1,8-萘酰亚胺类衍生物的用途

摘要

本发明涉及一种3-氨基-1，8-萘酰亚胺类衍生物的用途。所说的3-氨基-1，8-萘酰亚胺类衍生物是N-烷基或取代烷基，3-氨基-1，8-萘酰亚胺类化合物，其可作为检测N-乙酰基转移酶2活性的荧光探针。本发明为个性化给药方式治疗肿瘤奠定了基础。

权利要求

1.一种式I所示化合物作为检测N-乙酰基转移酶2活性的荧光探针的应用：式I中：R1为C1～C6烷基或取代的C1～C6烷基；

所说的取代的C1～C6烷基的取代基选自：羟基、烷氧基或R2NR3中一种、二种或二种以上，其中R2和R3分别选自H或C1～C6烷基中一种。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，其中R1为C1～C4烷基或取代的C1～C4烷基；

所说的取代的C1～C4烷基的取代基选自：羟基、C1～C3烷氧基或R2NR3中一种、二种或二种以上，R2和R3分别选自H或C1～C3烷基中一种。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，其中R1为C4烷基或取代的C1～C3烷基；

所说的取代的C1～C3烷基的取代基选自：羟基、CH3NCH3或C1～C2烷氧基中一种、二种或二种以上。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，其中R1为正丁基或

5.一种式Ic所示化合物作为检测N-乙酰基转移酶2活性的荧光探针的应用，

说明书

1,8-萘酰亚胺类衍生物的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种1，8-萘酰亚胺类衍生物的用途，具体地说，涉及一种3-氨基-1，8-萘酰亚胺类衍生物的用途。

背景技术

[0002] N-乙酰基转移酶2(N-acetyltransferase2，NAT.)是人体内一种重要的二相代谢酶，主要是催化乙酰基团从乙酰CoA转移到其作用底物芳香胺及杂环胺类物质上，在人体对芳香胺类致癌物质的活化和/或灭活以及某些药物的代谢过程中起着重要的作用。 [0003] 但是NAT.的遗传多态性和组织特异性表达，加上环境因素与NAT.基因之间的相互作用，共同导致了不同人群的NAT.活性的巨大差异，从而对临床给药量提出了巨大的挑战。因而通过简单而有效的方法测定个体NAT.的活性，从而确定合适的给药量，这对提高肿瘤患者治愈和降低副作用方面具有重要的意义。

[0004] 目前，用于检测N-乙酰基转移酶2的活性的方法主要是通过HPLC检测已知化合物的代谢产物(如磺胺类化合物)来确定酶活，或者用放射性元素、荧光基团标记多肽链，通过聚合酶链式反应(PCR)对不同个体的基因类型进行检测(Clin.Chem.，2004.50(7)：p.1264-6；Analytical Biochemistry 1985，145，367-75)。这些方法的主要缺点是耗时长，操作繁杂。因此研究简便、高效及快捷的N-乙酰基转移酶2探针有着十分重要的意义。 发明内容

[0005] 现已知芳胺类化合物在N-乙酰基转移酶2(NAT.)作用下会产生相应的酰胺类化合物(a.T.B.Felder，M.A.McLean，M.L.Vestal，K.Lu，D.Farquhar，S.S.Legha，R.Shah and R.A.Newman，Drug Metab.Dispos.，1987，15，773；b.M.F.Brana and A.Ramos，Curr.Med.Chem.Anticancer Agents，2001，1，237.)。如果所得酰胺类化合物具备荧光性、且具有较高的荧光量子产率，则可用于对N-乙酰基转移酶2的检测、且其检测限可以达到纳摩尔级别(10nM)。据此，本发明的发明人经大量化合物筛选后发现：有一种N-取代，3-氨基-1，8-萘酰亚胺类化合物(其中N上的取代基是：烷基或取代烷基)对N-乙酰基转移酶2有着高的灵敏度和快速响应能力。

[0006] 光谱测试表明：该种N-取代，3-氨基-1，8-萘酰亚胺类化合物在N-乙酰基转移酶2(pH＝7.4的缓冲液体系)作用下，用一定波长的激发光激发后，会出现明显的发射峰、且乙酰化后的产物有着较高的荧光量子产率，对N-乙酰基转移酶2的检测限可以达到纳摩尔级别。

[0007] 生物测试表明：该种N-取代，3-氨基-1，8-萘酰亚胺类化合物对N-乙酰基转移酶2有着较高的专一性、高灵敏性和快速响应的能力，可以对芳香胺和肼类化合物的体内二相代谢提供模型计算依据并根据不同病人体内N-乙酰基转移酶2的活性而确定不同的给药量做出判断依据。

