一种KRAS基因突变检测液相芯片

摘要

本发明公开了一种KRAS基因突变检测液相芯片，其主要包括有：(A)针对KRAS基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列能相应地与所选的tag序列互补配对；用于扩增出含有Codon 12、Codon 13和/或Codon 61的相应突变位点的KRAS基因目标序列的扩增引物。本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。所制备的KRAS基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，可实现同一位点多种突变型和多种突变位点的并行检测。

权利要求

1.一种KRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有：

(A)针对KRAS基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQ ID NO.109～SEQ ID NO.126中的序列；所述特异性引物是：针对Codon 12的、来源于SEQ ID NO.1或其反向互补序列中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO.2～SEQ IDNO.7中一条以上或其反向互补序列中一条以上的碱基序列；针对Codon 13的、来源于SEQ IDNO.8或其反向互补序列中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.14中一条以上或其反向互补序列中一条以上的碱基序列；和/或针对Codon 61的、来源于SEQ ID NO.15或其反向互补序列中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.18中一条以上或其反向互补序列中一条以上的碱基序列；上述特异性引物的3’端的最后3位碱基中任一个碱基为突变位点，所述特异性引物的Tm值在52～58℃之间；

(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQID NO.127～SEQ ID NO.144中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；

(C)用于扩增出具有Codon 12、Codon13和/或Codon61的相应突变位点的KRAS基因目标序列的扩增引物。

2.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为：

当特异性引物来源于SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14时，针对Codon 12和Codon13的扩增引物为SEQ ID NO.145～SEQ ID NO.146；当特异性引物来源于SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14的反向互补序列SEQ ID NO.55-SEQ ID NO.68时，针对Codon 12和Codon13的扩增引物为SEQ IDNO.147～SEQ ID NO.148；针对Codon61的扩增引物为SEQ ID NO.149～SEQ ID NO.150。

3.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述特异性引物为：

针对Codon 12野生型的SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20，以及突变型中的G12R突变位点的SEQID NO.21或SEQ ID NO.22、G12S突变位点的SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24、G12C突变位点的SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26、G12A突变位点的SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.28、G12D突变位点的SEQ ID NO.29或SEQ ID NO.30、和/或G12V突变位点的SEQ ID NO.31或SEQ IDNO.32；和/或针对Codon 13野生型的SEQ ID NO.33或SEQ ID NO.34、以及突变型中的G13R突变位点的SEQ ID NO.35或SEQ ID NO.36、G13S突变位点的SEQ ID NO.37或SEQ ID NO.38、G13C突变位点的SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.40、G13A突变位点的SEQ ID NO.41或SEQ IDNO.42、G13D突变位点的SEQ ID NO.43或SEQ ID NO.44、和/或G13V突变位点的SEQ ID NO.45或SEQ ID NO.46；和/或针对Codon 61野生型的SEQ ID NO.47或SEQ ID NO.48，以及突变型中N61H突变位点的SEQ ID NO.49或SEQ ID NO.50、N61L突变位点的SEQ ID NO.51或SEQ IDNO.52、和/或N61K突变位点的SEQ ID NO.53或SEQ ID NO.54。

4.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述特异性引物为：

针对Codon 12野生型的SEQ ID NO.73或SEQ ID NO.74，以及突变型中的G12R突变位点的SEQID NO.75或SEQ ID NO.76、G12S突变位点的SEQ ID NO.77或SEQ ID NO.78、G12C突变位点的SEQ ID NO.79或SEQ ID NO.80、G12A突变位点的SEQ ID NO.81或SEQ ID NO.82、G12D突变位点的SEQ ID NO.83或SEQ ID NO.84、和/或G12V突变位点的SEQ ID NO.85或SEQ IDNO.86；和/或针对Codon 13野生型的SEQ ID NO.87或SEQ ID NO.88、以及突变型中的G13R突变位点的SEQ ID NO.89或SEQ ID NO.90、G13S突变位点的SEQ ID NO.91或SEQ ID NO.92、G13C突变位点的SEQ ID NO.93或SEQ ID NO.94、G13A突变位点的SEQ ID NO.95或SEQID NO.96、G13D突变位点的SEQ ID NO.97或SEQ ID NO.98、和/或G13V突变位点的SEQ IDNO.99或SEQ ID NO.100；和/或针对Codon 61野生型的SEQ ID NO.101或SEQ ID NO.102，以及突变型中N61H突变位点的SEQ ID NO.103或SEQ ID NO.104、N61L突变位点的SEQ ID NO.105或SEQ ID NO.106、和/或N61K突变位点的SEQ ID NO.107或SEQ ID NO.108。

