vMIP-II蛋白的固相合成方法

摘要

本发明公开了一种vMIP-II蛋白的固相合成方法，其步骤为：反应瓶加入二甲基二氯硅烷通风过夜使反应瓶硅烷化，乙醇粗洗后置于-80℃冷却，再次洗涤烘干，称取树脂置于反应瓶中，加入3倍于树脂体积的DCM(二氯甲烷)溶液，溶胀30min后排空液体，然后在多肽合成仪上按偶连氨基酸、茚三酮反应检测和α-氨基脱保护的循环从C端到N端进行，直到全部氨基酸残基都偶连上去。偶连完成后，取下反应瓶用DCM清洗，抽干树脂后用预冷的切割液切割，切割下来的多肽用HPLC进行纯化。多肽纯化在Waters600E高压液相色谱仪上，用Kromasil100-5C18柱子进行高压反相色谱，收集的目的峰多肽即为vMIP-II蛋白。

权利要求

1.vMIP-II蛋白的固相合成方法，步骤如下：

（1）固相合成仪的反应瓶清洗后加入浓度为5%的二甲基二氯硅烷，通风过夜使反应瓶硅烷化，清洗后在-80℃冷却反应瓶，再次清洗，烘干备用；

（2）称取Wang's树脂置于反应瓶中，加入3倍于树脂体积的DCM溶液，溶胀30min后排空液体，然后在多肽合成仪上按偶连氨基酸、茚三酮反应检测和α-氨基脱保护的循环从C端到N端进行，直到全部氨基酸残基都偶连上去；

（3）偶连完成后，取下反应瓶用DCM清洗，抽干树脂后用预冷的1-羟基苯并三氮唑切割液切割，切割下来的多肽进行HPLC纯化后得到产品。

2.根据权利要求1所述的vMIP-II蛋白的固相合成方法，其特征在于步骤（1）中所述清洗是用100%乙醇充分清洗。

3.根据权利要求1所述的vMIP-II蛋白的固相合成方法，其特征在于HPLC纯化在Waters600E 高压液相色谱仪上，用Kromasil 100-5C18柱子进行高压反相色谱。

说明书

vMIP-II蛋白的固相合成方法

技术领域

[0001] 本发明涉及多肽的化学合成方法，具体涉及蛋白质vMIP-II的固相合成方法。

背景技术

[0002] 病毒巨噬细胞炎症蛋白II（viral macrophage inflammatory protein-II，vMIP-II）是由卡波氏肉瘤病毒（又称人疱疹病毒8）编码的病毒基因产物。vMIP-II全基因编码94个氨基酸，成熟蛋白为74氨基酸，与人的MIP同源性高达41％，其中8种非极性氨基酸占40％，具有较强的疏水性。

[0003] vMIP-II蛋白不仅能够通过与趋化因子受体结合在免疫炎症病理反应中发挥作用，而且还可以作用于免疫细胞上的趋化因子受体，通过激动或拮抗受体来调节免疫细胞的功能，在HIV感染／艾滋病和移植排斥反应等方面有更多的研究应用价值。

[0004] 申请人已成功运用大肠杆菌原核表达系统来表达vMIP-II，但由于需要经过vMIP-II包涵体变性、复性的过程，纯化周期较长，制备成本也较高，工业化生产及产品应用受到限制。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的上述问题，提供一种vMIP-II蛋白的固相合成方法。

[0006] 本发明通过以下技术手段实现上述目的：

[0007] 一种vMIP-II蛋白的固相合成方法，包括以下步骤：

[0008] （1）固相合成仪的反应瓶清洗后加入二甲基二氯硅烷，通风过夜使反应瓶硅烷化，清洗后在-80℃冷却反应瓶，再次清洗，烘干备用；

[0009] （2）称取Wang's树脂置于反应瓶中，加入3倍于树脂体积的DCM溶液，溶胀后排空液体，然后在多肽合成仪上按偶连氨基酸、茚三酮反应检测和α-氨基脱保护的循环从C端到N端进行，直到全部氨基酸残基都偶连上去；

