本发明公开了一种松材线虫M型和R型株系的PCR-RFLP鉴别方法，通过DNA提取、PCR扩增、HhaI酶或和Hpy188I酶酶切反应及带谱鉴别，若HhaI酶酶切反应获得PCR-RFLP带谱最大条带为467bp，则为松材线虫M型株系II，最大条带为357bp或358bp，则再用Hpy188I酶酶切反应，若带谱最大条带为492bp，则为松材线虫M型株系I；若带谱最大条带为743bp或741bp，则为松材线虫R型株系；这样就能很明显区分松材线虫M型株系和松材线虫R型株系，为检疫鉴定及处理提供了保障。
1.一种松材线虫M型和R型株系的PCR-RFLP鉴别方法，其特征在于包括下述步骤：
a、DNA提取：将单条松材线虫挑入含有1μl 10×PCR Buffer溶液的PCR管中，先13000 rpm离心1 min，再置于液氮中速冷1 min，取出后立即在85℃条件下恒温2 min，再立即将PCR管的温度速降至56℃，恒温30 sec，在PCR管中加入浓度为1 mg/mL的蛋白酶K溶液
1μl，PCR管先在56℃下恒温15 min，再在95℃条件下恒温10 min，得到DNA提取液，-20℃保存备用；
b、PCR扩增：PCR扩增为50μl反应体系，包含10×PCR buffer溶液缓冲液5μl、浓度为50 mmol/L的MgCl2溶液5μl、浓度为10 mmol/L的dNTP溶液4μl、浓度为40 μmol/L 的上游引物3μl、浓度为40 μmol/L的下游引物3μl、上述DNA提取液10μl、ddH2O19.4μl和Taq聚合酶0.6 U；扩增反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性40 S，
55℃退火50 S，72℃延伸2 min，共35个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸10 min，得到PCR产物；所述上游引物为通用引物：5'- CGT AAC AAG GTA GCT GTA G -3'，下游引物为通用引物：5'- TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG -3'； c、酶切反应：将上述PCR产物6μl、10×PCR Buffer溶液1μl、去离子水2.5μl、HhaI酶0.5μl置于PCR管中，放入PCR仪，37℃保温条件下酶切反应3 h，然后进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察、拍照，获得PCR-RFLP带谱； d、带谱鉴别：上述PCR-RFLP带谱中若最大条带为467bp，则为松材线虫M型株系II，若最大条带为357bp或358bp，则用Hpy188I酶替换HhaI酶再重复上述酶切反应，若PCR-RFLP带谱中最大条带为492bp，则为松材线虫M型株系I，若带谱中最大条带为743bp或741bp，则为松材线虫R型株系。
一种松材线虫M型和R型株系的PCR-RFLP鉴别方法
技术领域
[0001] 本发明涉及松材线虫的PCR-RFLP鉴别技术；具体涉及一种松材线虫M型和R型株系的PCR-RFLP鉴别方法。
背景技术
[0002] 松材线虫Bursaphelenchus xylophilus是世界各国关注的重要危险性线虫，是松林的“头号杀手”，目前中国、韩国、欧盟、澳大利亚、新西兰等许多国家都将松材线虫列为检疫对象。拟松材线虫B.mucronatus与松材线虫十分相似，主要形态区别是：一般认为雌虫尾端指状，尾尖突长达3.5μm以上的为拟松材线虫；雌虫尾端宽圆，无尾尖突或尾端指状，尾尖突长1μm左右(不超过2μm)的为松材线虫。1983年，Wingfield等报道从美国明尼苏达和威斯康辛州的冷杉中发现松材线虫M型株系(mucronate form of B.xylophilus)，其雌虫有明显的尾尖突，形态特征更接近拟松材线虫。目前研究表明松材线虫种内可分为M型株系和R型株系(round-tailed form of B.xylophilus)；R型株系群体内总有一些雌虫尾部钝圆，无尾尖突；而M型株系群体内所有雌虫均有明显的尾尖突，与拟松材线虫很难区分。如果单纯使用形态学鉴定方法，松材线虫M型株系很可能被鉴定为拟松材线虫，导致漏检，从而可能导致松材线虫的传播与扩散，对林业生产造成巨大威胁。PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)鉴定技术是利用生物体内线粒体、核糖体等标记基因特征进行分子生物学区分，如斑潜蝇和巨蛎属牡蛎PCR-RFLP鉴别技术。而线虫核糖体DNA内部转录间隔区(ITS)序列进化速率较快，已用于线虫种及种内分类鉴别研究，目前公开的松材线虫及其近似种的PCR-RFLP鉴别，是选用Rsa I、Hae III、Msp I、HinfI和Alu I这5种限制性内切酶酶切，虽然能区分松材线虫和拟松材线虫，但不能区分松材线虫M型和R型株系。
发明内容
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种能区分鉴别松材线虫M型和R型株系的PCR-RFLP鉴别方法，为检疫鉴定及处理提供了保障。
