高转导效率、嗜肝细胞性丙型肝炎拟似病毒及其包膜蛋白编码序列

摘要

本发明涉及生物医药工程技术领域。本发明筛选并通过基因突变的方法获得一株高转导效率、高肝细胞嗜性的丙型肝炎病毒包膜蛋白基因，将该基因的表达质粒与基于HIV的慢病毒包装质粒共转染可获得感染性滴度达到1×107FFU/ml的丙型肝炎病毒拟似病毒，该方法获得丙型肝炎病毒拟似病毒的感染滴度比其他方法高100倍，由于丙型肝炎病毒拟似病毒为肝细胞特异性感染，因此除了用于研究丙型肝炎的感染机制、评价中和抗体、筛选小分子药物以外，还可能作为肝细胞靶向性基因治疗载体，具有重要的应用前景。

权利要求

1.一种高滴度特异性感染肝细胞的丙型肝炎拟似病毒的制备方法，其特征在于具备了独特优化的丙型肝炎包膜蛋白，包膜蛋白序列是从HCV感染者血清中克隆并筛选而获得，并对高变区1进行了突变，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种高滴度特异性感染肝细胞的丙型肝炎拟似病毒的制备方法，其特征在于丙型肝炎拟似病毒的独特优化的丙型肝炎包膜蛋白具有人肝细胞靶向感染的特性，专一感染人肝组织来源的细胞。

3.根据权利要求1所述的一种高滴度特异性感染肝细胞的丙型肝炎拟似病毒的制备7

方法，其特征在于获得丙型肝炎拟似病毒的感染性达到1×10FFU/ml。

4.根据权利要求1所述的一种高滴度特异性感染肝细胞的丙型肝炎拟似病毒的制备方法，制备的丙型肝炎拟似病毒可用于研究HCV的感染机制，评价抗体以及小分子药物对HCV感染的阻断作用。

5.根据权利要求1所述的一种高滴度特异性感染肝细胞的丙型肝炎拟似病毒的制备方法，制备的丙型肝炎拟似病毒可用做肝组织靶向性基因治疗载体。

说明书

高转导效率、嗜肝细胞性丙型肝炎拟似病毒及其包膜蛋白

编码序列

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药工程技术领域，是一种含高转导效率、高肝细胞嗜性丙型肝炎包膜蛋白的拟似病毒颗粒及其制备方法。

背景技术

[0002] 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是一种嗜肝单股正链RNA病毒，属于黄病毒属成员，该病毒嗜肝特性的机制目前尚不十分清楚。目前鉴定出人四次跨膜素家族成员CD81、清道夫受体SR-BI和紧密连接蛋白claudin 1、occludin是HCV感染必须依赖的受体，但这四种分子也同时表达于其他组织细胞，因此不能以此完美解释HCV的嗜肝特性。HCV的体外细胞培养非常困难，目前尚不能用感染者血清在体外感染靶细胞从而达到分离培养的目的，这给研究HCV带来了很大困难。2003年法国和美国的两个实验室分别报道，用编码小鼠白血病病毒(MMLV)或人类免疫缺陷病毒(HIV)包装信号RNA序列及报告基因序列的质粒与衣壳蛋白-逆转录酶表达质粒以及HCV包膜蛋白表达质粒共转染人胚胎肾成纤维293T细胞，可以获得可感染性与HCV相似的嵌合病毒，该病毒表面的双层脂质膜中镶嵌有生物活性的HCV包膜糖蛋白，内部含有MLV或HIV的衣壳蛋白-逆转录酶。嵌合病毒表面的HCV包膜蛋白是该嵌合病毒具有与HCV相似生物特性(肝细胞嗜性、能被HCV中和抗体中和等)的结构基础。由于该嵌合病毒能模拟HCV的感染，但内部并非HCV的结构，因此被称为HCV拟似病毒(HCV pseudo-particle，HCVpp)。

