产生脂肪醛的方法和组合物转让专利
申请号 : CN200980148338.9
文献号 : CN102232110B
文献日 : 2016-01-06
发明人 : 穆尔塔扎·F·阿里比海 , 胡志浩
申请人 : REG生命科学有限责任公司
摘要 :
权利要求 :
1.产生脂肪醛的方法,所述方法包括:
(a)提供宿主细胞,其中所述宿主细胞被工程化以表达编码多肽的基因,其中所述多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO:22并且具有SEQ ID NO:9的磷酸泛酰巯基乙胺附着位点序列,其中所述多肽具有能有效地将脂肪酸转化为脂肪醛的羧酸还原酶活性,并且其中所述宿主细胞进一步被工程化以表达硫酯酶;和(b)在含有碳水化合物碳源的培养基中培养所述工程化的宿主细胞,所述培养处于有效地产生脂肪醛的条件。
2.产生脂肪醛的方法,所述方法包括:
(a)提供宿主细胞,其中所述宿主细胞被工程化以包含重组载体,其中所述重组载体包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列并且编码SEQ ID NO:9的磷酸泛酰巯基乙胺附着位点序列,其中所述核苷酸序列编码具有能有效地将脂肪酸转化为脂肪醛的羧酸还原酶活性的多肽,并且其中所述宿主细胞被工程化以表达硫酯酶;和(b)在含有碳水化合物碳源的培养基中培养所述工程化的宿主细胞,所述培养处于有效地产生脂肪醛的条件。
3.如权利要求1或2所述的方法,其还包括修饰所述宿主细胞中基因的表达,所述基因编码具有脂肪酸合酶活性的多肽。
4.如权利要求1所述的方法,其中所述硫酯酶具有在宿主细胞中的硫酯酶活性。
5.如权利要求4所述的方法,其中所述具有硫酯酶活性的多肽是EC3.1.2.14或EC
3.1.1.5。
6.如权利要求1或2所述的方法,其中所述宿主细胞是相对于野生型宿主细胞表达减弱水平的脂肪酸降解酶的遗传工程化的宿主细胞,其中所述脂肪酸降解酶具有酰基-CoA合酶活性。
7.如权利要求6所述的方法,其中所述具有酰基-CoA合酶活性的脂肪酸降解酶是EC
2.3.1.86。
8.如权利要求1或2所述的方法,其中所述宿主细胞选自哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、藻类细胞、真菌细胞和细菌细胞。
9.如权利要求1或2所述的方法,其中所述脂肪醛存在于所述宿主细胞的细胞外环境。
10.如权利要求9所述的方法,其中所述脂肪醛包括C6-C26脂肪醛。
11.如权利要求9所述的方法,其中所述脂肪醛是癸醛、十二醛、十四醛或十六醛。
12.如权利要求9所述的方法,其中所述脂肪醛是不饱和脂肪醛。
13.如权利要求9所述的方法,其中所述脂肪醛是饱和脂肪醛。
14.如权利要求1或2所述的方法,其中所述碳源是单糖。
15.如权利要求14所述的方法,其中所述单糖是葡萄糖。
16.如权利要求1或2所述的方法,其中在所述培养基中检测到所述脂肪醛。
17.如权利要求9所述的方法,其中在所述培养基中以至少25mg/L的产量产生所述脂肪醛。
18.如权利要求1或2所述的方法,其中所述宿主细胞是酵母细胞或丝状真菌细胞。
说明书 :
产生脂肪醛的方法和组合物
例如氮、氧或硫。
此外,不能保证这些井会含有石油。据估计,仅40%的钻井成为产生商业碳氢化合物的生产
井。除经济费用外,石油勘探存在严重的环境代价。例如近海勘探扰乱周围海洋环境。
济上合算,则使用二次采收(second recovery)。通常,二次采收涉及通过例如水注射、天然气注射或气举等增加井压。使用二次采油,采收到另外5%至15%的石油。一旦二次采收
方法不起作用,如果经济上合算,可以使用三次采收方法。三次方法涉及降低石油的粘度以
使其更易开采。使用三次采收方法,采收到另外5%至15%的石油。因此,即使在最佳条件
下,仅可以开采50%的井中石油。石油开采也存在环境代价。例如,石油开采可以导致大量
石油渗漏上升至表面。此外,近海钻井涉及挖掘河床,这扰乱或破坏周围海洋环境。
(cylcoalkanes))、脂肪族化合物、芳香族化合物等)的混合物。此外,原油含有其他有机化
合物(例如含有氮、氧、硫等的有机化合物)和杂质(例如硫磺、盐、酸、金属等)。
油、液化石油气等。
源于原油中较长链的碳氢化合物,这是通过以相当大的费用使用各种方法,例如催化裂化、
蒸汽裂化或催化重整,裂化原油。这些原材料用于制造不能直接从原油提炼的石化产品,例
如单体、溶剂、去垢剂或粘合剂。
腈、聚丙烯、氧化丙烯、丙烯二醇、乙二醇醚、丁烯、异丁烯、1,3-丁二烯、合成橡胶、聚烯烃、α-烯烃、脂肪醇、丙烯酸、丙烯聚合物、氯化丙烯、环氧氯丙烷和环氧树脂。
产更复杂的特种化学品的原材料。
会耗竭。
形式的空气污染也增加。大气中温室气体的累积可以导致增加全球变暖。因此,除局部破
坏环境外(例如油泄漏、海洋环境的挖掘等),燃烧石油还破坏全球环境。
和基于石油的燃料的燃烧所产生的类型的环境破坏的可再生石油资源的需要。基于相似原
因,还存在对于通常来自石油的化学品的可再生资源的需要。
萄酒等)。近年,通过先进的生物技术的发展,可能新陈代谢地工程化有机体以产生之前从
未产生过的生物产物。来源于这些细胞活性的诸如化学品的产物被称为生物产物。由这些
细胞活性产生的燃料被称为生物燃料。生物燃料是基于石油的燃料的可再生的替代选项。
生物燃料可以代替任何基于石油的燃料(例如,汽油、柴油、航空燃料、燃用油等)。生物燃
料可以来源于可再生的来源,例如植物物质、动物物质或甚至废品。这些可再生的来统称为
生物量。生物燃料相比基于石油的燃料的一个优势在于,它们不需要耗资和有风险的的勘
探或开采。另外,生物燃料可以在本地生产。因此,它们不需要长距离运输。此外,生物燃
料可以直接地制备而不需要耗资和能量密集的提炼,而这在提炼原油时是需要的。在其他
条件下,生物燃料可以需要有限的和经济有效的提炼水平。此外,使用生物燃料通过减少燃
烧期间释放的环境有害的排放(例如,温室气体,气体污染等)的量改善环境。例如,由于
生物燃料是从可再生的天然资源——生物量生产的,它维持平衡的碳循环。尽管生物燃料
的燃烧会释放碳(例如,以二氧化碳),但该碳会在生物量的产生期间在循环(例如,作物的
栽培),从而平衡碳循环,这与基于石油的燃料不同。
碳氢化合物(例如,烷烃、烯烃、或炔烃)、脂肪醇、酯、脂肪酸、脂肪醛和酮,比石化产品更优质,因为它们是直接产生的而不需要大量的提炼。与石化产品不同,生物来源的化学品不需
要像原油那样提炼以提取随后必须进一步加工以制备更复杂的石化产品的原材料。生物来
源的化学品是从生物量直接地转变为所需化学产品。
20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、
70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、114、116、118、120或122的氨基酸序列的脂肪醛生物合成多肽或其变体的基因。在一些实施方案中,该方法还包括从所述宿主细胞分离所
述脂肪醛。在某些实施方案中,所述脂肪醛存在于细胞外环境。在一些实施方案中,所述脂
肪醛分离自所述宿主细胞的细胞外环境。在一些实施方案中,所述脂肪醛分泌自所述宿主
细胞。在可选择的实施方案中,将所述脂肪醛运输进细胞外环境。在其他实施方案中,将脂
肪醛被动运输到细胞外环境中。
54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、114、116、118、120或
122的氨基酸序列,并且所述多肽具有羧酸还原酶活性。在一些实施方案中,所述多肽具有
脂肪酸还原酶活性。
替换;苏氨酸被丝氨酸替换;例如天冬氨酸和谷氨酸的酸性残基被另一酸性残基替换;诸
如天冬酰胺和谷氨酰胺的携带酰胺的残基被另一携带酰胺的残基替换;诸如赖氨酸和精氨
酸的碱性残基被另一碱性残基交换;以及诸如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族残基被另一芳香
族残基替换。在一些实施方案中,所述多肽具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、
50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸取代、添加、插入或缺失。在一些实施方案中,所述多肽具有脂肪酸酸还原酶活性。
肪酸合酶的基因和/或增加宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在可选择的实施
方案中,修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括减弱宿主细胞中编码脂肪酸合酶的基因和
/或降低宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在一些实施方案中,所述脂肪酸合酶
是硫酯酶。在具体实施方案中,所述硫酯酶是由tesA、缺乏前导序列的tesA、tesB、fatB、
fatB2、fatB3、fatA或fatA1编码的。
减弱水平的酰基CoA合酶。在具体实施方案中,所述宿主细胞表达减弱水平的酰基CoA合
酶,所述酰基CoA合酶由fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码。在一些实施方
案中,遗传工程化的宿主细胞包含一个或多个编码脂肪酸降解酶的基因的敲除,例如上述
的酰基CoA合酶基因。
或图6中列出的基因的敲除。在其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞以表达减弱水平的
酮脂酰-ACP合酶,例如由fabB或图7中列出的基因编码的酶。在其他实施方案中,该宿主
细胞包含fabB或图7中列出的基因的敲除。在仍然其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞
以表达修饰水平的编码去饱和酶的基因,例如desA。
abscessus)、鸟分支杆菌(Mycobacterium avium)、牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)、
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、
海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)和溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)的
分支杆菌。在其他实施方案中,细菌是诺卡氏菌(Nocardia sp.)、NRRL 5646、皮疽诺
卡氏菌(Nocardia farcinica)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、砂嗜盐产孢菌
(Salinispora arenicola)或番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganenesis)。
30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、
80、82、84、86、88、90、92、114、116、118、120或122的氨基酸序列具有至少约70%、至少约
75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%序列同一性的
氨基酸序列。在一些实施方案中,所述氨基酸序列是SEQ ID NO:18、20、22、24、26、28、30、
32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、
82、84、86、88、90、92、114、116、118、120或122的氨基酸序列。
一些实施方案中,脂肪醛由宿主细胞分泌。在可选的实施方案中,将脂肪醛运输到细胞外环
境。在其他实施方案中,脂肪醛被动运输到细胞外环境。
编码脂肪酸合酶的基因和/或增加宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在可选的实
施方案中,修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在宿主细胞中减弱编码脂肪酸合酶的基
因和/或降低宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在一些实施方案中,该脂肪酸合
酶是硫酯酶。在具体实施方案中,硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatA1编码。
减弱水平的酰基CoA合酶。在具体实施方案中,所述宿主细胞表达减弱水平的酰基CoA合
酶,所述酰基CoA合酶由fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码。在一些实施方
案中,遗传工程化的宿主细胞包含一个或多个编码脂肪酸降解酶的基因的敲除,例如上述
的酰基CoA合酶基因。
或图6中列出的基因的敲除。在其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞以表达减弱水平的
酮脂酰-ACP合酶,例如由fabB或图7中列出的基因编码的酶。在其他实施方案中,该宿主
细胞包含fabB或图7中列出的基因的敲除。在仍然其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞
以表达修饰水平的编码去饱和酶的基因,例如desA。
分枝杆菌、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌的分支杆菌。在其他实施方案中,细菌是诺卡氏菌
(Nocardia sp.)、NRRL 5646、皮疽诺卡氏菌、灰色链霉菌、砂嗜盐产孢菌或番茄溃疡病菌。