5.根据权利要求1-4任一所述的KRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。

6.根据权利要求5所述的KRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为

5-10个T。

说明书

一种KRAS基因突变检测液相芯片

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种KRAS基因突变检测液相芯片。

背景技术

[0002] KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因，KRAS基因突变在胰腺癌、结肠癌和肺癌中都有发现。现已发现的KRAS突变型共有11种，其转变为活性致癌基因的主要原因是Exon 2的第12、13密码子和Exon 3的第61密码子的发生突变，其中以第12密码子点突变最为常见。第12位密码子点突变在胰腺癌组织中检出率高达71％-100％，在胰液中高达67％-100％，在血浆中高达27％-81％，在十二指肠液中高达60.9％-66％，而正常胰腺组织、胰岛素瘤及胰腺良性囊肿中均无KRAS基因突变。

[0003] KRAS蛋白是表皮生长因子受体(EGFR)信号传导通路中的一个关键的下游调节分子。研究表明，KRAS基因突变与非小细胞肺癌对吉非替尼、厄罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关。最近的研究还发现KRAS基因的突变使结直肠癌患者对西妥西单抗的治疗产生耐药性。因此KRAS基因的突变可作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂靶向治疗抗性产生的重要预测指标。本发明所开发的KRAS基因突变检测液相芯片涉及的突变位点如下表所示：

[0004]

[0005]

[0006] 目前，已经建立的KRAS基因突变检测技术，主要是PCR-测序法和实时荧光定量PCR检测技术。PCR-测序法具有能够确定突变范围和类型的优点，是目前应用较为广泛的检测方法，但测序法的灵敏度只有20％-25％，远远不能满足实际应用的需要，尤其是对于异质性的肿瘤体细胞突变，低灵敏度将导致大量的漏检。同时，测序法检测操作复杂，时效性差，对于要求高时效性和高灵敏度实际应用检测，测序法的局限性早已凸显。而实时荧光定量PCR检测技术，其检测效率高，时效性强，但其高居不下的假阳性率也为实际应用所诟病。基于上述检测技术存在的问题，申请人前期成功开发的“kRas基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法”(申请号：200810218430.5)检测方法操作简单，通过酶切富集排除了大量野生型序列造成的干扰，结果特异性好，灵敏度高，准确度达99％以上，但该方法涉及两轮PCR操作，较易造成污染，且杂交检测步骤探针较为接近(只有突变位点不同)，不便于多种基因突变位点并行检测。

发明内容

[0007] 本发明的目的之一是提供KRAS基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测KRAS基因Codon 12的正常基因型及六种突变型：G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V，Codon13的正常基因型及六种突变型：G13R、G13S、G13C、G13A、G13D、G13V，以及Codon 61的正常基因型及三种突变型：N61H、N61L、N61K。

[0008] 一种KRAS基因突变检测液相芯片，主要包括有：

[0009] (A)针对KRAS基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQ ID NO.109-SEQ ID NO.126中的序列；所述特异性引物是：针对Codon 12的、来源于SEQ ID NO.1或其反向互补序列中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO.2-SEQ IDNO.7中一条以上或其反向互补序列中一条以上的碱基序列；针对Codon 13的、来源于SEQ IDNO.8或其反向互补序列中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.14中一条以上或其反向互补序列中一条以上的碱基序列；和/或针对Codon 61的、来源于SEQ ID NO.15或其反向互补序列中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO.16-SEQ ID NO.18中一条以上或其反向互补序列中一条以上的碱基序列；上述特异性引物的3’端的最后3位碱基中任一个碱基为突变位点，所述特异性引物的Tm值在52～58℃之间；

