必须的分生孢子器诱导就需要14天以上的时间。

[0025] 2)方法灵敏：本发明可以检测出100fg以上的病菌DNA数量。

[0026] 3)特异性好：能够鉴别桃树枝条以及果实上的拟茎点属病原真菌，传统的通过分生孢子器以及分生孢子形态难于区别。

[0027] 4)操作简便：本发明仅仅需要1台PCR扩增仪以及PCR扩增反应所需的常规试剂。

[0028] 因此本发明的方法具有非常高的实用价值。

附图说明

[0029] 图1为桃枝条溃疡病原菌株的观察结果，其中A为该菌株的早期菌落，B为该菌株的中期菌落，C为该菌株的后期结果。

[0030] 图2为多个引物对PCR扩增桃枝条溃疡病菌菌株的1％凝胶电泳图，其中M：Marker；1-2：引物对1；3-4：引物对2；5-6：引物对3；7-8：引物对4；9-10：引物对5；
11-12：引物对6；13：阴性对照。

[0031] 图3为引物对4、6特异性PCR鉴别桃枝条溃疡病菌株的1％凝胶电泳图，其中M：Marker；1-10：PCR引物对4；11-20：PCR引物对6；21：阴性对照；A：桃果实腐烂病菌株；B：
美国桃树Phomopsis sp.病菌株；C：桃枝条溃疡病菌株。

具体实施方式

[0032] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0033] 实施例1 病原菌株的采集与获取

[0034] 桃枝条溃疡病菌株和桃果实腐烂病菌株均是从上海、浙江等地的水蜜桃、黄桃的溃疡枝条和腐烂果实病样采集而得到。将它们的病组织采用表面次氯酸钠或酒精消毒后，置于马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)(马铃薯200克，蔗糖20克，琼脂20克，蒸馏水1000毫升)上，25℃条件下培养2-3天后，将从病组织上长出的菌丝转至另外两个新的PSA培养基上。其中一个培养皿继续培养，进行病菌形态观察。图1为桃枝条溃疡病菌株的观察结果，其中A为该菌株的早期菌落，呈白色；B为该菌株的中期菌落，出现白色颗粒；C为该菌种的后期结果：逐渐发展成黑色的分生孢子器，其顶部会形成淡黄色的粘状物分生孢子，分别为呈椭圆形α型孢子和线形β型孢子。桃果实腐烂病菌株的菌落、分生孢子形态与桃枝条溃疡病的相似。

[0035] 另一个培养皿培养3-4天后，挑起分离物的菌丝块接种于健康的水蜜桃、黄桃的枝条或果实上，保湿48-78小时后(100％相对湿度)恢复到正常生长条件，将出现相同症状(桃溃疡病为下陷成茶褐色病斑症状，桃果腐病为圆形果实腐烂斑症状)的病枝或病果，再次通过表面次氯酸钠或酒精消毒病组织后置于PSA培养基分离，分离出在菌落形态(白色)、孢子形态(椭圆形α型孢子和线形β型孢子)与原先接种的病菌相同的分离物，分别获得2个桃枝条溃疡病菌株和7个桃果实腐烂病菌株。

[0036] 实施例2 桃枝条溃疡和桃果实腐烂病菌株的分子特征序列的测定

[0037] 将上述采集获得的桃条溃疡病菌株和桃果实腐烂病菌株分别用查氏培养液(蔗糖30g，硝酸纳3g，磷酸氢二钾1g，七水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，七水硫酸亚铁0.01g，蒸馏水1000毫升)24℃、100转/分、黑暗条件下培养4-5天后，用双层纱布过滤获得病菌菌丝体，然后用尿素提取法提取病菌菌丝体基因组的DNA。