[0008] 本发明所说的用于检测N-乙酰基转移酶2活性的3-氨基-1，8-萘酰亚胺类衍生物具有式I所示结构：

[0009]

[0010] 式I中：R1为C1～C6烷基或取代的C1～C6烷基；

[0011] 所说的取代的C1～C6烷基的取代基选自：羟基、烷氧基或R2NR3中一种、二种或二种以上，其中R2和R3分别选自H或C1～C6烷基中一种。

[0012] 在本发明一个优选的技术方案中，R1为C1～C4烷基或取代的C1～C4烷基； [0013] 其中所说的取代的C1～C4烷基的取代基选自：羟基、C1～C3烷氧基或R2NR3中一种、二种或二种以上，R2和R3分别选自H或C1～C3烷基中一种。

[0014] 在本发明又一个优选的技术方案中，R1为C4烷基或取代的C1～C3烷基； [0015] 其中所说的取代的C1～C3烷基的取代基选自：羟基、CH3NCH3或C1～C2烷氧基中一种、二种或二种以上。

[0016] 最佳的R1为正丁基[-CH2(CH2)2CH3]、 或

附图说明

[0017] 图1为式Ia所示化合物在pH＝7.4的Tris-HCl(含1％DMSO)缓冲液中的吸收和发射光谱图；

[0018] 其中：(a)为式Ia所示化合物在Tris-HCl(含1％DMSO)缓冲液中的吸收光谱图； [0019] (b)为式Ia所示化合物在Tris-HCl(含1％DMSO)缓冲液中的发射光谱图。 [0020] (b-1)为化合物Ia的荧光发射光谱的强度和其浓度的关系图。

[0021] 图2为化合物Ia-1在pH＝7.4的Tris-HCl(含1％DMSO)缓冲液中的吸收和发射光谱图；

[0022] 其中：(a)为化合物Ia-1在Tris-HCl(含1％DMSO)缓冲液中的吸收光谱图； [0023] (b)为化合物Ia-1在Tris-HCl(含1％DMSO)缓冲液中的发射光谱图；

[0024] (b-1)化合物Ia-1的荧光发射光谱的强度和其浓度的关系图。

[0025] 图3为式Ia所示化合物在pH＝7.4的Tris-HCl(含1％DMSO)缓冲液中被N-乙酰基转移酶2催化的荧光光谱图。

[0026] 其中：(a)为式Ia所示化合物的浓度为10μM，乙酰辅酶A的浓度为50μM，N-乙酰基转移酶2的浓度为5μg/mL，插图(图a-1)为此条件下催化时间和荧光强度的依赖关系图；

[0027] (b)为式Ia所示化合物的浓度为10μM，乙酰辅酶A的浓度为50μM，N-乙酰基转移酶2的浓度为2.5μg/mL，插图(图b-1)为此条件下催化时间和荧光强度的依赖关系图；

[0028] (c)为式Ia所示化合物的浓度为10μM，乙酰辅酶A的浓度为50μM，N-乙酰基转移酶2的浓度为1.25μg/mL，插图(图c-1)为此条件下催化时间和荧光强度的依赖关系图；

[0029] (d)为式Ia所示化合物的浓度为10μM，乙酰辅酶A的浓度为50μM，N-乙酰基转移酶2的浓度为1μg/mL，插图(图d-1)为此条件下催化时间和荧光强度的依赖关系图； [0030] (e)不同浓度N-乙酰基转移酶2和式Ia所示化合物的荧光强度的关系图。 [0031] 图4.为式Ia所示化合物在HepG2细胞中的代谢荧光成像图。

[0032] 其中：(a)代表式Ia所示化合物加入HepG2细胞45min后明场下的图片；(b)代表式I a所示化合物加入HepG2细胞45min后在535-600nm波段采集的图片；(c)代表式Ia所示化合物加入HepG2细胞45min后在430-495nm波段采集的图片；(d)代表式Ia所示化合物加入HepG2细胞90min下明场下的图片；(e)代表式Ia所示化合物加入HepG2细胞90min后在535-600nm波段采集的图片；(f)代表式Ia所示化合物加入HepG2细胞90min后在430-495nm波段采集的图片；(g)代表没有任何化合物加入HepG2细胞90min后明场下的图片；(h)代表没有任何化合物加入HepG2细胞90min后在535-600nm波段采集的图片；(i)代表没有任何化合物加入HepG2细胞90min后在430-495nm波段采集的图片。 [0033] 具体实施方式