[0010] (B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQID NO.127～SEQ ID NO.144中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；

[0011] (C)用于扩增出具有Codon 12、Codon13和/或Codon 61的相应突变位点的KRAS基因目标序列的扩增引物。

[0012] 优选地，所述扩增引物为：当特异性引物来源于SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.14时，针对Codon 12和Codon13的扩增引物为SEQ ID NO.145～SEQ ID NO.146；当特异性引物来源于SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.14的反向互补序列SEQ ID NO.55-SEQ ID NO.68时，针对Codon12和Codon13的扩增引物为SEQ ID NO.147～SEQ ID NO.148；针对Codon61的扩增引物为SEQ ID NO.149～SEQ ID NO.150。

[0013] 优选地，所述特异性引物为：针对Codon 12野生型的SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20，以及突变型中的G12R突变位点的SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22、G12S突变位点的SEQ IDNO.23或SEQ ID NO.24、G12C突变位点的SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26、G12A突变位点的SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.28、G12D突变位点的SEQ ID NO.29或SEQ ID NO.30、和/或G12V突变位点的SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32；和/或针对Codon 13野生型的SEQID NO.33或SEQ ID NO.34、以及突变型中的G13R突变位点的SEQ ID NO.35或SEQ ID NO.36、G13S突变位点的SEQ ID NO.37或SEQ ID NO.38、G13C突变位点的SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.40、G13A突变位点的SEQ ID NO.41或SEQ ID NO.42、G13D突变位点的SEQID NO.43或SEQ ID NO.44、和/或G13V突变位点的SEQ ID NO.45或SEQ ID NO.46；和/或针对Codon 61野生型的SEQ ID NO.47或SEQ ID NO.48，以及突变型中N61H突变位点的SEQ ID NO.49或SEQ ID NO.50、N61L突变位点的SEQ ID NO.51或SEQ ID NO.52、和/或N61K突变位点的SEQ ID NO.53或SEQ ID NO.54。

[0014] 或者，所述特异性引物为：针对Codon 12野生型的SEQ IDNO.73或SEQ ID NO.74，以及突变型中的G12R突变位点的SEQ ID NO.75或SEQ ID NO.76、G12S突变位点的SEQ IDNO.77或SEQ ID NO.78、G12C突变位点的SEQ ID NO.79或SEQ ID NO.80、G12A突变位点的SEQ ID NO.81或SEQ ID NO.82、G12D突变位点的SEQ ID NO.83或SEQ ID NO.84、和/或G12V突变位点的SEQ ID NO.85或SEQ ID NO.86；和/或针对Codon 13野生型的SEQID NO.87或SEQ ID NO.88、以及突变型中的G13R突变位点的SEQ ID NO.89或SEQ ID NO.90、G13S突变位点的SEQ ID NO.91或SEQ ID NO.92、G13C突变位点的SEQ ID NO.93或SEQ ID NO.94、G13A突变位点的SEQ ID NO.95或SEQ ID NO.96、G13D突变位点的SEQ ID NO.97或SEQ ID NO.98、和/或G13V突变位点的SEQ ID NO.99或SEQ ID NO.100；和/或针对Codon 61野生型的SEQ ID NO.101或SEQ ID NO.102，以及突变型中N61H突变位点的SEQ ID NO.103或SEQ ID NO.104、N61L突变位点的SEQ ID NO.105或SEQ IDNO.106、和/或N61K突变位点的SEQ ID NO.107或SEQ ID NO.108。

[0015] 优选地，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述间隔臂序列为5-10个T。

[0016] 本发明的主要优点在于：

[0017] 1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。所制备的KRAS基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，可实现同一位点多种突变型和多个突变位点的并行检测。