[0038] 所述尿素提取法具体步骤如下：将0.5g研磨好的菌丝样品加入10mL尿素提取液(7mol/LUrea、50mmol/L Tris-HCl pH 8.0、62.5mmol/L NaCl、1％SDS)，摇匀，12000r/min离心5min，吸取上清液，上清液12000r/min再次离心5min，将上清液移入另一新管中，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1，体积比)溶液，用力振荡数次混匀，12000r/min离心5min；取上清到一新管中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，-20℃放置20min，12000r/min离心5min；弃上清液，倒置使管壁液体流尽，70％无水乙醇洗沉淀，室温放置干燥5～10min，溶于200μL双蒸水中，加入RNase A(10μg/μL)2μL，37℃水浴30min，-20℃保存备用。

[0039] 对上述提取获得的病菌菌丝体基因组DNA进行病菌特征序列的PCR扩增。扩增体系为20μl，包括模板DNA 1μL，引物P-F1和P-R1(10pmol/μL)各2μL，dNTP混合物(2.0mM/每种)2μL，PCR反应缓冲液(10×)2μL，MgCl2溶(25mmol/L)2μL，Taq酶(1u/μL)0.4μl，补充去离子水至20μl。其中，所述引物P-F1、P-R1的序列分别如下：

[0040] P-F1：5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’；

[0041] P-R1：5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’

[0042] 扩增条件为：94℃ 3min 1个循环；94℃ 1min，55℃ 30sec，72℃ 40sec，35个循环；72℃ 10min 1个循环。

[0043] 将上述扩增得到的PCR产物委托上海生工生物工程有限公司测序，分别获得水蜜桃枝条溃疡病菌株的分子特征序列(SEQ ID No 1)、黄桃枝条溃疡病菌株的分子特征序列(SEQ ID No 2)、水蜜桃果腐烂病5个菌株的分子特征序列(SEQ ID No 3、4、5、6、7)、黄桃果腐烂病2个菌株的分子特征序列(SEQ ID No 8、9)。

[0044] 实施例3 水蜜桃和黄桃的枝条溃疡病菌株、桃果腐病菌株的分子特征序列相似性比对

[0045] 将上述获得的水蜜桃和黄桃的枝条溃疡病菌、水蜜桃枝条溃疡病菌株与水蜜桃果腐病病菌株的分子特征序列分别进行相似性比对。结果发现：水蜜桃和黄桃的枝条溃疡病菌(SEQ ID No1和2)的分子特征序列相似性为99％；水蜜桃枝条溃疡病菌(SEQ ID No 1)与水蜜桃果实腐烂病病菌(SEQ ID No 5)的分子特征序列相似性为89％，具体比对如下。

[0046] 1、水蜜桃和黄桃枝条溃疡病菌分子特征序列相似性比对(灰色标示处为碱基不同处)：

[0047] 上：SEQ ID No 1

[0048] 下：SEQ ID No 2

[0049]

[0050] cggcgcaggc cggccccctt ctgggggccc ctcgttcctg acgaggagca ggctcgccgg[0051] cggcgcaggc cggccccctt ctgggggccc ctcgttcctg acgaggagca ggctcgccgg[0052]

[0053] aactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata[0054] aactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata[0055] agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgccctc[0056] agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgccctc[0057] tggtattccg gagggcatgc ctgttcgagc gtcatttcaa ccctcaagcc tggcttggtg[0058] tggtattccg gagggcatgc ctgttcgagc gtcatttcaa ccctcaagcc tggcttggtg[0059] atggggcact gccttgtgta aaaacgaggc aggccctgaa attcagtggc gagctcgcca[0060] atggggcact gccttgtgta aaaacgaggc aggccctgaa attcagtggc gagctcgcca[0061] ggactccgag cgcagtagtt aaaccctcgc tttggaagga ctggcggtgc cctgccgtta[0062] ggactccgag cgcagtagtt aaaccctcgc tttggaagga ctggcggtgc cctgccgtta[0063]

[0064] atatcaataa gcgga

[0065] atatcaataa gcgga

[0066] 2、水蜜桃枝条溃疡病和水蜜桃果腐病的病菌分子特征序列相似性比对(灰色标示处为碱基不同处)：

[0067] 上：SEQ ID No 1

[0068] 下：SEQ ID No 5

[0069]