[0003] 大量研究显示，HCVpp的细胞嗜性与天然HCV完全一致，只能感染人类肝组织来源的某些细胞系，感染性也严格依赖四种受体的表达，HCV包膜蛋白中和抗体能有效中和HCVpp的感染性。HCVpp的这些特点使其成为研究HCV感染机制的重要模型，同时，也为开发靶向感染肝细胞的病毒载体提供了一种有效途径。然而，目前所有实验室建立的HCVpp制备方法均存在一个共同的问题， 就是病毒产量及转导效率很低，293T细胞培养上清中的病毒滴度均低于105FFU(focus forming unit)/ml，这在很大程度上限制了HCVpp的应用，因此高滴度、高转导效率、高肝细胞嗜性的丙型肝炎拟似病毒颗粒的研制在HCV研究及生物技术运用上意义重大。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于建立一种能制备高滴度、高转导效率、高肝细胞嗜性HCVpp的方法，高滴度、高转导效率、高肝细胞嗜性的HCVpp不仅可用于研究HCV的感染机制，评价HCV疫苗诱导抗体的保护作用，还能用作肝组织靶向感染的基因治疗载体。 [0005] HCV拟似病毒颗粒的主要包括三个基本成分：1)慢病毒/逆转录病毒衣壳蛋白-逆转录酶，在293T细胞浆中主要负责识别并结合病毒核酸、构成病毒样结构及分泌出牙新的病毒颗粒，是病毒滴度的主要决定元件；在感染靶细胞后，该蛋白元件负责将病毒核酸RNA变成双链DNA，在其它蛋白的参与下将该DNA插入到核内染色体中完成病毒核酸插入宿主染色体以达到复制繁殖的目的。2)报告基因，是将报告基因绿色荧光蛋白/荧光素酶等编码序列与衣壳蛋白-逆转录酶识别序列合理拼接起来的一段RNA，在拟似病毒感染靶细胞后，该RNA能按照逆转录病毒/慢病毒在感染细胞内部的生活史，完成从RNA变成双链DNA的过程，并插入宿主染色体内，依靠宿主信使RNA的生理代谢特点，完成报告基因的表达，从而为人工制作的拟似病毒提供方便可靠的评测手段。3)HCV包膜蛋白，该蛋白元件在拟似病毒颗粒中的主要职能是负责模拟相关病毒的靶细胞嗜性，能很好地代表病毒感染早期阶段病毒包膜蛋白与宿主细胞发生的一切生物学现象。大量研究显示，含艾滋病毒包膜蛋白的拟似病毒颗粒能很好的呈现艾滋病毒包膜蛋白的生物学特性，含流感病毒包膜蛋白的拟似病毒颗粒也能很好地代表流感病毒感染早期包膜蛋白的生物学特性。HCV包膜蛋白能有效、高靶向地将HCVpp导入某些肝癌细胞株或者原代肝细胞、该特性能有效地被HCV感染病人血清中和说明该包膜蛋白能很好地代表HCV感染特性，是 区别不同拟似病毒颗粒的最关键元件。

[0006] HCV主要分成1-6个主要基因型别，近百种基因亚型，每种型别具备不同的生物学特性，如：1型占世界流行株的一半以上，也是干扰素加利巴韦林治疗不敏感的一个基因型。这些特性暗示着这个型别的HCV在宿主和病毒漫长的自然选择中具备比较强的生存能力。拟似病毒技术出现之前，人们没有办法来研究各个型别HCV包膜蛋白的生物学特性的差异，如，感染能力等，因此，研究不同基因型别HCV包膜蛋白的感染能力，筛选出具备高感染力的HCV包膜蛋白意义重大。

[0007] 本发明主要体现在筛选、优化了一株HCV包膜蛋白全长基因(1b亚型)，含有该序7
列编码的包膜蛋白的拟似病毒感染滴度可达到10FFU/ml。具体内容如下： [0008] 一，HCV包膜蛋白全长基因的克隆

[0009] 从50名HCV RNA阳性感染者血清中抽提病毒核酸RNA，然后用逆转录和聚合酶链反应扩增出HCV包膜蛋白全长基因，将扩增的基因插入高效表达载体，然后对扩增的基因进行测序鉴定。