[0018] 2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种突变类型。各种特异性ASPE引物，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种引物、探针之间基本不存在非特异性结合。

[0019] 3.本发明的检测方法步骤简单，多种ASPE特异性引物的组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统。

具体实施方式

[0020] 实施例1KRAS基因突变检测液相芯片，主要包括有：

[0021] 一、ASPE引物

[0022] 针对KRAS基因Codon 12的正常基因型及六种突变型：G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V，Codon 13的正常基因型及六种突变型：G13R、G13S、G13C、G13A、G13D、G13V，以及Codon 61的正常基因型及三种突变型：N61H、N61L、N61K，分别设计特异性的引物序列。

[0023] KRAS基因突变检测的ASPE引物的设计要点为：

[0024] ASPE引物由“Tag+特异性引物序列”组成。其中，5’端为根据KRAS基因突变检测所设计的Tag序列，所设计的Tag序列在反应体系能最大限度的避免ASPE引物可能形成的二级结构，且Tag序列与Tag序列，Tag序列与特异性引物序列之间不发生交叉反应。Tag序列和特异性引物序列形成完整的ASPE引物，并使所有的ASPE引物能够在一个均一的反应体系中同步反应(即同一反应的缓冲环境，同一反应温度等)，完成并行检测。所设计的Tag序列具体如表5。3’端为根据KRAS基因突变检测所设计的特异性引物序列，所述特异性引物的Tm值在52～58℃之间；其中针对各种突变型的特异性引物序列，其3’端的最后3位碱基中的一个碱基应为突变位点；所述Codon12、Codon13或Codon61野生型的特异性引物序列3’端的最后3个碱基应分别包含Codon12、Codon13或Codon61位点。所述Tm值的计算方式为Tm＝(G+C)×4+(A+T)×2-4。

[0025] 表1KRAS基因突变检测特异性引物的来源序列之一(□内为突变位点)[0026]

[0027] 根据上述的ASPE引物中特异性引物序列的设计要点，设计得到一系列的特异性引物序列，其中例举部分野生型和突变型特异性引物，如表2：

[0028] 表2KRAS基因突变检测特异性引物序列之一

[0029]

[0030]

[0031] 同样的，表1中KRAS基因突变检测特异性引物的来源序列的反向互补序列也可以用于设计ASPE的特异性引物，具体的来源序列如表3：

[0032] 表3KRAS基因突变检测特异性引物的来源序列之二

[0033]

[0034]

[0035] 同样的，根据上述的ASPE引物中特异性引物序列的设计要点，由表3中特异性引物的来源序列设计得到一系列的特异性引物序列，其中例举部分野生型和突变型特异性引物，如表4：

[0036] 表4KRAS基因突变检测特异性引物序列之二

[0037]

[0038]

[0039] 表5Tag序列

[0040]SEQ ID NO. Tag序列(5′-3′)
109 AATCAATCTTCATTCAAATCATCA
110 CTTTAATCCTTTATCACTTTATCA
111 AATCCTTTCTTTAATCTCAAATCA
112 TTCAATCATTCAAATCTCAACTTT
113 CTTTTCAAATCAATACTCAACTTT
114 CTTTCTACATTATTCACAACATTA
115 CAATTTACTCATATACATCACTTT
116 AATCTTACCAATTCATAATCTTCA
117 CTACTTCATATACTTTATACTACA
118 CTTTCAATTACAATACTCATTACA
119 TCAATCATAATCTCATAATCCAAT
120 TACACATCTTACAAACTAATTTCA
121 CAATTAACTACATACAATACATAC
122 ATACCAATAATCCAATTCATATCA
123 AATCATACCTTTCAATCTTTTACA
124 TTCACTTTTCAATCAACTTTAATC
125 AATCTTACTACAAATCCTTTCTTT
126 TTACTTCACTTTCTATTTACAATC