[0010] （3）偶连完成后，取下反应瓶用DCM清洗，抽干树脂后用预冷的切割液切割，切割下来的多肽进行纯化后得到产品。

[0011] 步骤（1）中所述清洗是用100%乙醇充分清洗；所述二甲基二氯硅烷的浓度为5%，在此浓度下能使反应瓶达到最佳的硅烷化效果。

[0012] 步骤（2）中所述溶胀为溶胀30min。溶胀30min能使树脂达到充分溶胀。

[0013] 步骤（3）中所述切割液为切割液为1-羟基苯并三氮唑（HOBt）。Fmoc脱保护所使用的切割液以往常用的为碱性试剂如哌啶等，其亲核性会在一定程度上会引起多肽二硫键的解离，从而导致合成的目的肽纯度下降，以及合成效率的降低。但是，我们使用“1-羟基苯并三氮唑（HOBt）”作为Fmoc脱保护切割液，能有效抑制多肽二硫键的解离，从而提高了合成的目的肽纯度以及合成效率。

[0014] 所述纯化是用HPLC进行纯化。

[0015] 多肽纯化在Waters600E 高压液相色谱仪上，用Kromasil 100-5C18柱子进行高压反相色谱。

[0016] 与现有技术相比，本发明的制备方法具有以下有益效果：

[0017] 我们通过这种化学合成方法，获得了具有活性的vMIP-II，提高了蛋白的纯度，缩短了生产周期，为将来生产vMIP-II开辟了新的途径。主要由于Fmoc脱保护所使用的切割液以往常用的为碱性试剂如哌啶等，其亲核性会在一定程度上会引起多肽二硫键的解离，从而导致合成的目的肽纯度下降，以及合成效率的降低。我们使用“1-羟基苯并三氮唑（HOBt）”作为Fmoc脱保护切割液，能有效抑制多肽二硫键的解离，从而提高了合成的目的肽纯度以及合成效率。

附图说明

[0018] 图1. 实施例1中得到的vMIP-II蛋白用API2000 LC/MS/MS进行质谱分析的结果图。

具体实施方式

[0019] 实施例1 vMIP-II多肽合成与纯化

[0020] （1）vMIP-II多肽合成

[0021] 多肽采用Fmoc－固相合成法在多肽合成仪上合成，将反应瓶用100%乙醇充分清洗后，加入约40ml的5%的二甲基二氯硅烷放置通风橱中过夜使反应瓶硅烷化，经乙醇粗洗后，置于-80℃冰箱30min冷却反应瓶，再次用乙醇洗涤，烘干备用；称取0.5mmol Wang's resin(Wang's树脂)0.7130g置于反应瓶中，加入3倍于树脂体积的DCM(二氯甲烷)溶液，溶胀30min后排空液体。然后在多肽合成仪上按偶连氨基酸、茚三酮反应检测和α-氨基脱保护的循环从C端到N端进行，直到全部氨基酸残基都偶连上去。偶连完成后，取下反应瓶用DCM清洗，抽干树脂后用预冷的切割液，切割液为1-羟基苯并三氮唑（HOBt）。切割下来的多肽用HPLC进行纯化。多肽纯化在Waters600E 高压液相色谱仪上，用Kromasil100-5C18柱子进行高压反相色谱，将收集的目的峰多肽冻干保存。

[0022] （2）vMIP-II多肽纯度的检测

[0023] HPLC检测多肽vMIP-II的纯度：取微量实施例1方法制备的多肽vMIP-II的冻干粉溶于体积百分比为50％甲醇与50％双蒸水的混合液中溶解，使终浓度小于0.1mg/ml。用HPLC的微量上样器按25μl上样到Kromasil 100-5C18柱子中，用0.5ml/min 的流速按体积百分比为90％乙腈～10％乙腈做线形梯度洗脱，用220nm波长检测。