[0034] 图5为式Ia所示化合物加入HepG2细胞前后的460nm和580nm荧光强度比值 [0035] 其中Gr代表535-600nm波段采集的图片的平均细胞荧光强度；Bl代表430-495nm波段采集的图片的平均细胞荧光强度；Ra代表430-495nm波段采集的图片的平均细胞荧光强度和535-600nm波段采集的图片的平均细胞荧光强度比值。所有数值通过ImageJ软件计算所得。

[0036] 一种制备本发明所述的3-氨基-1，8-萘酰亚胺类衍生物的方法，其制备路线如下所示：

[0037]

[0038] 主要步骤是：3-氨基-1，8-萘酐(式Ⅱ所示化合物)、胺类化合物(R1-NH2)及有机溶剂(如乙醇和/或N，N-二甲基乙二胺等)在回流状态下反应2小时～8小时，依次经蒸除有机溶剂、过滤和柱层析后得目标物(式Ⅰ所示化合物)。

[0039] 其中：3-氨基-1，8-萘酐由3-硝基-1，8-萘酐还原[如采用氯亚锡(SnCl2)/盐酸还原等]制得(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，15(7)，1769-1772；2005) [0040] 下面通过实施例对本发明作进一步阐述，其目的仅在于更好理解本发明的内容。因此，本发明的保护范围不受所举之例的限制。

[0041] 实施例1

[0042]

[0043] 在50ml单口烧瓶中，依次加入0.5g(3mmol)3-氨基-1，8-萘酐、0.3mL(2.9mmol)N，N-二甲基乙二胺和25ml乙醇，在氩气保护下，乙醇回流，TLC跟踪反应，直到反应完全，反应时间约1小时。减压真空旋转蒸发除去溶剂，得到棕红色固体。用硅胶柱层析分离(展开剂(v/v)：CH2Cl2∶CH3OH＝20∶1)，收集黄色强荧光谱带的物质，旋转蒸发掉溶剂得到固体初产品，再用乙醇重结晶得到亮黄色固体。产率为75％，熔点：＞300℃。 [0044] 1H-NMR(D6-DMSO)：δ ＝ 2.30(6H，s，N(CH3)2)，2.49(2H，t，J ＝ 7.2Hz，CH2CH2N(CH3)2)，4.07(2H，s，-NH2)，4.25(2H，t，J ＝ 7.2Hz，CH2CH2N(CH3)2)，7.22(1H，d，J＝2.1Hz，)，7.53(1H，t，J＝7.8Hz)，7.85(1H，d，J＝2.1Hz)，7.94(1H，d，J＝7.8Hz)，8.24(1H，d，J＝7.8Hz).

[0045] 13C-NMR(D6-DMSO)：δ ＝ 37.4，45.3，56.4，111.6，120.4，121.6，121.6，122.4，125.3，126.8，131.4，133.4，147.8，163.4 and 163.4.EI-MS：58(100)；71(31)and 283(6).ESI-MS(+)：239(15)and 284(M+H，10)。

[0046] 实施例2

[0047]

[0048] 在50ml单口烧瓶中，依次加入0.5g(3mmol)3-氨基-1，8-萘酐、640mg(2.9mmol)正丁胺和25ml乙醇，在氩气保护下，乙醇回流，TLC跟踪反应，直到反应完全，反应时间约1小时。减压真空旋转蒸发除去溶剂，得到棕红色固体。用硅胶柱层析分离(展开剂(v/v)：CH2Cl2∶CH3OH＝80∶1)，收集黄色强荧光谱带的物质，旋转蒸发掉溶剂得到固体初产品，再用乙醇重结晶得到亮黄色固体。产率为80％，熔点：＞300℃。

[0049] 实施例3

[0050]

[0051] 在50ml 单 口 烧 瓶 中，依 次 加 入0.2g(0.94mmol)3- 氨 基-1，8- 萘 酐、0.125mL(1.25mmol)2-(2-氨基乙醇)乙醇和25ml乙醇，在氩气保护下，乙醇回流，TLC跟踪反应，直到反应完全，反应时间约1h。减压真空旋转蒸发除去溶剂，得到棕红色固体。用硅胶柱层析分离(展开剂：CH2Cl2∶CH3OH＝80∶1)，收集黄色强荧光谱带的物质，旋转蒸发掉溶剂得到固体初产品，再用乙醇重结晶得到亮黄色固体。产率为80％，熔点：＞300℃。 [0052] 1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.62(d，1H，J ＝ 8.0Hz)，8.43(d，1H，J ＝ 8.0Hz)，
8.19(d，1H，J＝8.4Hz)，7.65(t，1H，J＝8.1Hz)，7.448(s，2H)，6.84(d，1H，J＝8.4Hz)，
4.58(s-br，1)，4.21(t，2H，J＝6.0Hz)，3.57(s，2H，J＝6.0Hz)，3.45(m，4H). [0053] 13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：164.3，163.4，153.3，134.5，131.6，132.0，129.9，
124.4，122.1，179.8，108.6，107.8，72.3，67.5，60.6，38.8。