[0041] 所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。

[0042] 二、anti-tag序列包被的微球

[0043] 根据所设计的ASPE特异性引物序列，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物序列可能形成的二级结构，选择的18种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表6所示：

[0044] 表6微球编号与微球上相应的anti-tag序列

[0045]SEQ ID NO. 微球上对应的anti-tag序列(5′-3′) 微球编号
127 TGATGATTTGAATGAAGATTGATT 16
128 TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAG 17
129 TGATTTGAGATTAAAGAAAGGATT 21
130 AAAGTTGAGATTTGAATGATTGAA 23
131 AAAGTTGAGTATTGATTTGAAAAG 27
132 TAATGTTGTGAATAATGTAGAAAG 40
133 AAAGTGATGTATATGAGTAAATTG 56
134 TGAAGATTATGAATTGGTAAGATT 61
135 TGTAGTATAAAGTATATGAAGTAG 63
136 TGTAATGAGTATTGTAATTGAAAG 43
137 ATTGGATTATGAGATTATGATTGA 62
138 TGAAATTAGTTTGTAAGATGTGTA 74
139 GTATGTATTGTATGTAGTTAATTG 77
140 TGATATGAATTGGATTATTGGTAT 70
141 TGTAAAAGATTGAAAGGTATGATT 75
142 GATTGTAAATAGAAAGTGAAGTAA 88
143 AAAGAAAGGATTTGTAGTAAGATT 29
144 GATTAAAGTTGATTGAAAAGTGAA 31

[0046] 选择的18种微球购自美国Luminex公司，每种微球具有不同颜色编码。将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T。

[0047] 微球包被的过程如下：

[0048] 分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制 10ng/ml 的 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)( 购 自 Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。

[0049] 三、扩增出含有检测位点的目标序列的引物

[0050] 目标检测KRAS基因Codon 12和Codon 13均位于外显子2中，而Codon 61则位于外显子3。利用Primer5.0设计引物(见表7)，扩增出含有检测位点的目标序列。检测Codon12与Codon13突变位点，当其特异性引物序列来源于SEQ ID NO.1～14时，使用SEQ IDNO.145～146扩增含有目标位点序列；当其特异性引物序列来源于SEQ ID NO.55～68时，使用SEQ ID NO.147～148扩增含有目标位点序列。检测Codon61突变位点均使用SEQ IDNO.149～150扩增含有目标位点序列。所设计的扩增引物对能够在同一PCR扩增条件下同步完成多重PCR反应，大大的提高了检测效率。

[0051] 表7扩增出具有突变位点的目标序列的引物

[0052]

[0053] 所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。

[0054] 实施例2运用KRAS基因突变检测液相芯片对样本的检测

[0055] 所述各种溶液的配方如下：

[0056] 50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：

[0057]试剂 来源 终浓度 每250ml的用量
MES(2[N-Morpholino]
Sigma M-2933 0.05M 2.44g
ethanesulfonic acid)
5M NaOH Fisher SS256-500 --- 5滴

[0058] 2×Tm杂交缓冲液

[0059]试剂 来源 终浓度 每250ml的用量
1MTris-HCl，pH8.0 SigmaT3038 0.2M 50ml
5M NaCl Sigma S5150 0.4M 20ml
Triton X-100 Sigma T8787 0.16％ 0.4ml

[0060] 过滤后贮存于4℃。

[0061] ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。

[0062] 生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

[0063] 一、样本的DNA提取：

[0064] 参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。

[0065] 二、待测样品的PCR扩增

[0066] 利用Primer5.0设计引物，多重PCR一步扩增出具有检测位点的目标序列，产物大小分别为153bp(SEQ ID NO.145-146)、138bp(SEQ ID NO.149-150)。引物序列(SEQ ID NO.145-150)见上述表7所示。

[0067] 首先配制PCR引物工作液：分别取SEQ ID NO.145-150的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。PCR反应体系如下：

