一种重复利用布朗葡萄藻细胞提取生物质油的方法

摘要

本发明涉及生物工程技术与能源领域，具体涉及一种重复利用布朗葡萄藻细胞提取生物质油的方法。该方法包括以下步骤：(1)培养收集布朗葡萄藻湿藻体；(2)将湿藻体置入搅拌反应器中，加入由有机溶剂和助提剂组成的提取溶剂进行生物质油的提取，分离藻体细胞并收集含有生物质油的提取溶剂；(3)将步骤(2)中收集的含有生物质油的提取溶剂、回收提取溶剂、并收集获得的生物质油。根据本发明的方法，直接将湿藻体用于生物质油的提取，避免了传统微藻油脂提取的藻粉干燥的步骤，节约了微藻油脂提取的成本和能耗；布朗葡萄藻细胞的重复使用，油脂积累速度快，缩短了布朗葡萄藻培养时间，降低了培养成本，提高了布朗葡萄藻的油脂生产强度。

权利要求

1.一种重复利用布朗葡萄藻细胞提取生物质油的方法，其包括以下步骤：(1)培养布朗葡萄藻，收集得到湿藻体；

(2)将上述湿藻体置入搅拌反应器中，在室温下加入由有机溶剂和助提剂组成的提取溶剂进行生物质油的提取，分离藻体细胞并收集含有生物质油的提取溶剂，所述有机溶剂为正己烷、正庚烷、正辛烷和正十二烷中的一种，所述助提剂为乙二醇二甲醚、二甲氧基丙烷、二乙氧基甲烷和缩二醛中的一种，所述有机溶剂和助提剂的体积比为100∶0.5-2；

(3)将步骤(2)中收集的含有生物质油的提取溶剂进行真空旋转蒸发，回收提取溶剂进行重复利用，并收集获得的生物质油；

(4)将经过步骤(2)生物质油提取的湿藻体细胞加入到新鲜培养基中，搅拌使之重新悬浮，接种到反应器中，进行布朗葡萄藻细胞的再培养。

2.根据权利要求1的重复利用布朗葡萄藻细胞提取生物质油的方法，其特征在于，步骤(1)中湿藻体含水量为90-95%。

3.根据权利要求1的重复利用布朗葡萄藻细胞提取生物质油的方法，其特征在于，在步骤(2)中，提取溶剂用量为湿藻体体积的4-6倍。

说明书

一种重复利用布朗葡萄藻细胞提取生物质油的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程技术与能源领域，具体涉及一种重复利用布朗葡萄藻细胞提取生物质油的方法。

背景技术

[0002] 随着世界石油危机的爆发，我国同样面临解决能源、环境和气候变化等问题，为了人类生存和社会的可持续发展，大力发展可再生能源是一条必由之路。可再生能源的意义不仅仅在于避免化石能源枯竭对我国经济的影响，还在于其生态意义：减少污染、降低温室效应、改善环境，可再生、无污染的生物质能源已成为当今的研究热点。而生物质能源中，能利用各种废弃物的高产油型微藻，因其具有低成本、高产出，同时能缓解和综合治理环境污染的优势，引起了有关专家的广泛关注。

[0003] 微藻是水生植物的一种，其特有的化学组成和结构注定了它是获得生物燃料(生物柴油和生物质油)的优良原料来源。微藻生产油脂的能力比陆生植物高出30倍，并且油脂组成中不含硫元素，燃烧时不排放有害有毒气体，有利于生态环境，因此利用微藻生产生物燃料具有重要的应用前景。微藻生长又可以消耗大量的二氧化碳，从微藻到油的生产过程也可以实现零排放，具有良好的环保效益，对缓解人类面临的粮食、能源、环境三大危机有着巨大的潜力。迄今所发现具有产烃能力的藻类至少有布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、杜氏盐藻(Dunaliena salina)、小球藻(Chlorella valgaris)、倒囊藻(Anacystis montana)、网翼藻(Dictyopterisaerostiehoides)、小环藻(Cyclotella cryptica)等，烃含量最高、研究最多、最可望成为工业藻种的还是葡萄藻。

[0004] 呈串状集落生的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)是一种世界性广布的淡水单细胞绿藻，其油脂含量占细胞干重的25％-75％(因藻种和培养条件而异)，大大高于其它微生物的产烃量，在一些石油沉积中几乎全部的有机质都是该藻形成的，故又被称为“油藻”。布朗葡萄藻由几层果冻一样的细胞壁包裹，它的油脂就储藏在这些细胞壁中，因此，这些油脂的提取比较容易。