[0004] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种松材线虫M型和R型株系的PCR-RFLP鉴别方法，通过对大量不同来源松材线虫和拟松材线虫株系的ITS区序列测定，通过DNAstar中的MapDraw软件分析，通过大量的对比试验，选取出区对松材线虫株系区分明显的限制性内切酶组合；随后进行线虫基因组DNA提取和目的片段的PCR扩增，最后利用选取的内切酶对PCR产物进行酶切和琼脂糖凝胶电泳检测，其特征在于包括下述步骤：
[0005] a、DNA提取：将单条松材线虫挑入含有1μl 10×PCR Buffer溶液(购自TaKaRa公司)的PCR管中，先13000rpm离心1min，再置于液氮中速冷1min，取出后立即在85℃条件下恒温2min，再立即将PCR管的温度速降至56℃，恒温30sec，在PCR管中加入浓度为1mg/mL的蛋白酶K溶液1μl(购自TaKaRa公司)，PCR管先在56℃下恒温15min，再在95℃条2+
件下恒温10min，得到DNA提取液，-20℃保存备用；PCR Buffer溶液(Mg free)：包括pH8.3的Tris-HCl溶液100mM，KCl溶液500mM；
[0006] b、PCR扩增：PCR扩增为50μl反应体系，包含10×PCR buffer溶液缓冲液5μl、浓度为50mmol/L的MgCl2溶液5μl、浓度为10mmol/L的dNTP溶液4μl(购自TaKaRa公司)、浓度为40μmol/L的上游引物3μl、浓度为40μmol/L的下游引物3μl、上述DNA提取液10μl、ddH2O19.4μl和Taq聚合酶0.6U(购自TaKaRa公司)；扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性40S，55℃退火50S，72℃延伸2min，共35个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸10min，得到PCR产物；所述上游引物为通用引物：5′-CGT AAC AAG GTAGCT GTA G-3′，下游引物为通用引物：5′-TTT CAC TCG CCG TTA CTAAGG-3′；
[0007] c、酶切反应：将上述PCR产物6μl、10×PCR Buffer溶液1μl、去离子水2.5μl、HhaI酶0.5μl(购自TaKaRa公司)置于PCR管中，放入PCR仪，37℃保温条件下酶切反应3h，然后进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察、拍照，获得PCR-RFLP带谱；
[0008] d、带谱鉴别：上述PCR-RFLP带谱中若最大条带为467bp，则为松材线虫M型株系II，若最大条带为357bp或358bp，则用Hpy188I酶(购自TaKaRa公司)替换HhaI酶再重复上述酶切反应，若PCR-RFLP带谱中最大条带为492bp，则为松材线虫M型株系I，带谱中最大条带为743bp或741bp，则为松材线虫R型株系。
[0009] 与现有技术相比，本发明的优点在于一种松材线虫M型和R型株系的PCR-RFLP鉴别方法，通过DNA提取、PCR扩增、HhaI酶或和Hpy188I酶酶切反应及带谱鉴别，若HhaI酶酶切反应获得PCR-RFLP带谱最大条带为467bp，则为松材线虫M型株系II，最大条带为357bp或358bp，则再用Hpy188I酶酶切反应，若带谱最大条带为492bp，则为松材线虫M型株系I；若带谱最大条带为743bp或741bp，则为松材线虫R型株系；这样就能很明显区分松材线虫M型株系和松材线虫R型株系，为检疫鉴定及处理提供了保障。
具体实施方式
[0010] 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0011] 实施例
[0012] 1、DNA提取：在灭菌的洁净载玻片上加适量灭菌的双蒸水，用灭菌的0号针将单条松材线虫(分别为M型株系I、II和R型株系I、II)挑入水滴中，再将松材线虫挑入内含8μl双蒸水和1μl 10×PCRBuffer灭菌的200μl PCR管中，13000rpm离心1min，然后置于液氮中速冷1min，取出，立即在85℃下恒温放置2min，迅速降温至56℃；然后向PCR管中加入浓度为1mg/mL的蛋白酶K溶液1μl，PCR管在56℃下恒温15min，再在95℃恒温10min，得到DNA提取液；
[0013] 2、PCR扩增：采用50μl反应体系，上游引物为5′-CGT AAC AAG GTA GCT GTA G-3′，下游引物为5′-TTT CAC TCG CCG TTACTAAGG-3′(上下游引物购自TaKaRa公司)，扩增反应体系为：10×PCR-buffer溶液5μl、浓度为50mmol/L的MgCl2溶液5μl、浓度为10mmol/L的dNTP溶液4μl、浓度为40μmol/L的上游引物3μl、浓度为40μmol/L的下游引物3μl、上述DNA提取液10μl、ddH2O19.4μl和Taq聚合酶0.6U；扩增反应条件为：
94℃预变性3min；94℃变性40S，55℃退火50S，72℃延伸2min，共35个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸10min；获得的PCR产物，松材线虫的片段长度为920bp-930bp；
[0014] 3、酶切反应：将上述PCR产物6μl、10×PCR Buffer溶液1μl、去离子水2.5μl置于PCR管中共7管，分别用0.5μl Rsa I、HaeIII、Msp I、HinfI、Alu I、HhaI和Hpy188I