[0068] 10×缓冲液(含Mg2+) 5ul

[0069] dNTP(各2.5mmol/L) 4ul

[0070] Taq酶(5U/ul) 0.5ul

[0071] 多重PCR引物工作液(各16.7pmol/mL) 6ul

[0072] 模板DNA(10ng/ul) 1ul

[0073] ddH2O 33.5ul

[0074] 共 50ul

[0075] PCR扩增程序为：95℃3min；94℃20s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。

[0076] 三、PCR产物的酶切处理

[0077] 详细步骤如下：

[0078] 1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入3ul ExoSAP-IT酶；

[0079] 2.37℃孵育15min。80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。

[0080] 四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)

[0081] 利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。

[0082] 首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取Codon12、Codon13和Codon61相应的野生型和突变型ASPE引物(具体如表8所示)贮存液10ul于3支不同的1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：其中，Group1和Group3以及Group5的检测，在一个反应系统中同时进行，即对Group1和Group3以及Group5并行检测。同时，Group2和Group4以及Group6的检测，也在同一个反应系统中同时进行，对Group2和Group4以及Group6并行检测。

[0083] 表8液相芯片制备的设计一

[0084]

[0085]

[0086] 10×缓冲液 2ul

[0087] MgCl2(50mmol/L) 0.5ul

[0088] Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul

[0089] dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul

[0090] Tsp酶(5U/ul) 0.25ul

[0091] 混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul

[0092] 酶切处理的PCR扩增产物 5ul

[0093] ddH2O 10.ul

[0094] 共 20ul

[0095] 反应程序为：96℃2min；94℃30s，52℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。

[0096] 五、杂交反应

[0097] 1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的最优的微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码；

[0098] 2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；

[0099] 3.微球于≥10000g离心1-2min；

[0100] 4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；

[0101] 5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；

[0102] 6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；

[0103] 7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；

[0104] 8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；

[0105] 9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；

[0106] 10.微球于≥3000g离心2-5min；

[0107] 11将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；

[0108] 12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。

[0109] 六、结果检测与数据分析

[0110] 反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以突变型荧光值(MFI)大于100为cut-off值，当突变型检测的MFI值大于100时，判定该样本存在该突变类型，否则判定该样本为相应的野生型。检测结果如表9、表10、表11和表12所示。

[0111] 使用本方法检测大量样本的KRAS基因突变，以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的KRAS基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的KRAS基因突变检测液相芯片能够准确地检测出KRAS基因的突变类型，且结果稳定可靠。

[0112]

[0113]

[0114] 表11样本检测结果三(MFI)

[0115]

[0116] 表12样本KRAS基因突变检测结果分析

[0117]

[0118]13 野生型 野生型 野生型
14 野生型 野生型 野生型
15 G12S突变 G12S突变 G12S突变
16 野生型 野生型 野生型
17 野生型 野生型 野生型
18 野生型 野生型 野生型
19 野生型 野生型 野生型
20 野生型 野生型 野生型

[0119] 针对同一突变位点所设计的2组特异性引物序列对样品的检测，均取得一致的检测效果。根据上述ASPE引物设计要点分别设计的不同液相芯片，其特异性引物序列不同，而检测结果一致。其他类似情况的具体检测数据省略。

[0120] 实施例3来源序列不同的野生型和突变型特异性引物序列的选择

[0121] 一、液相芯片制备的设计(野生型和突变型特异性引物序列的选择)[0122] 针对KRAS基因Codon12、Codon13和Codon61突变位点，分别设计野生型和突变型的ASPE引物3’端的特异性引物序列，检测Codon12、Codon13和Codon61突变的特异性引物序列分别是来源于SEQ ID NO1～18的SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.54，或来源于SEQ IDNO.55～72的SEQ ID NO.73～SEQ ID NO.108。野生型和突变型ASPE引物5’端的Tag序列分别选自SEQ ID NO.109～126，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列分别选自SEQ ID NO.127～144。具体设计如下表(表13)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。