[0005] 高昂的生产成本是利用微藻生产生物燃料所面临的第一个瓶颈问题。微藻油脂提取是微藻炼制生物燃料的关键技术。微藻油脂提取的方法主要包括机械压榨、溶剂萃取、水酶法等。这些提取方法的前提是将微藻细胞彻底破坏，尽可能的“榨干”微藻中的油脂。而湿法提取虽然可以省去干法提取中菌体干燥的步骤，但由于湿法提取体系中含有水分，湿藻细胞本身是亲水的，而提取溶剂通常都是疏水的，这导致湿藻细胞油脂提取的过程中，藻细胞容易团聚，溶剂提取效率低，消耗量大。

[0006] 目前的研究主要通过油脂提取方法的改进，提高提取效率，降低微藻油脂提取的成本。然而，微藻大规模培养生产生物燃料过程中也存在需强光照、生长慢，培养密度低等问题。因此，将经过长期培养获得的高密度微藻细胞直接提取油脂致其死亡，并非是利用微藻生产生物燃料的最佳途径。结合分析微藻生产生物燃料的优缺点，不难发现，要想使其工业化生产，降低生产成本非常关键。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种重复利用布朗葡萄藻细胞提取生物质油的方法，克服传统微藻油脂提取技术中存在的缺陷。

[0008] 为了实现上述目的，本发明提供的基于布朗葡萄藻的重复利用提取生物质油的方法是利用光生物反应器进行布朗葡萄藻高密度培养，在对微藻细胞不破坏或者破坏程度小的情况下，将培养收集的湿藻细胞用有机溶剂提取生物质油，提取结束后将分离得到的布朗葡萄藻的湿藻细胞继续在光生物反应器中进行高密度培养，待布朗葡萄藻重新积累油脂后，再一次进行微藻细胞收集和生物质油的提取，从而在布朗葡萄藻提取生物质油生产生物燃料的过程中实现布朗葡萄藻细胞的重复使用。

[0009] 根据本发明的重复利用布朗葡萄藻细胞提取生物质油的方法包括以下步骤：

[0010] (1)培养布朗葡萄藻，收集得到湿藻体；

[0011] (2)将上述湿藻体置入搅拌反应器中，在室温下加入由有机溶剂和助提剂组成的提取溶剂进行生物质油的提取，分离藻体细胞并收集含有生物质油的提取溶剂，所述有机溶剂为正己烷、正庚烷、正辛烷和正十二烷中的一种，所述助提剂为乙二醇二甲醚、二甲氧基丙烷、二乙氧基甲烷和缩二醛中的一种，所述有机溶剂和助提剂的体积比为100∶0.5-2；

[0012] (3)将步骤(2)中收集的含有生物质油的提取溶剂进行真空旋转蒸发，回收提取溶剂进行重复利用，并收集获得的生物质油。

[0013] 根据本发明的重复利用布朗葡萄藻细胞提取生物质油的方法，优选地，所述方法还包括步骤(4)：将经过步骤(2)生物质油提取的湿藻体细胞加入到新鲜培养基中，搅拌使之重新悬浮，接种到反应器中，进行布朗葡萄藻细胞的再培养。

[0014] 根据本发明的重复利用布朗葡萄藻细胞提取生物质油的方法，优选地，步骤(1)中湿藻体含水量为90-95％。

[0015] 根据本发明的重复利用布朗葡萄藻细胞提取生物质油的方法，优选地，在步骤(2)中，提取溶剂用量为湿藻体体积的4-6倍。

[0016] 因此，根据本发明的具体实施例的重复利用布朗葡萄藻细胞提取生物质油方法可以包括以下步骤：

[0017] (1)布朗葡萄藻通过实验室培养或室外大规模培养，采用补料等生化培养工艺，使其生物量达到2g干重/L培养液以上，满足高密度培养的要求，将一定体积的该微藻培养液经离心、沉降、絮凝、过滤等方法收集湿藻体，湿藻体含水量90-95％；