61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、113、115、117、119或121的核苷酸序列的互补序列或其片段杂交的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码具有羧酸还原酶活性的
多肽。在一些实施方案中,所述多肽具有脂肪酸还原酶活性。
一些实施方案中,脂肪醛由宿主细胞分泌。在可选的实施方案中,将脂肪醛运输到细胞外环
境。在其他实施方案中,脂肪醛被动运输到细胞外环境。
85、87、89、91、113、115、117、119或121的核苷酸序列的互补序列,或其片段,在低严紧性、中严紧性、高严紧性或非常高的严紧性条件下杂交。
编码脂肪酸合酶的基因和/或增加宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在可选的实
施方案中,修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在宿主细胞中减弱编码脂肪酸合酶的基
因和/或降低宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在一些实施方案中,该脂肪酸合
酶是硫酯酶。在具体实施方案中,硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatA1编码。
减弱水平的酰基CoA合酶。在具体实施方案中,所述宿主细胞表达减弱水平的酰基CoA合
酶,所述酰基CoA合酶由fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码。在一些实施方
案中,遗传工程化的宿主细胞包含一个或多个编码脂肪酸降解酶的基因的敲除,例如上述
的酰基CoA合酶基因。
或图6中列出的基因的敲除。在其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞以表达减弱水平的
酮脂酰-ACP合酶,例如由fabB或图7中列出的基因编码的酶。在其他实施方案中,该宿主
细胞包含fabB或图7中列出的基因的敲除。在仍然其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞
以表达修饰水平的编码去饱和酶的基因,例如desA。
细菌是选自耻垢分枝杆菌、脓肿分支杆菌、鸟分支杆菌、牛分支杆菌、结核分枝杆菌、麻风
分枝杆菌、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌的分支杆菌。在其他实施方案中,细菌是诺卡氏菌
(Nocardia sp.)、NRRL 5646、皮疽诺卡氏菌、灰色链霉菌、砂嗜盐产孢菌或番茄溃疡病菌。
或其变体,和(ii)修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达,包括在宿主细胞中表达编码脂肪酸
合酶的基因和/或增加宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在某些实施方案中,修
饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在宿主细胞中表达编码脂肪酸合酶的基因和/或增
加宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在可选的实施方案中,修饰编码脂肪酸合酶
的基因的表达包括在宿主细胞中减弱编码脂肪酸合酶的基因和/或降低宿主细胞中内源
脂肪酸合酶的表达或活性。在一些实施方案中,该脂肪酸合酶是硫酯酶。在具体实施方案
中,硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatA1编码。
一些实施方案中,脂肪醛由宿主细胞分泌。在可选的实施方案中,将脂肪醛运输到细胞外环
境。在其他实施方案中,脂肪醛被动运输到细胞外环境。
述多肽具有脂肪酸还原酶活性。
替换;苏氨酸被丝氨酸替换;诸如天冬氨酸和谷氨酸的酸性残基被另一酸性残基替换;诸
如天冬酰胺和谷氨酰胺的携带酰胺的残基被另一携带酰胺的残基替换;诸如赖氨酸和精氨
酸的碱性残基被另一碱性残基交换;以及诸如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族残基被另一芳香
族残基替换。在一些实施方案中,所述多肽具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、
50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸取代、添加、插入或缺失。在一些实施方案中,所述多肽具有羧酸还原酶活性。在一些实施方案中,所述多肽具有脂肪酸还原酶活性。
或图6中列出的基因的敲除。在其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞以表达减弱水平的
酮脂酰-ACP合酶,例如由fabB或图7中列出的基因编码的酶。在其他实施方案中,该宿主
细胞包含fabB或图7中列出的基因的敲除。在仍然其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞
以表达修饰水平的编码去饱和酶的基因,例如desA。
酸序列具有至少约70%序列同一性的氨基酸序列,和(ii)修饰编码脂肪酸合酶的基因的
表达,包括在宿主细胞中表达编码脂肪酸合酶的基因和/或增加宿主细胞中内源脂肪酸合
酶的表达或活性。在某些实施方案中,修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在宿主细胞
中表达编码脂肪酸合酶的基因和/或增加宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在可
选的实施方案中,修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在宿主细胞中减弱编码脂肪酸合
酶的基因和/或降低宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在一些实施方案中,该脂
肪酸合酶是硫酯酶。在具体实施方案中,硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、
fatB2、fatB3、fatA或fatA1编码。
一些实施方案中,脂肪醛由宿主细胞分泌。在可选的实施方案中,将脂肪醛运输到细胞外环
境。在其他实施方案中,脂肪醛被动运输到细胞外环境。
在一些实施方案中,所述氨基酸序列是SEQ ID NO:16。
或图6中列出的基因的敲除。在其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞以表达减弱水平的
酮脂酰-ACP合酶,例如由fabB或图7中列出的基因编码的酶。在其他实施方案中,该宿主
细胞包含fabB或图7中列出的基因的敲除。在仍然其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞
以表达修饰水平的编码去饱和酶的基因,例如desA。
酸编码具有羧酸还原酶活性的多肽;和(ii)修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达,包括在宿
主细胞中表达编码脂肪酸合酶的基因和/或增加宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活
性。在某些实施方案中,修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在宿主细胞中表达编码脂
肪酸合酶的基因和/或增加宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在可选的实施方案
中,修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在宿主细胞中减弱编码脂肪酸合酶的基因和/
或降低宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在一些实施方案中,该脂肪酸合酶是硫
酯酶。在具体实施方案中,硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatA1编码。在一些实施方案中,所述多肽具有脂肪酸还原酶活性。
一些实施方案中,脂肪醛由宿主细胞分泌。在可选的实施方案中,将脂肪醛运输到细胞外环
境。在其他实施方案中,脂肪醛被动运输到细胞外环境。
或图6中列出的基因的敲除。在其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞以表达减弱水平的
酮脂酰-ACP合酶,例如由fabB或图7中列出的基因编码的酶。在其他实施方案中,该宿主
细胞包含fabB或图7中列出的基因的敲除。在仍然其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞
以表达修饰水平的编码去饱和酶的基因,例如desA。
变体,其中遗传工程化宿主细胞以相对于野生型宿主细胞表达减弱水平的脂肪酸降解酶。
在一些实施方案中,遗传工程化宿主细胞以相对于野生型宿主细胞表达减弱水平的酰基
CoA合酶。在具体实施方案中,所述宿主细胞表达减弱水平的酰基CoA合酶,所述酰基CoA
合酶由fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码。在一些实施方案中,遗传工程化的宿
主细胞包含一个或多个编码脂肪酸降解酶的基因的敲除,例如上述的酰基CoA合酶基因。
一些实施方案中,脂肪醛由宿主细胞分泌。在可选的实施方案中,将脂肪醛运输到细胞外环
境。在其他实施方案中,脂肪醛被动运输到细胞外环境。
述多肽具有脂肪酸还原酶活性。
替换;苏氨酸被丝氨酸替换;诸如天冬氨酸和谷氨酸的酸性残基被另一酸性残基替换;诸
如天冬酰胺和谷氨酰胺的携带酰胺的残基被另一携带酰胺的残基替换;诸如赖氨酸和精氨
酸的碱性残基被另一碱性残基交换;以及诸如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族残基被另一芳香
族残基替换。在一些实施方案中,所述多肽具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、
50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸取代、添加、插入或缺失。
或图6中列出的基因的敲除。在其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞以表达减弱水平的
酮脂酰-ACP合酶,例如由fabB或图7中列出的基因编码的酶。在其他实施方案中,该宿主
细胞包含fabB或图7中列出的基因的敲除。在仍然其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞
以表达修饰水平的编码去饱和酶的基因,例如desA。
序列具有至少约70%序列同一性的氨基酸序列,其中遗传工程化宿主细胞以相对于野生
型宿主细胞表达减弱水平的脂肪酸降解酶。在一些实施方案中,遗传工程化宿主细胞以相
对于野生型宿主细胞表达减弱水平的酰基CoA合酶。在具体实施方案中,所述宿主细胞表
达减弱水平的酰基CoA合酶,所述酰基CoA合酶由fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、
EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的
基因编码。在一些实施方案中,遗传工程化的宿主细胞包含一个或多个编码脂肪酸降解酶
的基因的敲除,例如上述的酰基CoA合酶基因。
一些实施方案中,脂肪醛由宿主细胞分泌。在可选的实施方案中,将脂肪醛运输到细胞外环
境。在其他实施方案中,脂肪醛被动运输到细胞外环境。
在一些实施方案中,所述氨基酸序列是SEQ ID NO:16。
或图6中列出的基因的敲除。在其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞以表达减弱水平的
酮脂酰-ACP合酶,例如由fabB或图7中列出的基因编码的酶。在其他实施方案中,该宿主
细胞包含fabB或图7中列出的基因的敲除。在仍然其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞
以表达修饰水平的编码去饱和酶的基因,例如desA。
具有羧酸还原酶活性的多肽,并且其中遗传工程化宿主细胞以相对于野生型宿主细胞表达
减弱水平的脂肪酸降解酶。在一些实施方案中,遗传工程化宿主细胞以相对于野生型宿主
细胞表达减弱水平的酰基CoA合酶。在具体实施方案中,所述宿主细胞表达减弱水平的酰
基CoA合酶,所述酰基CoA合酶由fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码。在一些
实施方案中,遗传工程化的宿主细胞包含一个或多个编码脂肪酸降解酶的基因的敲除,例
如上述的酰基CoA合酶基因。
一些实施方案中,脂肪醛由宿主细胞分泌。在可选的实施方案中,将脂肪醛运输到细胞外环
境。在其他实施方案中,脂肪醛被动运输到细胞外环境。
或图6中列出的基因的敲除。在其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞以表达减弱水平的
酮脂酰-ACP合酶,例如由fabB或图7中列出的基因编码的酶。在其他实施方案中,该宿主
细胞包含fabB或图7中列出的基因的敲除。在仍然其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞
以表达修饰水平的编码去饱和酶的基因,例如desA。
NO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、
65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、113、115、117、119或121的核苷酸序列具有至少约70%的序列同一性。在一些实施方案中,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:17、19、
21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、
71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、113、115、117、119或121的核苷酸序列具有至少约
75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%序列同一性。在
一些实施方案中,所述核苷酸序列是SEQ ID NO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、
41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、
91、113、115、117、119或121的核苷酸序列。
一些实施方案中,脂肪醛由宿主细胞分泌。在可选的实施方案中,将脂肪醛运输到细胞外环
境。在其他实施方案中,脂肪醛被动运输到细胞外环境。
可操作地偶联到所述核苷酸序列的标记序列;(d)可操作地偶联到所述核苷酸序列的纯化
部分;(e)可操作地偶联到所述核苷酸序列的分泌序列;和(f)可操作地偶联到所述核苷酸
序列的引导序列(targeting sequence)。
型启动子区的控制。
编码脂肪酸合酶的基因和/或增加宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在可选的实
施方案中,修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在宿主细胞中减弱编码脂肪酸合酶的基
因和/或降低宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在一些实施方案中,该脂肪酸合
酶是硫酯酶。在具体实施方案中,硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatA1编码。
减弱水平的酰基CoA合酶。在具体实施方案中,所述宿主细胞表达减弱水平的酰基CoA合
酶,所述酰基CoA合酶由fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码。在一些实施方
案中,遗传工程化的宿主细胞包含一个或多个编码脂肪酸降解酶的基因的敲除,例如上述
的酰基CoA合酶基因。
或图6中列出的基因的敲除。在其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞以表达减弱水平的
酮脂酰-ACP合酶,例如由fabB或图7中列出的基因编码的酶。在其他实施方案中,该宿主
细胞包含fabB或图7中列出的基因的敲除。在仍然其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞
以表达修饰水平的编码去饱和酶的基因,例如desA。
NO:15的核苷酸序列具有至少约70%的序列同一性,和(ii)修饰宿主细胞中编码脂肪酸合
酶的基因的表达。在某些实施方案中,修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在宿主细胞
中表达编码脂肪酸合酶的基因和/或增加宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在可
选的实施方案中,修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在宿主细胞中减弱编码脂肪酸合
酶的基因和/或降低宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在一些实施方案中,该脂
肪酸合酶是硫酯酶。在具体实施方案中,硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、
fatB2、fatB3、fatA或fatA1编码。
一些实施方案中,脂肪醛由宿主细胞分泌。在可选的实施方案中,将脂肪醛运输到细胞外环
境。在其他实施方案中,脂肪醛被动运输到细胞外环境。
在一些实施方案中,所述核苷酸序列是SEQ ID NO:15的核苷酸序列。
可操作地偶联到所述核苷酸序列的标记序列;(d)可操作地偶联到所述核苷酸序列的纯化
部分;(e)可操作地连接到所述核苷酸序列的分泌序列;和(f)可操作地连接到所述核苷酸
序列的引导序列。
型启动子区的控制。
或图6中列出的基因的敲除。在其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞以表达减弱水平的
酮脂酰-ACP合酶,例如由fabB或图7中列出的基因编码的酶。在其他实施方案中,该宿主
细胞包含fabB或图7中列出的基因的敲除。在仍然其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞
以表达修饰水平的编码去饱和酶的基因,例如desA。
15的核苷酸序列具有至少约70%的序列同一性,其中遗传工程化宿主细胞以相对于野生
型宿主细胞表达减弱水平的脂肪酸降解酶。在一些实施方案中,遗传工程化宿主细胞以相
对于野生型宿主细胞表达减弱水平的酰基CoA合酶。在具体实施方案中,所述宿主细胞表
达减弱水平的酰基CoA合酶,所述酰基CoA合酶由fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、
EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的
基因编码。在一些实施方案中,遗传工程化的宿主细胞包含编码脂肪酸降解酶的一个或多
个基因的敲除,例如上述的酰基CoA合酶基因。
一些实施方案中,脂肪醛由宿主细胞分泌。在可选的实施方案中,将脂肪醛运输到细胞外环
境。在其他实施方案中,脂肪醛被动运输到细胞外环境。
在一些实施方案中,所述核苷酸序列是SEQ ID NO:15的核苷酸序列。
可操作地偶联到所述核苷酸序列的标记序列;(d)可操作地偶联到所述核苷酸序列的纯化
部分;(e)可操作地偶联到所述核苷酸序列的分泌序列;和(f)可操作地偶联到所述核苷酸
序列的引导序列。
型启动子区的控制。
或图6中列出的基因的敲除。在其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞以表达减弱水平的
酮脂酰-ACP合酶,例如由fabB或图7中列出的基因编码的酶。在其他实施方案中,该宿主
细胞包含fabB或图7中列出的基因的敲除。在仍然其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞
以表达修饰水平的编码去饱和酶的基因,例如desA。
NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10;(ii)SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14;和/或(iii)SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:
11;其中所述多肽具有羧酸还原酶活性。在一些实施方案中,所述多肽具有脂肪酸还原酶活
性。
一些实施方案中,脂肪醛由宿主细胞分泌。在可选的实施方案中,将脂肪醛运输到细胞外环
境。在其他实施方案中,脂肪醛被动运输到细胞外环境。
1100个氨基酸、长度为约1150个氨基酸、长度为约1200个氨基酸、长度为约1250个氨基
酸、长度为约1300个氨基酸、长度为约1400个氨基酸、长度为约1500个氨基酸、长度为约
1600个氨基酸、长度为约1700个氨基酸、长度为约1800个氨基酸、长度为约1900个氨基酸
或长度为约2000个氨基酸。在其他实施方案中,所述多肽的长度为高达约1500个氨基酸、
长度为高达约1400个氨基酸、长度为高达约1300个氨基酸、长度为高达约1250个氨基酸、
长度为高达约1200个氨基酸、长度为高达约1150个氨基酸、长度为高达约1100个氨基酸、
长度为高达约1050个氨基酸或长度为高达约1000个氨基酸。
编码脂肪酸合酶的基因和/或增加宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在可选的实
施方案中,修饰编码脂肪酸合酶的基因的表达包括在宿主细胞中减弱编码脂肪酸合酶的基
因和/或降低宿主细胞中内源脂肪酸合酶的表达或活性。在一些实施方案中,该脂肪酸合
酶是硫酯酶。在具体实施方案中,硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatA1编码。
减弱水平的酰基CoA合酶。在具体实施方案中,所述宿主细胞表达减弱水平的酰基CoA合
酶,所述酰基CoA合酶由fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码。在一些实施方
案中,遗传工程化的宿主细胞包含编码脂肪酸降解酶的一个或多个基因的敲除,例如上述
的酰基CoA合酶基因。
或图6中列出的基因的敲除。在其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞以表达减弱水平的
酮脂酰-ACP合酶,例如由fabB或图7中列出的基因编码的酶。在其他实施方案中,该宿主
细胞包含fabB或图7中列出的基因的敲除。在仍然其他实施方案中,遗传工程化宿主细胞
以表达修饰水平的编码去饱和酶的基因,例如desA。
单胞菌属(Pseudomonas)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、链孢霉属
(Neurospora)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、根毛霉属(Rhizomucor)、
克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、毛霉菌属(Mucor)、蚀
丝 霉 属 (Myceliophtora)、青 霉 属(Penicillium)、平 革 菌 属 (Phanerochaete)、
侧 耳 属 (Pleurotus)、栓 菌 属 (Trametes)、金 黄 孢 子 菌 属 (Chrysosporium)、
酵 母 属(Saccharomyces)、寡 养 单 胞 菌 属 (Stenotrophamonas)、裂 殖 酵 母 属
(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)或链霉菌属(Streptomyces)。
细胞、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)细胞、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus
alkalophilus)细胞、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)细胞、环状芽孢杆菌(Bacillus
circulans)细胞、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)细胞、苏云金芽孢杆菌(Bacillus
thuringiensis)细胞、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)细胞、巨大芽孢杆菌
(Bacillus megaterium)细胞、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞或解淀粉芽孢杆菌
(Bacillus amyloliquefaciens)细胞。
(Trichoderma longibrachiatum)细胞、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)细胞、烟曲
霉(Aspergillus fumigates)细胞、臭曲霉(Aspergillus foetidus)细胞、构巢曲霉
(Aspergillus nidulans)细胞、黑曲霉(Aspergillus niger)细胞、米曲霉(Aspergillus
oryzae)细胞、特异腐质霉(Humicola insolens)细胞、棉毛状腐质霉(Humicola
lanuginose)细胞、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)细胞、米黑根毛霉(Rhizomucor
miehei)细胞或米黑毛酶(Mucor michei)细胞。
绿色非硫细菌、紫色硫细菌、紫色非硫细菌、嗜极生物、酵母、真菌、其工程化的有机体或合成的有机体的细胞。在一些实施方案中,宿主细胞为光依赖性或固定碳。在一些实施方案
中,宿主细胞轻度依赖或固定碳。在一些实施方案中,宿主细胞具有自养活性。在一些实
施方案中,宿主细胞具有光合自养活性,例如在光的存在下。在一些实施方案中,在缺乏光
时,宿主细胞时异养的或兼养的。在某些实施方案中,宿主细胞是来自拟南芥(Avabidopsis thaliana)、柳枝稷(Panicum virgatum)、巨芒(Miscanthus giganteus)、玉 米(Zea