[0010] 二，功能性HCV包膜蛋白编码序列的筛选

[0011] 运用50株HCV包膜蛋白全长基因插入表达质粒，结合衣壳蛋白-逆转录酶、报告基因表达系统，共同转染293T细胞，分别制作成50种HCVpp，50种HCVpp同时分别感染人肝癌Huh7细胞，72小时后用流式细胞仪检测Huh7细胞内报告基因绿色荧光蛋白(慢病毒质粒表达)的表达，以此判断50种HCVpp将报告基因转导到靶细胞的效率。通过该实验筛5
选出一株可制备出5×10FFU/ml HCVpp的HCV包膜蛋白编码基因。

[0012] 三、HCV包膜蛋白基因的优化

[0013] HCV包膜蛋白E2氨基末端的27个氨基酸高度变异，被成为高变区1(hypervariable region 1，HVR1)，HVR1是介导HCV包膜蛋白与HCV受体SR-BI结合的关键功能肽段，该肽段序列的变异不仅可使得HCV逃避免疫应答，还能通过调节HCV包膜蛋白与SR-BI的亲和力而影响HCV的感染性。我们将 HVR1的第8和第12位氨基酸残基同时突变为组氨酸，并缺失第16～24位氨基酸残基，构成优化的HCV包膜蛋白表达序列，运用该序列编码的HCV包膜蛋白构建新的HCVpp，比较该拟似病毒与未优化的拟似病毒基因转导
7
效率，结果显示该HCVpp感染性滴度能达到1×10FFU/ml。

[0014] 四，HCVpp细胞嗜性的鉴定

[0015] 我们进一步将HCVpp感染9种细胞系，结果表明，HCVpp仅能感染人肝组织来源的Huh7细胞和Hep3B细胞系。集合国际同行的结果，含该包膜蛋白显示很好的肝细胞嗜性。 [0016] 本发明中用于制备HCVpp的HCV包膜蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0017] 附图说明

[0018] 图1：50株HCVpp的感染性检测

[0019] 图2：HVR1突变对HCVpp感染性的影响

[0020] 图3：HCVpp对不同细胞系的易感性

[0021] 具体实施方式

[0022] 实施例1：HCV包膜蛋白全长基因的克隆

[0023] 1、HCV核酸的抽提

[0024] 分别从50名HCV RNA阳性感染者血清中抽提病毒核酸RNA，采用QIAGEN公司QIAamp Ultraseus virus试剂盒。

[0025] 具体方法：取1ml血清至2ml EP管并平衡温度至15℃-25℃，加800ul BufferAC，加5.6ulcarrier RNA到EP管盖子里，然后漩涡振荡10s混匀；室温培育10分钟，3200rpm3min离心，弃去全部上清；加300ul Buffer AR(60℃预热)加20ul蛋白酶K，漩涡振荡使沉淀全部溶解；40℃水浴10分钟期间漩涡振荡一次 5秒钟，将其全部移入QIAamp Spin Column 6000rpm 1min离心弃去废液；加 500ul Buffer AW1 7500rpm 1min离心弃去废液，加500ul Buffer AW2 15000rpm3min离心弃去废液，加30ul Buffer AVE 7500rpm 1min离心，收集含HCV RNA洗脱液，-20℃保存。

[0026] 2、逆转录和聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HCV包膜蛋白全长基因 [0027] 用Invitrogen逆转录试剂盒(Super Script II)对抽提的病毒RNA进行逆转录，引物采用随机引物。逆转录产物进行PCR扩增。

[0028] 具体方法：取1.5ml离心管，加去离子水5ul、随机引物(10uM)1ul、样品RNA 5ul、dNTP mix(10mM)1ul，65℃孵育5min后置于冰上，加5×First-strand Buffer 4ul、0.1M、TMDTT 2ul、RNaseOUT 1ul，25℃孵育2min，加SuperScript IIRT 1ul，25℃孵育10min，42℃孵育50min，70℃孵育15min，取2ul进行PCR扩增。

[0029] 逆转录产物进行PCR扩增。

[0030] 用Roche的高保真耐热DNA聚合酶(Pwo SuperYield DNA Polymerase)对逆转录产物进行扩增，分两轮进行。

[0031] 第一轮PCR扩增，引物：

[0032] 5′引物：GGCTTCGCCGAYCTCATGGGGTA(Y＝CT)

[0033] 3′引物：GATGCAGCCATCTCYCGGTC(Y＝CT)