[0024] 取多肽vMIP-II成品，加入双蒸水配成溶液，用API2000 LC/MS/MS进行质谱分析。

[0025] 分析结果如图1，合成纯化后的多肽VMIP-II峰面积占总面积的98.20％，也即是多肽VMIP-II的纯度为98.20%。

[0026] 实施例2 多肽活性测定- vMIP-II对HIV-1ⅢB诱导的细胞合胞体形成的抑制[0027] 将对数生长期MT4细胞（由广东省疾病预防控制中心提供）用RPMI-1640培养液调6
至每毫升8×10 个，取1ml离心弃上清，加入500µl细胞培养液重悬细胞。96孔板中每孔加入80µl MT4细胞悬液，加入HIV-1ⅢB病毒（人类艾滋病毒-1ⅢB型）（由广东省疾病预防
6
控制中心提供）[约1000 TCID50/(10cell)]20µl，分别在不同孔内加入不同浓度的vMIP-II（600、60、6 ng/ml）100µl，每个浓度设3个复孔（加vMIP-II的为实验孔）。

[0028] 同时设置空白对照组和阳性对照组。空白对照组只加正常MT4细胞和重组蛋白vMIP-II(实施例1方法制备)，不加HIV-1ⅢB病毒；阳性对照组加MT4细胞及HIV-1ⅢB病毒，不加药物。置于37℃、0.5%CO2 培养箱中培养。

[0029] 培养第3天观察样品对合胞体形成的影响，在倒置显微镜下计数HIV-1ⅢB诱导MT4细胞形成的合胞体数。计算vMIP-II对HIV-1ⅢB诱导MT4细胞形成合胞体的抑制率，按照Reed- Muench方法求出其IC50 (半数抑制浓度)，确定蛋白抑制50%的感染细胞形成合胞体的IC50值。计算公式如下：

[0030]-1

[0031] IC50 = lg [Xm-i(ΣP-0.5)]

[0032] 注: Xm：设计的最大浓度的对数值；i：各浓度稀释倍数的对数值；ΣP：各组合胞体形成抑制率之和；0.5：经验常数。

[0033] 不同浓度的蛋白vMIP-II，与感染HIV-1ⅢB病毒的MT4细胞共培养，培养至第3天，在倒置显微镜下计数HIV-1ⅢB诱导MT4细胞形成的合胞体数。用SPSS 12.0统计软件进行ANOVA分析各组合胞体数，vMIP-II组和阳性对照组比较采用Dunnett-t检验法。

[0034] 表1数据表明，不同浓度的蛋白vMIP- II（600、60、6 ng/ml）对合胞体形成的抑制率均与阳性对照组有差异，显示出较强的抑制病毒合胞体形成的活性，其IC50为1.02 ng/ml。

[0035] 表1 重组蛋白vMIP-II对HIV-1ⅢB诱导的合胞体形成的抑制作用(X ±S，n=3)[0036]组别 药物浓度(ng/ml) 合胞体数(个) 合胞体形成抑制率(%) IC50(ng/ml)阴性对照 600 0.00土0.00 － －
阳性对照 － 110.02土20.14 － －
vMIP-II 1.02
vMIP-II 600 36.09土5.34** 68.25
vMIP-II 60 48.23土8.12** 57.31
vMIP-II 6 69.30土5.41** 37.29

[0037] 注：**代表vMIP-II各组的合胞体数与阳性对照组相比，P ﹤0.05。

[0038] 结论：

[0039] 申请人先前已成功运用大肠杆菌原核表达系统来表达vMIP-II，但由于需要经过vMIP-II包涵体变性、复性的过程，纯化周期较长，制备成本也较高。在本发明中，我们通过化学合成方法，获得具有活性的vMIP-II，提高了蛋白的纯度，缩短了生产周期，为将来生产vMIP-II开辟了新的途径。