mays)、葡萄藻(Botryococcuse braunii)、莱菌衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、杜
氏盐藻(Dunaliela salina)、聚球蓝细菌(Synechococcus Sp.)PCC 7002、聚球蓝细菌
(Synechococcus Sp.)PCC 7940、聚球蓝细菌(Synechococcus Sp.)PCC6803、长嗜热聚球
蓝细菌(Thermosynechococcus elongates)BP-1、绿硫菌(Chlorobium tepidum)、荚膜
红细菌(Rhodobacter capsulatus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palusris)、将
达梭菌(Clostridium ljungdahlii)、热纤梭菌(Clostridiuthermocellum)、产黄青霉菌
(Penicillium chrysogenum)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母、粟酒裂殖酵
母(Schizosaccharomyces pombe)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)或运动发酵
单胞菌(Zymomonas mobilis)的细胞。
62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、114、116、118、120或122的氨基酸序列或其变体的脂肪醛生物合成多肽或(ii)由与SEQ ID NO:17、19、21、23、25、27、29、31、
33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、
83、85、87、89、91、113、115、117、119或121的核苷酸序列或其变体具有至少约70%同一性的核苷酸序列编码的脂肪醛生物合成多肽接触。在一些实施方案中,该方法还包括纯化脂
肪醛。
54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、114、116、118、120或
122的氨基酸序列,其中所述多肽具有羧酸还原酶活性。在一些实施方案中,所述多肽具有
脂肪酸还原酶活性。
替换;苏氨酸被丝氨酸替换;诸如天冬氨酸和谷氨酸的酸性残基被另一酸性残基替换;诸
如天冬酰胺和谷氨酰胺的携带酰胺的残基被另一携带酰胺的残基替换;诸如赖氨酸和精氨
酸的碱性残基被另一碱性残基交换;以及诸如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族残基被另一芳香
族残基替换。在一些实施方案中,所述多肽具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、
50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸取代、添加、插入或缺失。在一些实施方案中,所述多肽具有羧酸还原酶活性。在一些实施方案中,所述多肽具有脂肪酸还原酶活性。
86、88、90、92、114、116、118、120或122的氨基酸序列至少约75%、至少约80%、至少约
85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%一致的氨基酸序列。在一些实施方案中,
所述多肽具有SEQ ID NO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、
54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、114、116、118、120或
122的氨基酸序列。
83、85、87、89、91、113、115、117、119或121的核苷酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%序列同一性。在一些实施方案中,所述
核苷酸序列是SEQ ID NO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、
53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、113、115、117、119或
121。
9和SEQ ID NO:10;(ii)SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14;
和/或(iii)SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11;其中所述多肽
具有羧酸还原酶活性。在一些实施方案中,所述多肽具有脂肪酸还原酶活性。
个氨基酸、长度为约1150个氨基酸、长度为约1200个氨基酸、长度为约1250个氨基酸、长
度为约1300个氨基酸、长度为约1400个氨基酸、长度为约1500个氨基酸、长度为约1600
个氨基酸、长度为约1700个氨基酸、长度为约1800个氨基酸、长度为约1900个氨基酸或长
度为约2000个氨基酸。在其他实施方案中,所述多肽的长度为高达约1500个氨基酸、长度
为高达约1400个氨基酸、长度为高达约1300个氨基酸、长度为高达约1250个氨基酸、长度
为高达约1200个氨基酸、长度为高达约1150个氨基酸、长度为高达约1100个氨基酸、长度
为高达约1050个氨基酸或长度为高达约1000个氨基酸。
C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1、C20:1、C21:1、C22:1、C23:1、C24:1、C25:1或C26:1不饱和脂肪醛。在仍然其他实施方案中,所述脂肪醛
在Ω-7位置是不饱和的。在某些实施方案中,所述不饱和脂肪醛包含顺式双键。
NO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、
65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、113、115、117、119或121的核苷酸序列具有至少70%序列同一性的核苷酸序列,其中所述微生物相对于野生型微生物产生增高水平
的脂肪醛。
83、85、87、89、91、113、115、117、119或121的核苷酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%序列同一性。在一些实施方案中,所述
核苷酸序列是SEQ ID NO:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、
53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、113、115、117、119或
121。
有增强表达或活性的内源脂肪酸合酶。在可选的实施方案中,所述微生物具有减弱表达的
在宿主中编码脂肪酸合酶的基因和/或具有降低表达或活性的内源脂肪酸合酶。在一些
实施方案中,该脂肪酸合酶是硫酯酶。在具体实施方案中,硫酯酶由tesA、无前导序列的
tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatA1编码。
合酶。在具体实施方案中,所述微生物表达减弱水平的酰基CoA合酶,所述酰基CoA合酶由
fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码。在一些实施方案中,遗传工程化的微生物包含
一个或多个编码脂肪酸降解酶的基因的敲除,例如上述的酰基CoA合酶基因。
图6中列出的基因的敲除。在其他实施方案中,遗传工程化微生物以表达减弱水平的酮脂
酰-ACP合酶,例如由fabB或图7中列出的基因编码的酶。在其他实施方案中,该微生物包
含fabB或图7中列出的基因的敲除。在仍然其他实施方案中,遗传工程化微生物以表达修
饰水平的编码去饱和酶的基因,例如desA。
所述脂肪醛的δ C为约-15.4至约-10.9,或δ C为约-13.92至约-13.84。
脂肪醛的fM C为至少约1.01或至少约1.5。在一些实施方案中,所述脂肪醛的fM C为约
1.111至约1.124。
约275mg/L、约300mg/L、约325mg/L、约350mg/L、约375mg/L、约400mg/L、约425mg/L、
约450mg/L、约475mg/L、约500mg/L、约525mg/L、约550mg/L、约575mg/L、约600mg/L、
约625mg/L、约650mg/L、约675mg/L、约700mg/L、约725mg/L、约750mg/L、约775mg/L、
约800mg/L、约825mg/L、约850mg/L、约875mg/L、约900mg/L、约925mg/L、约950mg/L、约
975mg/L、约1000g/L、约1050mg/L、约1075mg/L、约1100mg/L、约1125mg/L、约1150mg/L、约
1175mg/L、约1200mg/L、约1225mg/L、约1250mg/L、约1275mg/L、约1300mg/L、约1325mg/L、约1350mg/L、约1375mg/L、约1400mg/L、约1425mg/L、约1450mg/L、约1475mg/L、约1500mg/L、约1525mg/L、约1550mg/L、约1575mg/L、约1600mg/L、约1625mg/L、约1650mg/L、约
1675mg/L、约1700mg/L、约1725mg/L、约1750mg/L、约1775mg/L、约1800mg/L、约1825mg/L、约1850mg/L、约1875mg/L、约1900mg/L、约1925mg/L、约1950mg/L、约1975mg/L、约2000mg/L或更高。
用于本发明的实践或测试,仍然在下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、
专利申请、专利和其他参考资料,包括GenBank数据库序列,通过引用全文并入。如有冲突,以包括定义在内的本说明书为准。此外,材料、方法和实施例仅是举例说明并不意图限制。
有相同生理功能的同源多肽的所有基因。多肽名称包括具有相同活性(例如催化相同基础
化学反应活性)的所有多肽。
Center for Biotechnology Information))。登录号按照截止到2008年十月的数据库中
提供的。
(可获取自http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)制定。本文引用的EC号来自
由东京大学部分资助的京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and
Genomics)所维护的KEGG配体数据库。除非另作说明,EC号按照截止到2008年十月的数
据库中提供的。
如,玉米、甘蔗或柳枝稷可以用作生物量。生物量的另一非限制性实例是代谢废物,例如动
物物质,例如牛粪。另外,生物量可以包括藻类或其他海洋植物。生物量还包括来自工业、
农业、林业和家庭的废品。可以用作生物量的这些废品的实例是发酵废渣、青贮饲料、秸秆、无用杂物、污水、垃圾、纤维质城市废物和剩余食物。生物量还包括例如碳水化合物(例如
单糖、二糖或多糖)的碳源。
糖和半乳糖;寡糖,例如低聚果糖和低聚半乳糖;多糖,例如木糖和阿拉伯糖;二糖,例如蔗糖、麦芽糖和松二糖;纤维素原料,例如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠;饱和或不饱和脂肪
酸酯,例如琥珀酸酯、乳酸酯和醋酸酯;醇,例如乙醇、甲醇或丙三醇或其混合物。碳源还可以是光合作用的产物,包括但不限于葡萄糖。优选的碳源是生物量。另一优选的碳源是葡
萄糖。
核酸链的互补序列可以是编码链的互补序列或非编码链的互补序列。
包含很多参数,例如温度范围、通气水平和培养基组分。这些条件中每一个单独地并联合地
允许宿主细胞生长。示例性培养基包括培养液或凝胶。通常,所述培养基包括诸如葡萄糖、
果糖、纤维素等的碳源,该碳源可以直接被宿主细胞代谢。此外,培养基中可以使用酶以便
于促进动员(例如淀粉或纤维素的解聚为可发酵的糖)和随后碳源的代谢。
如,可以测试样品或宿主细胞在其中生长的培养基中的宿主细胞的所需产物的存在。当测
试产物的存在时,可以使用的检测诸如但不限于TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MS。
需生物性质),可以按照Bowie et al.Science(1990)247:1306 1310中所述进行测定。“保
守型氨基酸取代”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所替代的取代。具有相似氨
基酸侧链的氨基酸残基家族,在本领域中已有定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸:
碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的
极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、
组氨酸)。
子充当转录调节元件并且还提供基因转录为mRNA的起始位点。控制元件与参与转录的细
胞蛋白特异性相互作用(Maniatis et al,Science 236:1237,1987)。
饱和的。在优选的实施方案中,所述脂肪酸由脂肪酸生物合成途径产生。
酸,并且在一些实施方案中可以与其他酶一起表达以产生具有所需碳链特征的脂肪酸。