[0054] 实施例4

[0055] 化合物的光谱性能测试：

[0056] 1)紫外及荧光光谱的测定

[0057] 将式Ia、式Ib和式Ic所示化合物经真空干燥后，天平上精确称量样品(精确到0.0001克)，用二甲基亚砜(DMSO)定容，配成10-3M的溶液并定容于10mL容量瓶中，以此为母液，配制不同浓度的化合物Ia、化合物Ib和化合物Ic溶液用于吸收光谱和激发-发射光谱的测试。

[0058] 2)荧光量子产率的测定

[0059] 式Ia、式Ib和式Ic所示化合物的相对荧光量子产率Φs是以0.5mol的硫酸喹啉(Φref＝0.55)溶液为参照测得的，结果取三次测量的平均值，按(1)式计算： [0060] Φs＝Φref.Aref.Fs/(Fref.As) (1)

[0061] 式中：Φs，Φref分别表示待测样品和标准物的荧光量子产率；As，Aref分别表示待测样品和标准物对该激发波长的发射光的吸光度；Fs，Fref分别表示待测样品和标准物的积分荧光强度。

[0062] 具体结果见图1(为式I a所示化合物在pH＝7.4的Tris-HCl(含1％DMSO)缓冲液中的吸收和发射光谱图，式Ib和式Ic所示化合物的图谱类似，未列出)和见表1(式Ia、式Ib和式Ic所示化合物在Tris-HCl(含1％DMSO)缓冲液的光谱数据)。

[0063] 表1

[0064]

[0065] 由图1(b-1)中的可知：化合物Ia的荧光发射光谱的强度和浓度有非常好的线性光关系。

[0066] 实施例5

[0067] 分别合成式Ia、式Ib和式Ic所示化合物的“代谢产物”，如按下列步骤可制得式Ia所示化合物的“代谢产物”。

[0068] 在25ml单口烧瓶中依次加入283mg(10mmol)的式Ia所示化合物和4mL吡啶和乙酸酐的混合溶液(其体积比为1∶1)。在室温(20℃～25℃)条件下搅拌24小时后，TLC点板跟踪时原料反应完全。减压真空旋转蒸发除去溶剂，得到黄色油状液体，将此油状液体溶解在大约50mL 氯仿中，并用2×50mL的水洗涤有机相，收集有机相并用无水硫酸钠过夜干燥。将氯仿减压旋转蒸发除去用乙酸乙酯重结晶可以得2.76g灰黄色固体，产率为85％。1

[0069] HNMR(CDCl3)：δ ＝ 2.27(3H，s，)，2.53(6H，s，)，2.92(2H，t，J ＝ 6.0Hz)，4.38(2H，t，J ＝ 6.0Hz，)，7.65(1H，t，J ＝ 8.0Hz)，7.90(1H，d，J ＝ 8.0Hz)，7.94(1H，
13
s)，8.35(1H，d，J ＝ 7.8Hz)，8.54(1H，s)，8.59(1H，s). C NMR(CDCl3)：δ ＝ 24.7，
37.7，46.1，58.3，120.9，121.9，122.6，122.8，124.2，127.4，129.5，132.1，133.7，136.8，
163.5，164.4and 169.2.EI-MS：58(100)；71(69)；140(8)；169(7)；212(8)and 325(10).ESI-MS(+)：281(13)and 326(M+H，100)。

[0070] 由于反应物和产物均为已知物，故本领域的技术人员按上述方法的教导，可以制得其它化合物的代谢产物。所说的“代谢产物”的结构如式III所示：

[0071]