[0034] 退火温度58℃，延伸时间2分钟，35个循环，PCR产物取4微升进行第二轮扩增。 [0035] 第二轮PCR扩增，引物：

[0036] 5′引物：GTTGCTCTTTYTCTATCTTC(Y＝CT)

[0037] 3′引物：GCTATCAGCAGCATCATCCA

[0038] 退火温度58℃，延伸时间2分钟，35个循环。

[0039] 3、PCR产物的克隆和测序

[0040] 将第二轮扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收扩增的分子量约1900bp的 DNA片段，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，获得抗氨苄青霉素的转化子接种LB，抽提质粒，酶切鉴定有相应的DNA片段插入后，对质粒进行DNA测序。获得了来源于50例HCV感染者的HCV包膜基因全长克隆。

[0041] 具体方法：取50ul PCR产物加10×loading buffer 5ul，1％agarose，TBE电泳液，100mv 40min电泳，回收1900bp的DNA片段。将电泳所得到的E1E2条带(1900bp)分别切下回收至以称重的1.5ml EP管中，用QIAEXⅡGel Extraction Kit纯化：加入3倍体积的Buffer QX1(100mg加300ul QX1)。加30ul Buffer QIAEX II然后50℃水浴10分钟，期间每两分钟漩涡振荡一次。13000rpm 30s离心，弃去上清，加500ul QIAEX I洗一次，加Buffer PE 500ul洗两次弃去上清，空气干燥15min直至沉淀变白。加入20ulTE漩涡振荡30秒培育5min，13000rpm，30s离心将上清移入1.5mlEP管。取纯化后的PCR产物2ul，pMD18-T vector 1ul，去离子水2ul加入5ul的solution I，16℃反应30min。全量加入至100ulDH5a，冰中放置30min，42℃加热45秒钟后，再冰中放置1min。加入LB培养基，37℃振荡培养60min。取100ul涂含有氨苄青霉素的L-琼脂平板培养基，37℃培养16小时，形成单菌落，挑出单菌落至含氨苄青霉素LB培养基培养8小时，将培养8小时的菌液用QIAprep Spin Miniprep Kit小提质粒：将菌液倒入标记好的1.5ml离心管中，13000rpm，4℃，3min，离心弃去上清；加250ul Buffer P1，混匀(不留块状沉淀)，加250ul Buffer P2，迅速轻轻颠倒4-6次；加入350ul Buffer N3，颠倒4-6次混匀，有白色絮状物析出，13000rpm，
4℃，10min；把QIAprep spin column放于一1.5ml EP管中(收集废液)然后将上清移入QIAprep spin column中，8000rpm 4℃1min；弃去废液，加750ul Buffer PE，13000rpm，
4℃，1min，弃去废液，13000rpm，4℃，1min离心，将QIAprep spin column移入新的1.5ml离心管中，竖直加30ul Buffer EB于膜上，放置1min后，4℃，13000rpm，1min离心获得液体单克隆的质粒。然后酶切鉴定，用限制性内切酶Nhe I和EcoRI对上步所得质粒进行双酶切鉴定。酶切体系为：10×NEBuffer(3)2ul、BSA 1ul、Nhe I 0.5ul、EcoRI 0.5ul、DNA 0.8ug、双蒸水补足20ul，37℃温育1小时，1％琼脂糖电泳。挑选酶切正确的克隆进行测序鉴定。 [0042] 实施例2：功能性HCV包膜蛋白编码序列的筛选

[0043] 1、HCV包膜蛋白表达质粒的构建

[0044] 将经过酶切、测序鉴定正确的HCV包膜蛋白基因用PCR扩增，引物序列根据测序获得的5′和3′端序列设计、合成，在5′和3′端分别加入酶切位点Nhe I和EcoRI。PCR扩增产物用Nhe I和EcoRI酶切，插入质粒表达载体pCI-neo(Promega产品)，酶切鉴定后再测序鉴定。正确的质粒用于制备HCVpp。