解酶的其他实例。
产物。所述脂肪酸生物合成途径包括脂肪酸合酶酶类,所述脂肪酸合酶酶类可以按照本文
所述经工程化产生脂肪酸衍生物,并且在一些实施例中可以与其他酶一起表达以产生具有
所需碳链特征的脂肪酸衍生物。示例性的脂肪酸衍生物包括,例如脂肪酸、酰基CoA、脂肪
醛、短和长链醇、碳氢化合物、脂肪醇和酯(例如蜡、脂肪酸酯或脂肪酯)。
实例包括脂肪酸合酶、硫酯酶、酰基CoA合酶、酰基CoA还原酶、醇脱氢酶、醇酰基转移酶、形成脂肪醇的酰基CoA还原酶、脂肪酸(羧酸)还原酶、醛还原酶、酰基ACP还原酶、脂肪酸羟
化酶、酰基CoA去饱和酶、酰基ACP去饱和酶、酰基CoA氧化酶、酰基CoA脱氢酶、酯合酶和
烷生物合成多肽等。脂肪酸衍生酶可以将底物转化为脂肪酸衍生物。在一些实施例中,所
述底物可以是被脂肪酸衍生酶转化为不同的脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物。
文描述了脂肪酸酶的其他实例。
描述了脂肪酸合酶的其他实例。
一个实施方案中,R基长度为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19或20个碳。
14 12
涉及0.95倍的 C/ C同位素比例HOxI(参考AD 1950)。这粗略地等于衰变校正的工业革
命前树木(decay-corrected pre-Industrial Revolution wood)。对于现今生命生物圈
(植物物质)而言,fM约为1.1。
N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍处理的诱变,定点诱变、同源重组、插入-缺失诱变、或
“Red-driven integration”(Datsenko et ah,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:6640-45,
2000)。例如,在一实施方案中,将构建体引入宿主细胞从而可能在宿主细胞中选择同源重
组事件。本领域技术人员会容易地设计包含阳性或阴性选择基因的敲除构建体,所述选择
基因有效地选择经历了同源重组事件、具有构建体的转染的细胞。例如,宿主细胞中的改变
可以通过用包含改变的DNA序列置换野生型DNA序列获得,所述置换通过单或双交叉重组。
例如,为了方便地选择转化体,所述改变可以是编码抗生素抗性标记的DNA序列或与宿主
的可能的营养缺陷型互补的基因。突变包括但不限于,缺失-插入突变。这类改变的实例
包括基因中断,即基因干扰使得从该基因正常产生的产物没有以功能形式产生。这可以是
由于完全缺失、选择性标记的缺失或插入、选择性标记的插入、移码突变、框内缺失或导致
提前终止的定点突变。在一些实例中,该基因的完整mRNA是不存在的。在其他情况下,产
生的mRNA的量发生变化。
比较目的可以忽略非同源序列)。在优选的实施方案中,用于比较目的的而比对的参考序列
长度,为参考序列长度的至少约30%、优选地至少约40%、更优选地至少约50%、更优选地
至少约60%并且更优选地至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。然后比较位
于相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序
列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时,则分子在该位置是相同的(如本文所用
的,氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比是所述序列所共享的相同位置数的函数,这考虑到空位数和每个空位的长度,为了两个
序列的最佳比对需要引入空位。
Wunsch(1970)、J.Mol.Biol.48:444 453的算法,其被并入GCG软件包中的GAP程序中,使
用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵,以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。在另一优选的实施方案中,使用以下测定两个核苷酸序列之间的同源性
百分比:GCG软件包中的GAP程序,使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或80的空
位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。特别优选的参数组(和如果操作者不确定应当应用
哪些参数确定分子是否在要求的同源性限制内而应该使用的参数组)是具有12的空位罚
分、4的空位延伸罚分和5的移码空位罚分的Blossum 62评分矩阵。
达。宿主细胞的非限制性实例包括植物、动物、人、细菌、酵母或丝状真菌细胞。
in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术),John Wiley & Sons,N.Y.(1989),
6.3.1-6.3.6。该参考资料中描述了水性和非水性方法并且可以使用任一方法。本文涉及
的具体杂交条件如下:1)低严紧性杂交条件在约45℃下、在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)
中,然后是在至少50℃下、在0.2×SSC、0.1%SDS中洗涤两次(对于低严紧性条件,洗涤
温度可以升至55℃);2)中严紧性杂交条件在约45℃下在、在6×SSC中,然后是在60℃的
0.2×SSC、0.1%SDS中洗涤一次或多次;3)高严紧性杂交条件在约45℃的6×SSC中,然后
是在65℃下、在0.2×SSC、0.1%SDS中洗涤一次或多次;以及优选地4)非常高严紧性杂交
条件为65℃的0.5M磷酸钠、7%SDS,然后是在65℃下、在0.2×SSC、1%SDS中洗涤一次或
多次。除非另作规定,非常高的严紧性条件(4)是优选的条件。
核酸片段不是以片段天然存在的并不会在天然状态中发现。本文所用的术语“分离的”还
指从其他细胞蛋白分离的多肽,并且还指包括纯化的和重组的多肽两者。当核酸或多肽是
通过重组DNA技术产生时,本文使用的术语“分离的”还指基本上不含细胞物质、病毒物质
或培养基的核酸或肽。当核酸或多肽是化学合成时,本文所用的术语“分离的”还指基本上
不含化学前体或其他化学品的核酸或肽。本文所用的术语“分离的”,对于诸如脂肪醛的产
品而言,是指从细胞组分、细胞培养基或化学或合成前体分离的产物。
胞”(即,来自微生物的细胞)和“微生物”是可交换使用的并且表示仅借助于显微镜可见
的细胞或小有机体。
DNA的类似物,以及适用于所述实施方案的单链(有义或反义)和双链多核苷酸、EST、染色
体、cDNA、mRNA和rRNA。
翻译的方向,所述启动子位于所述选择的核苷酸序列的上游。“可操作地连接”表示将核苷
酸序列和调节序列连接以便当合适的分子(例如转录激活蛋白)与调节序列结合时允许基
因表达。
同种类的非重组宿主细胞中的浓度相比更高的浓度存在时,所述多肽在所述重组宿主细胞
中能够“超表达”。
中所述有机相是由脂肪醛形成的。但是,在一些实施例中,可以例如通过提供辛烷层来提
供有机相以便促进产物分离。当描述两相系统时,化合物的分配特性可以描述为logP。例
如,logP为1的化合物会10∶1分配到有机相。logP为-1的化合物会1∶10分配到有
机相。通过选择合适的发酵液和有机相,具有高logP值的脂肪醛在发酵容器中也会分离到
有机相中,即使处于很低的浓度。
的其他组分。如本文所用的这些术语还指从样品中去除污染物。例如,污染物的去除可以
导致样品中脂肪醛的百分比增加。例如,当脂肪醛在宿主细胞中产生时,可以通过去除宿主
细胞蛋白纯化脂肪醛。纯化后,样品中脂肪醛的百分比增加。
本与其他细胞组分(例如核酸、多肽、脂质、碳水化合物或其他碳氢化合物)隔离的脂肪醛。
在另一实施例中,纯化的脂肪醛制剂是这样的制剂,在该制剂中,所述脂肪醛基本不含例如
发酵后可能存在的那些污染物。在一些实施方案中,当样品重量的至少约50%是由脂肪醛
组成时,所述脂肪醛是纯化的。在其他实施方案中,当样品重量的至少约60%、70%、80%、
85%、90%、92%、95%、98%或99%或更多是由脂肪醛组成时,所述脂肪醛是纯化的。
主细胞以产生所述肽或RNA。
残基或核苷酸的第一氨基酸或核苷酸序列,这样所述第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有
相似活性。
反义表达的情况下,天然存在形式的多肽的表达遭到破坏。
计算机程序,例如LASERGENE软件(DNASTAR),可以找到确定哪些氨基酸残基可以被取代、
插入或缺失而不影响生物活性的指导。
mRNA加工中的可选的外显子剪接,会通常具有更多或更少的多核苷酸数。相应的多肽可以
具有另外的功能结构域或结构域缺失。物种变体是在物种之间彼此不同的多核苷酸序列。
得到的多肽通常会具有显著的相对于彼此的氨基酸同一性。多态性变体是在给定物种的个
体之间特定基因的多核苷酸序列中的变异。
体是能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的那些载体。能够指导基因的表达的载体在
本文被称为“表达载体”,所述载体被可操作地连接到所述基因。通常,在重组DNA技术中有用的表达载体经常是“质粒”的形式,所述“质粒”通常是指在其载体形式时不与染色体结
合的环状双链DNA环。在本说明书中,因为质粒是最通常使用的载体形式,所以“质粒”和
“载体”是交换使用的。但是,还包括发挥等同功能并随后至今成为本领域已知的表达载体
的这些其他形式。
径中,首先用ATP活化脂肪酸,然后用羧酸还原酶(CAR)样酶还原以产生脂肪醛。因此,本
文所述的脂肪醛生物合成核苷酸和多肽可以用于产生脂肪醛。
述脂肪醛生物合成基因编码图3所示的一个或多个氨基酸基序。例如,该基因可以编码包
含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10;SEQ ID NO:11;SEQ ID NO:
12;SEQ ID NO:13;SEQ ID NO:14;和/或SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的多肽。SEQ ID NO:7包括还原酶结构域;SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:14
包括NADP结合结构域;SEQ ID NO:9包括磷酸泛酰巯基乙胺附着位点;并且SEQ ID NO:10
包括AMP结合结构域。
应用中的价值的特征。在这些操作中,生成并表征了相对于获得自天然分离物的序列具有
一个或多个核苷酸差异的大量变体序列。通常,这些核苷酸差异导致相对于来自天然分离
物的核酸所编码的多肽的氨基酸改变。
DNA聚合酶的复制保真度低的条件下进行PCR,这样沿着PCR产物的整个长度获得了高效点
突变。简单地说,在这些操作中,将待诱变的核酸(例如脂肪醛生物合成多核苷酸序列)与
PCR引物、反应缓冲液、MgCl2、MnCl2、Taq聚合酶和适当浓度的dNTPs混合,以实现沿着PCR
产物的整个长度的高效点突变。例如,可以使用20fmoles的待诱变的核酸(例如脂肪醛生
物合成多核苷酸序列),30pmole的每种PCR引物,包含50mM KCl、10mM Tris HCl(pH 8.3)
和0.01%明胶的反应缓冲液,7mM MgCl2,0.5mM MnCl2,5单位的Taq聚合酶,0.2mM dGTP,
0.2mM dATP,1mM dCTP和1mM dTTP进行反应。PCR可以进行30个以下循环:94℃持续1分
钟、45℃持续1分钟和72℃持续1分钟。但是,应当理解到这些参数可以视情况变化。然
后,将诱变后的核酸克隆到合适的载体中并且评价所述诱变后的核酸编码的多肽的活性。
1988。简单地说,在这些操作中,合成大量带有一个或多个待被引入克隆DNA中的突变的双
链寡核苷酸并且将其插入待诱变的克隆DNA(例如脂肪醛生物合成多核苷酸序列)。重获含
有诱变后的DNA的克隆并且评价其编码的多肽的活性。
引发另一反应的产物。组合PCR描述于例如美国专利第5,965,408号。
迫的同源重组。然后是通过在PCR反应中的引物延伸固定交换。有性PCR诱变描述于例如
Stemmer,PNAS,USA 91:10747-10751,1994。
列来生成。这些“致突变(mutator)”菌株具有比野生型菌株更高的随机突变率。在这些菌
株的一个菌株中增殖DNA序列(例如脂肪醛生物合成多核苷酸序列)会最终在所述DNA中
产生随机突变。适用于体内诱变的致突变菌株描述于例如PCT公布第WO 91/16427号。
列。
算法则,所述群体成员的氨基酸序列是不同的。该方法使用反馈机制来控制连续轮的组合
盒诱变。回归整体诱变描述于例如Arkin et al.,PNAS,USA 89:7811-7815,1992。
其中小群残基被平行随机化以鉴定每个改变的位置上导致功能性蛋白的氨基酸。指数整体
诱变描述于例如Delegrave et al.,Biotech.Res.11:1548-1552,1993。随机诱变和定点
诱变描述于例如Arnold,Curr.Opin.Biotech.4:450-455,1993。
多肽的嵌合核酸序列。
修饰为脱氧尿苷和将脱氧胞苷修饰为5-甲基-2′-脱氧胞苷或5-溴-2′-脱氧胞苷。糖
部分的修饰包括修饰核糖的2′羟基以形成2′-O-甲基糖或′-O-烯丙基糖。可以修饰
脱氧核糖磷酸主链以产生吗啉代核酸,其中每个碱基部分连接到六元吗啉代环,或产生肽
核酸,其中脱氧磷酸主链被假肽主链代替并保留4个碱基(参见,例如Summerton et al.,
Antisense Nucleic Acid Drug Dev.(1997)7:187-195;和Hyrup et al.,Bioorgan.Med.