[0070]

[0071]

[0072] aactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata[0073] aactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata[0074] agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgccctc[0075] agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgccctc[0076]

[0077]

[0078]

[0079]

[0080]

[0081] 实施例4 桃枝条溃疡病菌株的特异性PCR扩增

[0082] 针对上述桃枝条溃疡病菌和桃果实腐烂病菌的分子特征序列的相似性比对结果，设计6个引物对，并根据引物对的Tm值，确定PCR扩增的退火温度，然后对桃枝条溃疡病菌进行PCR扩增，扩增反应体系与实施例2相同。

[0083] 扩增反应条件如下：95℃ 3min 1个循环；95℃ 45sec，55-60℃ 30sec，72℃30sec，35循环；72℃ 10min 1个循环。

[0084] 将上述PCR扩增产物经1％Agrose凝胶电泳，结果表明：试验中设计的6个引物对对目标病原菌--桃枝条溃疡病菌分别都能扩增出309-430bp长度不等的唯一的特异性片段(参看图2)。

[0085] 其中，六对引物对序列分别如下：

[0086] 引物对1：

[0087] 正向引物Pa-F1：5’AACTTATACCTTACTGTTGCCTCG 3’

[0088] 反向引物Pa-R1：5’ACCGCCAGTCCTTCCAAA 3’

[0089] 引物对2：

[0090] 正向引物Pa-F1：5’AACTTATACCTTACTGTTGCCTCG 3’

[0091] 反向引物Pa-R2：5’GCCTGCCTCGTTTTTACACA 3’

[0092] 引物对3：

[0093] 正向引物Pa-F2：5’GCCGGCCCCCTTCTG 3’

[0094] 反向引物Pa-R1：5’ACCGCCAGTCCTTCCAAA 3’

[0095] 引物对4：

[0096] 正向引物Pa-F2：5’GCCGGCCCCCTTCTG 3’

[0097] 反向引物Pa-R2：5’GCCTGCCTCGTTTTTACACA 3’

[0098] 引物对5：

[0099] 正向引物Pa-F3：5’GGCCCCTCGTTCCTGAC 3’

[0100] 反向引物Pa-R1：5’ACCGCCAGTCCTTCCAAA 3’

[0101] 引物对6：

[0102] 正向引物Pa-F3：5’GGCCCCTCGTTCCTGAC 3’

[0103] 反向引物Pa-R2：5’GCCTGCCTCGTTTTTACACA 3’

[0104] 最后从上述引物对中选择两个引物对，即引物对4和引物对6分别对实施例1获得的2个桃枝条溃疡病菌株、7个桃果实腐烂病菌株以及1个本实验室保存的来源于美国的Phomopsis sp.菌株共10个病原菌菌株进行特异性PCR扩增，扩增反应体系条件与实施例2相同。

[0105] 1％Agrose凝胶电泳结果表明：采用引物对4的PCR扩增可以特异性扩增出桃枝条溃疡病菌(Phomopsis amygdali)在326bp的目标片段，但不能在所有相似的桃果腐烂病菌以及美国的Phomopsis sp.菌中扩增出目标片段；采用引物对6的PCR扩增虽然可以扩增出桃枝条溃疡病菌(Phomopsis amygdali)在309bp的目标片段，但是在1个果腐Phomopsis病菌菌株和1个来自美国的Phomopsis菌株中也扩增出相同的309bp片段，同时在另1个果腐Phomopsis菌株中还扩增出750-1000bp的片段(参看图3)。

[0106] 上述实验结果说明：引物对4可以用于桃枝条溃疡病菌的特异性PCR扩增检测以及水蜜桃、黄桃枝条溃疡病菌和其他Phomopsis属内、属外的病原真菌的鉴别，而引物对6却不能。

[0107] 需要说明的是，本领域技术人员在阅读了本发明上述所讲授的内容之后，可以对引物对4序列进行缩短或延长，进行PCR扩增，都可以得到本发明引物对4所取得的效果，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围本领域技术人员在本发明的技术。