[0045] 具体方法：

[0046] A限制性内切酶消化：将鉴定正确的带有HCV包膜蛋白编码序列的克隆和pCI-neo表达质粒分别用Nhe I和EcoRI限制性内切酶消化，酶切体系为：10×NEBuffer(3)10ul、Nhe I 5ul、EcoRI 5ul、BSA 1ul、质粒DNA 5ug、双蒸水补足至100ul，37℃温育2小时。1％琼脂糖电泳，回收1900bp的DNA片段和pCI-neo载体片段。将电泳所得到的E1E2条带和pCI-neo条带分别切下回收至以称重的1.5ml EP管中，用QIAEXⅡ Gel Extraction Kit纯化：加入3倍体积的Buffer QX1(100mg加300ul QX1)。加30ul Buffer QIAEX II然后50℃水浴10分钟，期间每两分钟漩涡振荡一次。13000rpm 30s离心，弃去上清，加500ul QIAEXI洗一次，加Buffer PE 500ul洗两次弃去上清，空气干燥15min直至沉淀变白。加入20ulTE漩涡振荡30秒培育5min，13000rpm，30s离心将上清移入1.5mlEP管。按E1E2基因片段与pCI-neo载体基因片段3∶1比例用T4连接酶(Invirtogen公司)分别进行定向连接，连接体系：5X Ligase Reaction Buffer 4ul、pCI-neo载体30fmol、E1E2基因片段90fmol、T4DNA Ligase 1U、去离子水补足至20ul，混匀后室温静止1小时。取2ul转化至DH5α，涂布L-琼脂平板培养基(氨苄青霉素)，37℃培养16小时。挑取单克隆至LB(含氨苄青霉素)，37℃200rpm振荡培养8小时。提取质粒；酶切鉴定，酶切反应体系：10×NEBuffer(3)2ul、Nhe I 0.5ul、EcoRI 0.5ul、BSA 2ul、质粒DNA 0.5ug、双蒸水补足100ul，37℃温育40min，
1％琼脂糖电泳。测序鉴定。

[0047] 2、HCVpp制备

[0048] 将HCV包膜蛋白表达质粒与基于HIV的慢病毒包装质粒(Invitrogen产品)共转染293T细胞。全部质粒包括：HCV包膜蛋白表达质粒，pLP1质粒(Invitrogen产品)，pLP2质粒(Invitrogen产品)，pLenti-EGFP质粒(Invitrogen产品)。各质粒用量比例：2∶5∶3∶3。转染48小时后收集细胞培养上清，过滤45μm滤器，用于感染Huh7细胞。 [0049] 具体方法：

[0050] A.Huh7和293T细胞株的培养：Huh7和293T细胞株培养用DMEM10％FBS、1％HEPES、1％PS(Invirtogen公司)，传代：倒掉原有培养基，用0.01M PBS清洗两次，加0.25％Trypsin-EDTA 1ml将细胞消化下来后，加入完全培养基吹打两次使细胞分散开，取适量细胞悬液到新的培养瓶37℃5％CO2培养。

[0051] B.拟似病毒颗粒制作：将HCV包膜蛋白表达质粒，pLP1质粒，pLP2质粒，pLenti-EGFP质粒使用PolyFect Transfection Kit共同转染293T 37℃5％CO2二氧化碳培养箱72小时，收集上清用0.45umPVDF膜过滤，4℃保存。转染试验按PolyFect Transfection kit说明操作方法如下：1.5ml EP管取HCV包膜蛋白表达质粒(0.1ug/ul)2ul pLP1质粒(0.1ug/ul)5ul pLP2质粒(0.1ug/ul)3ul pLenti-EGFP质粒(0.1ug/ul)3ul加DMEM87ul充分混匀，加Polyfect 20ul混匀，室温静止5-10分钟。取一瓶293T细胞(培养瓶75cm2)用0.01M PBS洗两遍，0.25％Trypsin EDTA消化后，加完全培养基吹打分散，计数，6孔板每孔种150万个细胞补足每孔培养基终体积1.5ml，将准备好的质粒转染试剂混合液加600ul完全培养基吹打两次加入6孔板，轻拍使细胞均匀分布，37℃5％CO2二氧化碳培养箱培养72小时。收集上清，用0.45umPVDF膜过滤，4℃保存。 [0052] 3、HCVpp感染人肝癌Huh7细胞系

[0053] 分别取上述过滤处理的细胞培养上清100μl，加入预先接种有8000个Huh7细胞的96孔板(先吸除原培养上清)，5小时后换液，然后继续培养72小时。