Chem.(1996)4:5-23.)。此外,脱氧磷酸主链可以被例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯主链、
亚磷酰胺、或烷基磷酸三酯主链所代替。
或多个氨基酸基序的多肽。例如,该多肽可以包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:
9和SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在其他情况下,该多肽包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:
12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中的一个或多个。在仍然其他实例中,该多肽包含SEQ
ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的氨基酸序列。SEQ ID NO:7包
括还原酶结构域;SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:14包括NADP结合结构域;SEQ ID NO:9包括
磷酸泛酰巯基乙胺附着位点;并且SEQ ID NO:10包括AMP结合结构域。
是遗传密码所编码的残基。
脂肪族氨基酸替换;丝氨酸被苏氨酸替换,或反之亦然;诸如天冬氨酸和谷氨酸的酸性残
基被另一酸性残基替换;诸如天冬酰胺和谷氨酰胺的携带酰胺的残基被另一携带酰胺基的
残替换;诸如赖氨酸和精氨酸的碱性残基被另一碱性残基交换;以及诸如苯丙氨酸和酪氨
酸的芳香族残基被另一芳香族残基替换。
如聚乙二醇)。
具有与其基本相同的氨基酸序列。
片段,所述片段包含图2和图4列出的氨基酸序列的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、50、
75、100或150个连续氨基酸。
集或纯化操作来获得。多肽变体或片段的序列可以通过蛋白水解消化、凝胶电泳和/或微
测序来确定。然后使用本文所述的任何程序,可以将所述多肽变体或片段的序列与图2和
图4列出的氨基酸序列进行比较。
底物、脂肪酸衍生物底物或本文所述的其他底物)接触。可以测量底物水平的下降或脂肪
醛水平的升高以测定产生脂肪醛的活性。
述抗体可以是,例如多克隆抗体;单克隆抗体或其抗原结合片段;例如嵌合抗体、重构抗体
(reshaped antibody)、人源化抗体的修饰的抗体或其片段(例如Fab′、Fab、F(ab′)2);
或例如单链抗体、单结构域抗体(DAB)、Fv、单链Fv(scFv)等的生物合成抗体。
手册I).Cold Spring Harbor Laboratory(1998年12月1日)。制备修饰的抗体和抗体
片段(例如嵌合抗体、重构抗体、人源化抗体或其片段,所述片段例如Fab′、Fab、F(ab′)2片段)或生物合成抗体(例如单链抗体、单结构域抗体(DABs)、Fv、单链Fv(scFv)等)的
方法是本领域已知的并且可以见于,例如Zola,Monoclonal Antibodies:Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives(单克隆抗体:
单克隆抗体和工程化抗体衍生物的制备和使用),施普林格(Springer Verlag)(2000年12
月15;第一版)。
物是脂肪酸衍生物(例如脂肪酸),并且具有特定分支模式和碳链长度的脂肪醛可以由具
有那些会导致所需脂肪醛的特定特征的脂肪酸衍生物产生。
成途径或脂肪醛途径的已知基因,以产生所需底物(参见,例如PCT/US08/058788)。示例性
基因提供于图5中。
制所产生的脂肪酸衍生物的长度、饱和度和分支。脂肪酸生物合成途径涉及前体乙酰CoA
和丙二酰CoA。该途径中的步骤由脂肪酸生物合成(fab)和乙酰CoA羧化酶(acc)基因家
族的酶催化(参见,例如Heath et al.,Prog.Lipid Res.40(6):467-97(2001))。
产生,可以在宿主细胞中表达一个或多个以下基因:pdh(包含aceEF(编码丙酮酸和2-酮
戊二酸脱氢酶复合物的E1p脱氢酶组分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组分,和lpd)的
多酶复合物)、panK、fabH、fabD、fabG、acpP和fabF。这些基因的示例性GenBank登录号
为:pdh(BAB34380、AAC73227、AAC73226)、panK(也称为CoA、AAC76952)、aceEF(AAC73227、AAC73226)、fabH(AAC74175)、fabB(P0A953)、fabD(AAC74176)、fabG(AAC74177)、
acpP(AAC74178)、fabF(AAC74179)。此外,可以通过用含有相应基因的无效或缺失突变的
条件复制或非复制质粒进行转化或通过取代启动子或增强子序列,在工程化的宿主细胞中
减弱或敲除fadE、gpsA、ldhA、pflb、adhE、pta、poxB、ackA和/或ackB的表达水平。这
些基因的示例性GenBank登录号为:fadE(AAC73325)、gspA(AAC76632)、ldhA(AAC74462)、
pflb(AAC73989)、adhE(AAC74323)、pta(AAC75357)、poxB(AAC73958)、ackA(AAC75356)和
ackB(BAB81430)。得到的宿主细胞当在合适的环境中生长时,会具有增加的乙酰CoA产生
水平。
引入宿主细胞,在宿主细胞中进一步超表达脂肪酸。
用的脂肪酸的量。
5382-5387,1996)。
不表达一种或多种选择的硫酯酶以增加优选的脂肪酸衍生物底物的产生。例如,C10脂肪酸
可以通过表达具有产生C10脂肪酸偏向性的硫酯酶并减弱具有产生除了C10脂肪酸外的脂肪
酸的偏向性的硫酯酶(例如,优选产生C14脂肪酸的硫酯酶)来产生。这会导致碳链长度为
10的脂肪酸的相对同种群体。在仍然其他情况下,C14脂肪酸可以通过减弱产生非C14脂肪
酸的内源硫酯酶并且表达使用C14-ACP的硫酯酶来产生。在一些情况下,C12脂肪酸可以通
过表达使用C12-ACP的硫酯酶并且减弱产生非C12脂肪酸的硫酯酶来产生。使用本领域已知
的方法可以证实乙酰CoA、丙二酰CoA和脂肪酸的过量产生,例如,通过在细胞裂解后使用
放射性操作、HPLC或GC-MS。可以用于本文所述的方法中的硫酯酶的非限制性实例在表1
中列出。
传工程化所述宿主细胞以相对于野生型宿主细胞增加所述宿主细胞中脂肪酸的水平。例
如,可以遗传工程化宿主细胞以相对于野生型宿主细胞表达降低水平的酰基CoA合酶。在
一实施方案中,通过遗传工程化“敲除”的宿主细胞以降低一个或多个基因(例如,酰基CoA
合酶基因)的表达水平。
的具体实例包括,来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv[NP_217021]的fadDD35、来
自结核分枝杆菌H37Rv[NP_217464]的fadDD22、来自大肠杆菌[NP_416319]的fadD、来自
大肠杆菌[YP 416216]的fadK、来自不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADP1[YP_045024]的
fadD、来自流感嗜血菌(Haemophilus influenza)RdkW20[NP_438551]的fadD、来自沼泽红
假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)Bis B18[YP 533919]的fadD、来自耐碱芽孢杆
菌(Bacillus halodurans)C-125[NP_243969]的BH3101、来自荧光假单胞菌(Pseudomonas
fluorescens)Pfo-1[YP 350082]的Pfl-4354、来自睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas
testosterone)KF-I[ZP_01520072]的EAV15023、来 自枯 草 芽 孢 杆菌 (B.subtilis)
[NP_388908]的yhfL、来自铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1[NP_251989]的fadD1、来
自青枯菌(Ralstonia solanacearum)GM1 1000[NP_520978]的fadD1、来自铜绿假单胞
菌PAO1[NP 251990]的fadD2、来自嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)
R551-3的编码蛋白ZP_01644857的基因、来自酿酒酵母[NP_012257]的faa3p、来自酿酒
酵母[NP_014962]的faa1p、来自枯草芽孢杆菌[CAA99571]的lcfA,或描述于Shockey
et al.,Plant.Physiol.129:1710-1722,2002;Caviglia et al,J.Biol.Chem.279:
1163-1169,2004;Knoll et al.,J.Biol.Chem.269(23):16348-56,1994;Johnson et al.,J.Biol.Chem.269:18037-18046,1994和Black et al.,J.Biol Chem.267:25513-25520,
1992的那些基因。
供分支前体的基因(例如bkd、ilv icm和fab基因家族)工程化大肠杆菌,以产生支链脂
肪酸(brFAs)。此外,可以工程化宿主细胞以表达或超表达编码用于brFAs的延长的蛋白的
基因(例如ACP、FabF等),和/或缺失或减弱通常导致sFAs的相应宿主细胞基因。
这样的酶I1vE(EC 2.6.1.42;GenBank登录YP_026247)。在一些宿主细胞中,可以不表达
异源支链氨基酸氨基转移酶。但是,大肠杆菌I1vE或任何其他支链氨基酸氨基转移酶(例
如,来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的I1vE(GenBank登录AAF34406)、来自恶臭
假单胞菌(Pseudomonas putida)的I1vE(GenBank登录NP_745648)或来自天蓝色链霉菌
(Streptomyces coelicolor)的I1vE(GenBank登录NP629657)),如果不是内源的,可以被
引入。
I1vD的基因产生。在另一实例中,2-酮-3-甲基-戊酸酯可以通过超表达编码I1vA和I1vI、
I1vH(或枯草芽孢杆菌的AlsS)、I1vC、I1vD或它们的相应同系物的基因产生。在另一实施
方案中,2-酮-4-甲基-戊酸酯可以通过超表达编码I1vI、I1vH、I1vC、I1vD和LeuA、LeuB、
LeuC、LeuD或它们的相应同系物的基因产生。
该复合物由E1α/β(脱羧酶)、E2(二氢硫辛酸转酰酶)和E3(二氢硫辛酸脱氢酶)亚基
组成。这些支链α/酮酸脱氢酶复合物与丙酮酸和α-酮戊二酸脱氢酶复合物相似。具有
brFAs和/或生长在支链氨基酸上的任何微生物可以用作分离用于在例如大肠杆菌的宿主
细胞中表达的bkd基因的来源。此外,大肠杆菌具有E3组分,作为其丙酮酸脱氢酶复合物
(lpd、EC 1.8.1.4、GenBank登录NP_414658)的一部分。因此,仅表达E1a/β和E2b bkd
基因就足够了。表2列出了来自几种微生物的、可以在宿主细胞中重组引入并表达以提供
支链酰基CoA前体的bkd基因的非限制性实例。
在宿主细胞中产生,例如在大肠杆菌中(Han和Reynolds,J.Bacteriol.179:5157,1997)。
丁烯酰CoA是大肠杆菌和其他微生物中脂肪酸生物合成的中间体。来自所选微生物的ccr
和icm基因的非限制性实例在表3中列出。
J.Bacteriol.187:3795-3799,2005)。这些FabH酶的非限制性实例在表4中列出。参与任
何含有brFA的微生物的脂肪酸生物合成的fabH基因可以在宿主细胞中表达。来自不天然
产生brFA的宿主细胞的Bkd和FabH酶可能不支持brFA产生。因此,可以重组表达bkd和
fabH。可以将含有bkd和fabH基因的载体插入这样的宿主细胞中。同样,Bkd和FabH产
生的内源水平可能不足以产生brFA。这种情况下,可以超表达它们。此外,可以表达或超
表达脂肪酸生物合成途径的其他组分,例如酰基载体蛋白(ACPs)和β-酮脂酰-酰基-载
体-蛋白合酶II(fabF、EC 2.3.1.41)(候选者的非限制性实例在表4中列出)。除表达这
些基因外,可以在宿主细胞中减弱内源脂肪酸生物合成途径中的一些基因(例如,大肠杆
菌基因fabH(GenBank登录号NP_415609)和/或fabF(GenBank登录号NP_415613))。
主细胞并使其表达,以允许由环状前体起始脂肪酸生物合成。例如,为了将例如大肠杆菌