[0018] (2)将上述湿藻体置入搅拌反应器中，在室温下加入由有机溶剂和助提剂组成的提取溶剂进行生物质油的提取，该提取溶剂用量为湿藻体体积的4-6倍，有机溶剂和助提剂的体积比为100∶0.5-2，在200-400rpm的速率下搅拌10-15min，分离藻体细胞并收集含有生物质油的提取溶剂，重新加入新的提取溶剂，重复以上提取操作步骤，湿藻体总计提取2-3次，油脂总提取率为30-50％；

[0019] (3)将步骤(2)中收集的含有生物质油的提取溶剂合并，进行真空旋转蒸发，回收提取溶剂进行重复利用，并收集获得的生物质油；

[0020] (4)将经过步骤(2)油脂提取的湿藻体细胞加入到其体积20-30倍的新鲜培养基中，搅拌使之重新悬浮，接种到反应器中，用新鲜培养基补足至原有培养液体积进行布朗葡萄藻的再培养；

[0021] (5)当步骤(4)培养的布朗葡萄藻生物量达到或超过上次提取前的水平，其细胞活力和油脂含量恢复到油脂提取前水平时，再次收集布朗葡萄藻细胞并按照上述步骤进行生物质油的提取和微藻细胞的再培养，从而实现重复利用布朗葡萄藻细胞进行生物质油提取。

[0022] 所述有机溶剂为正己烷、正庚烷、正辛烷和正十二烷中的一种；所述助提剂为乙二醇二甲醚、二甲氧基丙烷、二乙氧基甲烷和缩二醛中的一种。以上所述有机溶剂是微藻油脂提取的主体，微藻油脂溶于有机溶剂中，所述助提剂的作用在于改善有机溶剂与微藻表面的水互不相容的状态，提高有机溶剂提取过程中传质，让微藻细胞壁中的油能够快速的向有机溶剂中转移，助提剂的用量必需严格控制在所述比例范围内，添加量太小则无法起到助提的作用，添加量太大会导致藻体细胞的死亡。

[0023] 本发明的重复利用布朗葡萄藻细胞提取生物质油的方法具有以下优点：

[0024] (1)直接将湿藻体用于生物质油的提取，避免了传统微藻油脂提取的藻粉干燥的步骤，简单易行，节约了微藻油脂提取的成本和能耗；

[0025] (2)布朗葡萄藻细胞的重复使用，油脂积累速度快，缩短了布朗葡萄藻培养时间，降低了培养成本，提高了布朗葡萄藻的油脂生产强度。

[0026] (3)提取使用的有机溶剂可回收再利用，既环保又降低了下游处理成本。

具体实施方式

[0027] 实施例1

[0028] 将一定体积的生物量达到2g/L以上的布朗葡萄藻培养液经过滤后收集湿藻体，湿藻体含水量90％；将湿藻体置入搅拌反应器中，在室温下加入由正己烷和乙二醇二甲醚(100∶2，v/v)组成的提取溶剂进行布朗葡萄藻生物质油的提取，提取溶剂用量为湿藻体体积的6倍，在400rpm的速率下搅拌10min，分离藻体细胞并收集含有油脂的提取溶剂，重新加入新的提取溶剂，重复提取操作步骤，湿藻体总计提取3次，油脂总提取率为30％；将收集的含有生物质油的提取溶剂合并，进行真空旋转蒸发，回收提取溶剂进行重复利用，并收集获得的生物质油；将经过生物质油提取的湿藻体细胞加入到其体积30倍的新鲜培养基中，搅拌使之重新悬浮，接种到反应器中，用新鲜培养基补足至原有培养液体积进行布朗葡萄藻细胞的再培养；当培养的布朗葡萄藻生物量达到或超过上次提取前的水平，其细胞活力和油脂含量恢复到生物质油提取前水平时，再次收集布朗葡萄藻细胞并按照上述步骤进行生物质油的提取和再培养；重复利用布朗葡萄藻进行生物质油提取10次以上，其细胞活力和产油脂能力均能恢复到正常水平。