[0072] 式III中，当R1为正丁基时，简记为化合物Ia-1；当R1为 时，简记为化合物Ib-1；当R1为 时，简记为化合物Ic-1；

[0073] 对化合物Ia-1、化合物Ib-1和化合物Ic-1按实施例4所述的方法测其紫外(吸收)及荧光(发射)波长和荧光量子产率，具体结果见图2(图2为化合物Ia-1在pH＝7.4的Tris-HCl(含1％DMSO)缓冲液中的吸收和发射光谱图；式Ib-1和式Ic-1所示化合物的图谱类似，未列出)和表2。

[0074] 表2

[0075]

[0076] 由图2(b-1)中可以看出化合物Ia的酶代谢产物的荧光发射光谱的强度和浓度有非常好的 线性光关系。由图1(b)和图2(b)中可以推断出化合物Ia和其代谢产物的荧光强度比值和其浓度有着很好的线性关系，因此可以通过荧光强度间接推断处两种化合物的浓度进而可以推断酶活。

[0077] 实施例6

[0078] 式Ia、式Ib和式Ic所示化合物对N-乙酰基转移酶2的响应的测定：

[0079] 在40μL的微量荧光比色皿中，我们选定乙酰辅酶A(购自Sigma公司)的浓度50μM，pH＝7.5的Tris-HCl缓冲液(含1％DMSO)中，调节加入N-乙酰基转移酶2(购自Sigma公司)，使其最终浓度分别为5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，1μg/mL，在配制好每一组浓度的N-乙酰基转移酶2溶液100μL后加入1μL的式Ia所示化合物母液，使加入的式Ia所示化合物的浓度达到10μM并迅速放入荧光光度计中每隔30秒测量荧光强度变化。我们测定了Ia对四组不同浓度下的N-乙酰基转移酶2的荧光响应，结果见附图3。 [0080] 由图3(a)可以看出式Ia所示化合物对N-乙酰基转移酶2的响应速度非常快，在
410nm处的荧光强度明显增强的同时在580nm处的荧光强度降低。从上述测试结果可以看出，式Ia所示化合物可以作为N-乙酰基转移酶2的比例性荧光探针。图3(e)中虚线代表拟合后的曲线(R＝0.9978)，表现出了良好的线性关系，说明酶的浓度和荧光强度有着很好的线性以来关系。

[0081] 在对式Ib和式Ic所示化合物的测试结果中也得到了类似的结果。在式Ib所示化合物物中在455nm处的荧光强度明显增强的同时在566nm处的荧光强度降低。从上述测试结果可以看出，式Ib所示化合物可以作为N-乙酰基转移酶2的比例性荧光探针。在式Ic所示化合物物中在460nm处的荧光强度明显增强的同时在570nm处的荧光强度降低。从上述测试结果可以看出，式Ic所示化合物可以作为N-乙酰基转移酶2的比例性荧光探针。 [0082] 实施例7

[0083] 式Ia、式Ib和式Ic所示化合物对N-乙酰基转移酶2的响应的测定[在活细胞(HepG2)体内]：

[0084] 将HepG2细胞(中国科学院细胞库)在6孔板中培养，培养基采用DEME(含有10％胎牛血清，酚红试剂，4.5g/L的D-葡萄糖，GlutaMax-1)，当细胞铺满后，吸取上清液，并用PBS缓冲液洗涤三次，然后加入式Ia所示化合物，使其最终浓度为10μM且DMSO的含量为5.0(V/V)。随后将6孔板转移到细胞培养箱中(37℃，5％CO2)，在45分钟和90分钟时各取出培养板，用PBS缓冲液洗涤两次，除去培养液中的式Ia所示化合物。再加入PBS缓冲液(pH＝7.5，1％DMSO)置于Leica DMIRB荧光显微镜(配有COHU高性能CCD镜 头)，分别采集430-495nm蓝色荧光(曝光时间3000ms)和535-600nm处的绿色荧光(曝光时间
800ms)，结果见图4和图5。

[0085] 由图4可知：在430-495nm处蓝色荧光的累积光子数随着加药时间而增强，相反在535-600nm处的绿色荧光(同上)的累积光子数却随着时间的增加而减弱(与实施例6的结论相符)。

[0086] 在对式Ib和式Ic所示化合物的测试结果中也得到了类似的结果。在式Ib所示化合物物中在430-495nm处的荧光强度明显增强的同时在535-600nm处的荧光强度降低。从上述测试结果可以看出，式Ib所示化合物可以作为N-乙酰基转移酶2的活细胞比例性荧光探针。在式Ic所示化合物物中在430-495nm处的荧光强度明显增强的同时在535-600nm处的荧光强度降低。从上述测试结果可以看出，式Ic所示化合物可以作为N-乙酰基转移酶2的活细胞比例性荧光探针。