的宿主细胞转变为能够合成ω-环状脂肪酸(cyFA)的细胞,可以在宿主细胞中引入并表
达提供环状前体环己基羰基CoA(CHC-CoA)的基因(Cropp et al.,Nature Biotech.18:
980-983,2000)。在大肠杆菌中提供CHC-CoA的基因的非限制性实例包括:来自山丘链霉
菌(Streptomyces collinus)的安莎三烯(ansatrienin)基因簇的ansJ、ansK、ansL、chcA
和ansM(Chen et al.,Eur.J.Biochem.261:98-107,1999)或来自链霉菌(Streptomyces
sp.)HK803的磷内酯霉素B(phoslactomycin B)基因簇的plmJ、plmK、plmL、chcA和
plmM(Palaniappan et al.,J.Biol.Chem.278:35552-35557,2003),以及来自山丘链霉菌、阿维链霉菌(S.avermitilis)或天蓝色链霉菌的chcB基因(Patton et al.,Biochem.39:
7595-7604,2000)(参见表5)。然后,可以表达表4中所列的基因,以允许ω-环状脂肪酸
的起始和延长。可选地,可以从产生cyFA的微生物中分离同源基因并在宿主细胞(例如大
肠杆菌)中表达该同源基因。
则可以分离(例如通过使用简并PCR引物或异源DNA序列探针)并共表达来自产生cyFAs
的微生物的fabH、ACP和/或fabF同系物(例如表6中列出的那些)。
因家族中可以用于本文所述的方法和宿主细胞的基因的非限制性实例。图6列出了其他的
fabA相关基因而图7列出了其他的fabB相关基因。
大肠杆菌中不饱和脂肪酸产生。fabB的超表达导致显著百分比的不饱和脂肪酸的产生(de
Mendoza et al.,J.Biol.Chem.258:2098-2101,1983)。基因fabB可以在不是天然具有该
基因的宿主细胞中插入和表达。然后,这些不饱和脂肪酸可以在被工程化的宿主细胞中用
作产生脂肪酸衍生物的中间物,例如脂肪醛。
Chem.277:15558,2002)。可以在其他宿主细胞中进行相似的缺失。例如,通过超表达
fabM(反式-2、顺式-3-癸烯酰-ACP异构酶、GenBank登录DAA05501)和来自肺炎链球
菌(Streptococcus pneumoniae)的fabK(反式-2-烯酰-ACP还原酶II,GenBank登录
NP_357969)的受控表达(Marrakchi et al.,J.Biol.Chem.277:44809,2002),同时缺失大
肠杆菌fabI(反式-2-烯酰-ACP还原酶,GenBank登录NP_415804),可以实现不饱和脂肪
酸的进一步增加。在一些实例中,可以减弱内源fabF基因,从而增加所产生的棕榈油酸酯
(C16:1)的百分比。
基因和/或图7中列出的基因。在一些情况下,所述宿主细胞可以在不饱和脂肪酸的存在
下生长。在其他情况下,还可以工程化所述宿主细胞以表达或超表达编码去饱和酶的基因。
去饱和酶的一个非限制性实例是枯草芽孢杆菌DesA(AF037430)。编码去饱和酶的其他基
因是领域内已知的并可用于本文所述的宿主细胞和方法,例如使用诸如十六酰基-ACP或
十八酰基-ACP的酰基-ACP的去饱和酶。如本文所述,饱和脂肪酸可被用于产生诸如脂肪
醛的脂肪酸衍生物。
细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Cv1
细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或PC12细胞)中表达。其他示例性的宿主细胞包括来
自以下属的成员的细胞:埃希氏菌属、芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、红球菌属、假单胞菌属、曲霉属、木霉属、脉孢菌属、镰刀菌属、腐质霉属、根毛霉属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、毛霉菌属、蚀丝霉属、青霉属、平革菌属、侧耳属、栓菌属、金黄孢子菌属、酵母属、裂殖酵母属、耶氏酵母属或链霉菌属。其他示例性的宿主细胞可以是迟缓芽孢杆菌细胞、短芽孢杆菌细
胞、嗜热脂肪芽孢杆菌细胞、地衣芽孢杆菌细胞、嗜碱芽孢杆菌细胞、凝结芽孢杆菌细胞、环状芽孢杆菌细胞、短小芽孢杆菌细胞、苏云金芽孢杆菌细胞、克劳氏芽孢杆菌细胞、巨大芽
孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、解淀粉芽孢杆菌细胞、康氏木霉细胞、绿色木霉细胞、里氏木霉细胞、长枝木霉细胞、泡盛曲霉细胞、烟曲霉细胞、臭曲霉细胞、构巢曲霉细胞、黑曲霉细胞、米曲霉细胞、特异腐质霉细胞、棉毛状腐质霉细胞、米黑根毛霉细胞、米黑毛酶细胞、浅青紫链霉菌细胞、鼠灰链霉菌细胞或放线菌细胞。其他宿主细胞是蓝细菌宿主细胞。
适的宿主细胞对于本领域技术人员是已知的。
多肽变体或片段的核酸。本领域技术人员会意识到多种病毒载体(例如,逆转录病毒载体、
慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体)和非病毒载体可以用于本文所述的方法。
控制序列。所述控制序列可操作地连接到待表达的核酸序列。这些控制序列描述于,例如
Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology(基因表达技术:酶学方
法)185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)。控制序列包括在许多类型的宿主细
胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些控制序列,和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序
列的表达的那些控制序列(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员应当理解到,表达
载体的设计可以取决于例如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等因素。可以
将本文所述的表达载体引入宿主细胞,以产生本文所述核酸所编码的多肽,包括融合多肽。
成多肽或变体。适合的宿主细胞在Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in
Enzymology(基因表达技术:酶学方法)185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)中
进一步作了详细讨论。可选地,所述重组表达载体可以在体外进行转录和翻译,例如通过使
用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
肽,通常添加到重组多肽的氨基末端。这些融合载体通常担任3个用途:(1)增加重组多肽
的表达;(2)增加重组多肽的可溶性;和(3)通过作为亲和纯化中的配体,帮助重组多肽的
纯化。通常,在融合表达载体中,在融合部分和重组多肽的连接处引入蛋白水解切割位点。
这使得在融合多肽纯化后,重组多肽能够从融合部分分离。这些酶的实例及其同源识别序
列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。示例性的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech
Inc;Smith et al.,Gene(1988)67:31-40)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,Mass.)和pRITS(Pharmacia,Piscataway,N.J.),它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E
结合蛋白或蛋白A融合到靶重组多肽。
Methods in Enzymology(基因表达技术:酶学方法)185,Academic Press,San Diego,
Calif.(1990)60-89)。从pTrc载体表达靶基因依赖于由杂合trp-lac融合启动子的宿主
RNA聚合酶转录。从pET 11d载体表达靶基因依赖于来自共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)
所介导的T7gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由来自携带T7gn1基因的定居入
原噬菌体的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供,所述T7gn1基因受lacUV 5启动子
的转录控制。
in Enzymology(基因表达技术:酶学方法)185,Academic Press,San Diego,Calif.
(1990)119-128)。另一策略是改变待插入表达载体中的核酸序列,这样每个氨基酸的单
独密码子是所述宿主细胞优选使用的那些密码子(Wada et al.,Nucleic Acids Res.
(1992)20:2111-2118)。通过标准DNA合成技术可以进行该核酸序列的改变。
J.(1987)6:229-234)、pMFa(Kurjan et al.,Cell(1982)30:933-943)、pJRY88(Schultz et al.,Gene(1987)54:113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,Calif.)和
picZ(Invitrogen Corp,San Diego,Calif.)。
列(Smith et al.,Mol.Cell Biol.(1983)3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow et al.,
Virology(1989)170:31-39)。
pMT2PC(Kaufman et al.,EMBO J.(1987)6:187-195)。当用于哺乳动物细胞中时,表达载体的控制功能可以由病毒调节元件提供。例如,通常使用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、
巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于原核和真核细胞都合适的其他表达系统描述于Sambrook
et al.,eds.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd(分子克隆:实验手册,第2
版),ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989的16和17章中。
括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。用于转化或转染宿
主细胞的合适的方法可以见于例如Sambrook et al.(同上)。
(例如抗生素抗性)的基因伴随目的基因引入宿主细胞中。选择标记包括赋予药物抗性的
那些标记,所述药物诸如氨苄西林、卡那霉素、氯霉素或四环素。编码选择标记的核酸可以
在与编码本文所述的多肽相同的载体上被引入宿主细胞或可以在单独的载体上被引入。可
以通过药物选择鉴定被引入的核酸稳定转染的细胞(例如,具有并入的选择标记基因的细
胞会存活,而其他细胞死亡)。
选择标记(例如抗生素抗性)的基因伴随目的基因引入宿主细胞中。优选的选择标记包括
赋予药物抗性的那些标记,所述药物诸如G418、潮霉素和甲氨蝶呤。编码选择标记的核酸可
以在与编码本文所述的多肽相同的载体上被引入宿主细胞或可以在单独的载体上被引入。
可以通过药物选择鉴定用引入的核酸稳定转染的细胞(例如,具有并入的选择标记基因的
细胞会存活,而其他细胞死亡)。
具有选择性。
杆线虫(Caenorhabditis elegans)、拟南芥(Arabidopsis thalania)、真养产碱杆菌
(Alkaligenes eutrophus)和红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的有机体的ABC转
运蛋白。示例性的可以使用的ABC转运蛋白在图5中列出(例如CER5、AtMRP5、AmiS2和
AtPGP1)。宿主细胞也可以对于其分泌有机化合物的内源能力进行选择。有机化合物产生
和分泌进入宿主细胞环境(例如培养基、发酵液)的效率可以表达为细胞内产物与细胞外
产物的比值。在一些实施例中,该比值可以为约5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、
1∶3、1∶4或1∶5。
在这点上,可以使用复制检查点基因(replication checkpoint gene)阻止细胞生长。具
体而言,群体感应机制(quorum sensing mechanisms)(综述于Camilli et al.,Science