[0029] 实施例2

[0030] 将一定体积的生物量达到2g/L以上的布朗葡萄藻培养液经过滤后收集湿藻体，湿藻体含水量95％；将湿藻体置入搅拌反应器中，在室温下加入由正己烷和乙二醇二甲醚(100∶1，v/v)组成的提取溶剂进行布朗葡萄藻生物质油的提取，提取溶剂用量为湿藻体体积的4倍，在200rpm的速率下搅拌15min，分离藻体细胞并收集含有油脂的提取溶剂，重新加入新的提取溶剂，重复提取操作步骤，湿藻体总计提取2次，油脂总提取率为45％；将收集的含有生物质油的提取溶剂合并，进行真空旋转蒸发，回收提取溶剂进行重复利用，并收集获得的生物质油；将经过生物质油提取的湿藻体细胞加入到其体积25倍的新鲜培养基中，搅拌使之重新悬浮，接种到反应器中，用新鲜培养基补足至原有培养液体积进行布朗葡萄藻细胞的再培养；当培养的布朗葡萄藻生物量达到或超过上次提取前的水平，其细胞活力和油脂含量恢复到生物质油提取前水平时，再次收集布朗葡萄藻细胞并按照上述步骤进行生物质油的提取和再培养；重复利用布朗葡萄藻进行生物质油提取10次以上，其细胞活力和产油脂能力均能恢复到正常水平。

[0031] 实施例3

[0032] 将一定体积的生物量达到2g/L以上的布朗葡萄藻培养液经过滤后收集湿藻体，湿藻体含水量92％；将湿藻体置入搅拌反应器中，在室温下加入由正己烷和乙二醇二甲醚(100∶1.5，v/v)组成的提取溶剂进行布朗葡萄藻生物质油的提取，提取溶剂用量为湿藻体体积的5倍，在300rpm的速率下搅拌12min，分离藻体细胞并收集含有生物质油的提取溶剂，重新加入新的提取溶剂，重复提取操作步骤，湿藻体总计提取3次，油脂总提取率为50％；将收集的含有生物质油的提取溶剂合并，进行真空旋转蒸发，回收提取溶剂进行重复利用，并收集获得的生物质油；将经过油脂提取的湿藻体细胞加入到其体积20倍的新鲜培养基中，搅拌使之重新悬浮，接种到反应器中，用新鲜培养基补足至原有培养液体积进行布朗葡萄藻细胞的再培养；当培养的布朗葡萄藻生物量达到或超过上次提取前的水平，其细胞活力和油脂含量恢复到生物质油提取前水平时，再次收集布朗葡萄藻细胞并按照上述步骤进行生物质油的提取和再培养；重复利用布朗葡萄藻进行生物质油提取10次以上，其细胞活力和产油脂能力均能恢复到正常水平。

[0033] 实施例4

[0034] 将一定体积的生物量达到2g/L以上的布朗葡萄藻培养液经过滤后收集湿藻体，湿藻体含水量95％；将湿藻体置入搅拌反应器中，在室温下加入由正庚烷和二甲氧基丙烷(100∶1.5，v/v)组成的提取溶剂进行布朗葡萄藻生物质油的提取，提取溶剂用量为湿藻体体积的4倍，在350rpm的速率下搅拌10min，分离藻体细胞并收集含有生物质油的提取溶剂，重新加入新的提取溶剂，重复提取操作步骤，湿藻体总计提取3次，油脂总提取率为40％；将收集的含有生物质油的提取溶剂合并，进行真空旋转蒸发，回收提取溶剂进行重复利用，并收集获得的生物质油；将经过油脂提取的湿藻体细胞加入到其体积20倍的新鲜培养基中，搅拌使之重新悬浮，接种到反应器中，用新鲜培养基补足至原有培养液体积进行布朗葡萄藻细胞的再培养；当培养的布朗葡萄藻生物量达到或超过上次提取前的水平，其细胞活力和油脂含量恢复到生物质油提取前水平时，再次收集布朗葡萄藻细胞并按照上述步骤进行生物质油的提取和再培养；重复利用布朗葡萄藻进行生物质油提取10次以上，其细胞活力和产油脂能力均能恢复到正常水平。

[0035] 实施例5

[0036] 将一定体积的生物量达到2g/L以上的布朗葡萄藻培养液经过滤后收集湿藻体，湿藻体含水量90％；将湿藻体置入搅拌反应器中，在室温下加入由正辛烷和二乙氧基甲烷(100∶0.5，v/v)组成的提取溶剂进行布朗葡萄藻生物质油的提取，提取溶剂用量为湿藻体体积的5倍，在200rpm的速率下搅拌15min，分离藻体细胞并收集含有生物质油的提取溶剂，重新加入新的提取溶剂，重复提取操作步骤，湿藻体总计提取3次，油脂总提取率为