[0054] 具体方法：将Huh7细胞用0.01M PBS洗两遍，用0.25％Trypsin EDTA消化后加完全培养基，吹打几次，使细胞充分分散，计数，96孔板，每孔8000个细 胞，37℃5％二氧化碳培养箱培养8小时。将上面准备的96孔板培养基吸出，用将过滤处理的细胞上清与完全培养基1∶1混合每孔加100ul病毒混合液。37℃5％二氧化碳培养箱5小时后换成完全培养基。继续培养72小时。

[0055] 4、用流式细胞检测表达绿色荧光蛋白(EGFP)的细胞阳性率，根据检测的细胞总数、EGFP阳性率以及投入的HCVpp上清体积(100μl)，计算HCVpp的滴度FFU。结果如图4 4 5
所示，50株HCVpp的感染性差异显著，41株低于1×10FFU/ml，8株介于1×10-1×10FFU/
5
ml，一株为5×10FFU/ml，将该株命名为C50。

[0056] 实施例3：HCV包膜蛋白基因的优化

[0057] 1、我们前期的研究表明，HCV包膜蛋白HVR1中的碱性氨基酸残基对于HCVpp的感染性有重要影响，尤其是第8和第12位氨基酸残基如果是碱性氨基酸，能明显增强HCVpp的感染性。根据这些研究结果，我们将C50株HCV包膜蛋白基因中编码HVR1的第8位缬氨酸残基(V)和第12位苏氨酸残基(T)单独或同时突变为组氨酸残基，采用StratageneTM试剂盒(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit)进行突变。突变体分别命名为C50-V8H、C50-T12H、C50-VT-2H。

[0058] 2、我们前期的研究还表明，HCV包膜蛋白HVR1中的第16-24位氨基酸残基在空间上阻碍HCV包膜蛋白与SR-BI受体的结合，删除该肽段能明显增强HCVpp的感染性。因此，我们将C50CDC株HCV包膜蛋白基因中编码第16-24位氨基酸残基删除，采用Stratagene试剂盒进行突变，突变体命名为C50-D9。

[0059] 3、同时将HVR1的第8位缬氨酸残基和第12位苏氨酸残基突变为组氨酸残基，并缺失第16-24位氨基酸残基，突变体命名为C50-2HD9。

[0060] 4、分别以上述包膜蛋白突变体制作HCVpp(实施例2.2)，感染Huh7细胞，然后用流式细胞仪检测报告基因EGFP的表达，获得HCVpp的感染性滴度(图2)，上述突变体5 5
包装的HCVpp感染性滴度分别为：C50-V8H：9.2×10FFU/ml、C50-T12H：8.4×10FFU/ml、
6 6 7
C50-VT-2H：3.3×10FFU/ml、C50-D9：5.8×10FFU/ml、C50-2HD9：1×10FFU/ml。与原型
5
C50的5×10FFU/ml滴度相比，这些突变均能增加HCVpp的感染性滴度，尤其是突变具有协
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同效应，使得C50-2HD9 突变体HCVpp滴度能高达1×10FFU/ml，目前没有任何相关技术报道。

[0061] 实施例4：HCVpp细胞嗜性的鉴定

[0062] 将C50-HCVpp和突变体C50-2HD9HCVpp感染不同组织来源的细胞，包括293T细胞(人胚肾成纤维细胞)、Huh7细胞(人肝癌细胞)、Hep3B细胞(人肝癌细胞)、Raji细胞(人B淋巴瘤细胞)、Molt4细胞(人T淋巴瘤细胞)、Hela细胞(人宫颈癌细胞)、NIH3T3细胞(小鼠成纤维细胞)、CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)。将上述细胞接种96孔板，每孔8000个细胞，过夜培养后，吸除原培养液，每孔加入C50-HCVpp或突变体C50-2HD9HCVpp上清100μl，5小时候换液，继续培养72h，检测EGFP的表达。结果C50-HCVpp和突变体C50-2HD9HCVpp仅感染Huh7细胞和Hep3B细胞，不感染其他任何细胞，表明制备的HCVpp具有嗜肝细胞的特征(图3)。