311:1113,2006;Venturi FEMS Microbio.Rev.30:274-291,2006;和Reading et al.,FEMS Microbiol.Lett.254:1-11,2006)可以用于激活例如p53、p21的检查点基因或其他检查点
基因。
2000)。UmuC是可以对非编码损伤进行跨损伤修复(translesion synthesis)的DNA聚
合酶,所述非编码损伤是大部分UV和化学诱变的机制基础。umuDC基因产物参与跨损伤
修复的过程并且还作为DNA序列损伤检查点。umuDC基因产物包括UmuC、UmuD、umuD′、
UmuD′2C、UmuD′2和UmuD2。同时,产生产物的基因可以被激活,从而在产生脂肪醛的同
时,使对于待使用的复制和保持途径的需要最小化。通过用合适的终产物产生基因重新合
成umuC和umuD,可以工程化宿主细胞以在prpBCDE启动子系统下的pBAD24中表达来自大
肠杆菌的umuC和umuD。
物的来源),氧必须以二氧化碳的形式释放。对于每释放2个氧原子,1碳原子也被释放,这
导致约34%(w/w)的最大理论代谢效率(对于脂肪酸来源的产物)。但是,这个数字对于
其他有机化合物和碳源会发生变化。文献中的通常效率约低于5%。经工程化产生脂肪醛
的宿主细胞可以具有大于约1、3、5、10、15、20、25和30%的效率。在其他实例中,宿主细胞可以表现出约10%至约25%的效率。在其他实例中,这些宿主细胞可以表现出约25%至约
30%的效率。在其他实例中,宿主细胞可以表现出大于30%的效率。
源。例如,可以另外工程化宿主细胞以表达转化酶(EC 3.2.1.26),这样蔗糖可以被用作
碳源。相似地,可以使用美国专利第5,000,000号、第5,028,539号、第5,424,202号、第
5,482,846号和第5,602,030号中描述的教导工程化宿主细胞,这样宿主细胞可以有效地
吸收碳并使用纤维素原料作为碳源。
NADP/H平衡的努力也可以有助于稳定电子平衡。通过工程化宿主细胞以表达NADH:NADPH
转氢酶,也可以增强细胞内NADPH的可利用性。一个或多个NADH:NADPH转氢酶的表达将糖
酵解中产生的NADH转变为NADPH,所述NADPH可以增强脂肪醛的产生。
脂肪醛生物合成基因。对于大规模生产,工程化的宿主细胞可以在约10L、100L、1000L、
10,000L、100,000L、1,000,000L或更大的批量中生长;发酵;并且基于合适的质粒中所编
码的或并入所述宿主细胞基因组中的特定基因,经诱导而表达所需脂肪醛生物合成基因。
1L的反应器内,在补充了2%葡萄糖、羧苄青霉素和氯霉素的M9培养基中于37℃孵育20小
时。当培养物的OD600达到0.9时,用IPTG诱导生产宿主以活化工程化的基因系统用于产
生脂肪醛。孵育后,可以提取废培养基并且使用GC-MS检查有机相的脂肪醛的存在。
淀。然后可以收集脂肪醛组分,并且将水相返回到反应室。可以连续操作反应室。当OD600
下降至0.6以下时,可以用生长自种子培养物的新批次替换细胞。
以在适于允许多肽表达的条件下培养宿主细胞。然后,可以使用已知方法产生无细胞提取
物。例如,可以使用去垢剂或通过超声处理裂解宿主细胞。可以使用已知方法纯化所表达
的多肽。获得无细胞提取物后,可以将本文所述的底物添加到所述无细胞提取物并保持在
允许所述底物转化为脂肪醛的条件下。然后,可以使用已知技术分离并纯化脂肪醛。
分离过程。该过程涉及使遗传工程化的宿主细胞在足以产生脂肪醛的条件下发酵,允许脂
肪醛收集在有机相中并从水性发酵液分离该有机相。该过程可以在批次和连续发酵过程中
实施。
机相,使产生的脂肪醛具有高logP值,在发酵容器中脂肪醛即使处于非常低的浓度也可以
分离到有机相。
醛对细胞功能的影响并可以允许宿主细盹产生更多产物。
度。也可以产生具有相对一致的饱和度的这些化合物。这些化合物可以直接用作燃料、燃
料添加剂、用于生产其他化学化合物(例如聚合物、表面活性剂、塑料、纺织品、溶剂、粘合剂等)的起始原料或个人护理添加剂。这些化合物也可以用作例如氢化、催化裂解(通过
氢化、热解或两者)的后续反应的原料以制造其他产品。
可以含有约65%至约85%的碳;或约10%至约15%的氢。
14
合物。基于双重碳同位素指纹谱或 C测定年代法,这些新生物产品可以区别于来自石化产
品的碳的有机化合物。此外,可以通过双重碳同位素指纹谱确定生物来源的碳的具体来源
(例如葡萄糖与甘油相比)(参见,例如美国专利第7,169,588号,该美国专利以引用的方式
并入本文中)。
区别于仅由基于石油的原料制造的有机化合物和化学品。因此,可以根据所述即时材料独
特的碳同位素谱在商业中追踪它们。
的有机化合物。给定的生物产品中 C/ C比是二氧化碳固定时大气二氧化碳中的 C/ C比
的结果。它还反映精确的新陈代谢途径。还存在区域变化。石油、C3植物(阔叶植物)、C4
13 12 13
植物(草)和海洋碳酸盐均表现出 C/ C比和相应的δ C值的显著差异。此外,作为新陈
代谢途径的结果,C3和C4植物的脂质物质与来自相同植物的碳水化合物的材料分析上是不
同的。
固定)中的差异。两大类植物是包含“C3”(或开尔文-本森)光合循环的那些植物和包含
“C4”(或哈奇-斯莱克)光合循环的那些植物。
释放的CO2。C4植物的实例是热带草类、玉米和甘蔗。
13
Radiocarbon 19:355,1977)。煤炭和石油通常落入此较后的范围。 C测量标尺最初通过
由Pee Dee Belemnite(PDB)石灰石所设定的零所定义,其中值是以从该物质的偏差的千分
13
比给出。“δ C”值以每千分比部分(千分)表达,简写为‰,并且按照以下计算:
验室合作开发了一系列的替代RM。从PDB的千分偏离的符号为δ C。通过高精度稳定同
位素比质谱仪对质量为44、45和46的CO2分子离子进行测量。
产品的δ C可以为约-28或更大、约-27或更大、-27或更大、-20或更大、-18或更大、-15
13
或更大、-13或更大或-8或更大。例如,生物产品的δ C可以为约-30至约-15、约-27至
约-19、约-25至约-21、约-15至约-5、约-13至约-7、约-13至约-10。在其他情况下,生
13
物产品的δ C可以为约-10、-11、-12或-12.3。
物。因为 C具有5730年的核半衰期,包含“较老的”碳的基于石油的燃料可以区别于包含
“较新的”碳的生物产品(参见,例如Currie,″Source Apportionment of Atmospheric
Particles″,Characterization of Environmental Particles,J.Buffle and H.P.van
Leeuwen,Eds.,1 of Vol.I of the IUPAC Environmental Analytical Chemistry
Series(Lewis Publishers,Inc)(1992)3-74)。
恒定。然而,由于1950年开始的大气层核试验和1850年开始的化石燃料的燃烧,C获得
14
了第二地球化学时代特征。大气CO2中并且因此活的生物圈中 C的浓度在核试验的峰期,
14
20世纪60年代中期,大约加倍。然后,C的浓度以约7-10年的松弛“半衰期”逐渐回落到
-12
约1.2x 10 的恒稳态宇宙(大气)基线同位素比。(不必照字面意思理解这个后来的半
衰期;而是,自从核时代开始后,人们必须使用精细的大气核输入/衰变函数以追踪大气和
14
生物圈 C的变化)。
可以通过加速器质谱(AMS),测量 C,结果以“现代碳比例”(fM)为单位给出。fM由国家标
准技术研究院(National Institute of Standards and Technology)(NIST)标准参考物
质(Standard Reference Materials)(SRMs)4990B和4990C定义。如本文所用的“现代碳
比例(fraction of modern carbon)”或“fM”与分别由称为草酸标准HOxI和HOxII的国家
标准技术研究院(National Institute of Standards and Technology(NIST))标准参考
14 12
物(SRMs)4990B和4990C所定义的具有相同意义。基本定义涉及0.95倍的 C/ C同位素
比例HOxI(参考AD 1950)。这粗略地等于衰变校正的工业革命前树木(decay-corrected
pre-Industrial Revolution wood)。对于现今生命生物圈(植物物质)而言,fM约为1.1。
至少约1.01的fM C、约1至约1.5的fM C、约1.04至约1.08的fM C或约1.111至1.124
14
的fM C。
的分布进行了评估,表现出大于公元1950年以后活着的植物和动物的100pMC的值。其随
着时间逐渐下降到约107.5pMC的现值。这意味着,诸如玉米的新鲜生物量材料,会产生约
14
107.5pMC的 C特征。基于石油的化合物的pMC值为0。将化石碳与现代的碳结合会导致
14
现代pMC含量的稀释。假定107.5pMC代表现代生物量材料的 C含量而0pMC代表基于石
14
油的产品的 C含量,则该材料测量的pMC值会反映两种组分类型的比例。例如,100%来
源于现代大豆的材料会产生约107.5pMC的放射性碳标记。如果该材料用基于石油的产品
50%稀释,它会产生约54pMC的放射性碳标记。
的基于生物学的碳结果,并且假定分析的材料中所有组分或者来源于现代的生物学材料或
者来源于基于石油的材料。
其他情况下,本文所述的生物产品可以具有约90、91、92、93、94或94.2的pMC。
实施例
J.Bacteriol.179:3482-3487,1997;He et al.,Appl.Environ.Microbiol.70:1874-1881,
2004))。使用NRRL 5646 CAR氨基酸序列(Genpept登录号AAR91681)作为查询序列进行
BLAST搜索鉴定出约20个同源序列。评估了表7中列出的三个同系物在大肠杆菌中表达
时将脂肪酸转化为脂肪醛的能力。在核苷酸序列水平,carA(SEQ ID NO:19)、carB(SEQ ID NO:21)和fadD9(SEQ ID NO:17)分别表现出与诺卡氏菌NRRL 5646的car基因(AY495697)
(SEQ ID NO:15)的62.6%、49.4%和60.5%的同源性。在氨基酸水平,CARA(SEQ ID NO:
20)、CARB(SEQ ID NO:22)和FadD9(SEQ ID NO:18)分别表现出与诺卡氏菌NRRL 5646的
CAR(SEQ ID NO:16)的62.4%、59.4%和60.7%的同一性。
华,加拿大)的基因组DNA扩增fadD9。首先将PCR产物克隆进PCR-blunt(Invitrogen),
然后以NdeI-AvrII片段释放。然后将NdeI-AvrII片段克隆到pACYCDuet-1(Novogen)的
NdeI位点和AvrII位点之间,以产生pACYCDuet-1-fadD9。
将PCR产物克隆进PCR-blunt,然后以NdeI-AvrII片段释放。然后将两个片段的每一个克
隆到pACYCDuet-1(Novogen)的NdeI位点和AvrII位点之间以产生pACYCDuet-1-carA和
pACYCDuet-1-carB。
fadD9R cctagg TCACAGCAGCCCGAGCAGTC(SEQ ID NO:2)
CARMCaF cat ATGACGATCGAAACGCG(SEQ ID NO:3)
CARMCaR cctagg TTACAGCAATCCGAGCATCT(SEQ ID NO:4)
CARMCbF cat ATGACCAGCGATGTTCAC(SEQ ID NO:5)
CARMCbR cctagg TCAGATCAGACCGAACTCACG(SEQ ID NO:6)
杆菌C41(描述于PCT/US08/058788中)株中。
氯霉素的新鲜LB培养基中。生长3.5小时之后,将2mL的培养物转移到包含20mL具有2%
葡萄糖和羧苄青霉素和氯霉素的M9培养基的125mL烧瓶中。当培养物的OD600达到0.9时,
将1mM的IPTG加入到每个烧瓶中。在37℃生长20小时候,将20mL乙酸乙酯(具有1%的
乙酸,v/v)添加到每个烧瓶中以提取发酵期间产生的有机化合物。如下文所述,用GC/MS直
接分析粗乙酸乙酯提取物。
均120mg/L的脂肪醛。十二醛的保留时间为6.959分钟,7-十四烯醛的保留时间为8.247
分钟,十四醛的保留时间为8.37分钟,9-十六烯醛的保留时间为9.433分钟,十六醛的保
留时间为9.545分钟并且11-十八烯醛的保留时间为10.945分钟。大量脂肪醛的存在与
CAR是产生醛的脂肪酸还原酶(AFAR)是一致的。该机制与诸如JjFAR的产生醇的脂肪酰
基-CoA还原酶(FAR)和诸如Acr1的脂肪酰基-CoA还原酶是不同的。
宽的底物范围。
当达到终点温度时,将柱在320℃保持等温5分钟。进样体积为1μL。载体气体氦气的流
速为1.3mL/分钟。质谱仪装有电子轰击离子源。离子源温度设定为300℃。
标准物的质谱匹配确认每个化合物的鉴定。
要求的范围之内。