[0123] 其中，检测Codon12和Codon13时，当其特异性引物序列来源于SEQ ID NO.1～14时，使用SEQ ID NO.145～146扩增含有目标位点序列；当其特异性引物序列来源于SEQ IDNO.55～68时，使用SEQ ID NO.147～148扩增含有目标位点序列。检测Codon61突变位点的均使用SEQ ID NO.149～150扩增含有目标位点序列。

[0124] 其中，Group1和Group3以及Group5的检测，在一个反应系统中同时进行，即对Group1和Group3以及Group5并行检测。同时，Group2和Group4以及Group6的检测，也在同一个反应系统中同时进行，对Group2和Group4以及Group6并行检测。

[0125] 表13液相芯片制备的设计二

[0126]

[0127]

[0128] 二、样品检测：采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：

[0129]

[0130]

[0131] 表16样本检测结果三(MFI)

[0132]

[0133] 表17样本检测结果分析

[0134]

[0135] 针对同一突变位点的来源于SEQ ID NO.1～18或来源于SEQ ID NO.55～72的特异性引物序列，符合上述ASPE引物设计的要点，均可用于Codon12、Codon13和Codon61突变型检测，且检测结果一致，结果稳定可靠。其他类似情况的具体数据省略。

[0136] 实施例4野生型和突变型特异性引物序列的选择

[0137] 一、液相芯片制备的设计(野生型和突变型特异性引物序列的选择)[0138] 分别以KRAS基因的Codon12、Codon13和Codon61中一个突变位点的检测液相芯片为例，针对Codon12、Codon13和Codon61的野生型设计ASPE引物3’端特异性引物序列，而Codon12、Codon13和Codon61突变型分别选取G12R、G13R、N61H突变位点，针对G12R、G13R、N61H位点的ASPE引物3’端的特异性引物序列分别选自SEQ ID NO.21-SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.35-SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.49-SEQ ID NO.50。Codon12、Codon13和Codon61的野生型Tag序列分别固定为：SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.110和SEQ IDNO.111，其相应的突变型分别固定为：SEQ ID NO.112、SEQ ID NO.113和SEQ ID NO.114，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列为tag序列的互补序列，分别选自SEQ ID NO.127-SEQ ID NO.132。具体设计如下表(表18)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。

[0139] 其中，Group1和Group3以及Group5的检测，在一个反应系统中同时进行，即对Group1和Group3以及Group5并行检测。同时，Group2和Group4以及Group6的检测，也在同一个反应系统中同时进行，对Group2和Group4以及Group6并行检测。

[0140] 表18液相芯片制备的设计三

[0141]

[0142] 二、样品检测

[0143] 采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检测结果如下：

[0144]

[0145] 表20样本检测结果分析

[0146]

[0147] 针对同一突变位点的野生型和突变型特异性引物序列(其中，Codon12、Codon13、Codon61的野生型特异性引物分别选自SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.33-34和SEQ IDNO.47-48，针对其相应突变位点的特异性引物分别选自SEQ ID NO.21-32、SEQ ID NO.35-36和SEQ ID NO.49-50)，所组成的液相芯片均可进行检测，且检测结果一致。同样的，根据上述ASPE引物设计的要点分别设计的来源于SEQ ID NO.1～18、或SEQ ID NO.55～72的特异性引物，均可进行检测，结果稳定可靠。其他类似情况的具体检测数据省略。

[0148] 实施例5Tag序列及Anti-Tag序列的选择

[0149] 一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)

[0150] 以KRAS基因Codon12中G12R位点突变的检测液相芯片为例，针对Codon12的野生型和G12R突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.109～SEQ ID NO.126中的6条，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.127～SEQ ID NO.144。具体设计如下表(表21)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。

[0151] 表21液相芯片制备的设计四

[0152]

[0153] 二、样品检测

[0154] 采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品61-80进行检测，检测结果如下：

[0155] 表22样本检测结果(MFI)

[0156]

[0157] 表23样本检测结果分析

[0158]

[0159] 其它针对不同的突变位点的液相芯片，ASPE引物运用上述所设计的不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。

[0160] 以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。