本发明公开一种磁珠法提取细菌质粒DNA的试剂盒及其提取方法，该试剂盒包括菌体重悬液、裂解液、中和液、磁珠结合液、洗涤液和洗脱液六种组分，试剂盒提取方法包括以下步骤：菌体重悬、裂解、中和、磁珠结合、洗涤、洗脱。本发明提取的质粒DNA纯度高，片段完整，提取过程方便快捷，高效安全。
1.一种磁珠法提取细菌质粒DNA的试剂盒，其包括菌体重悬液、裂解液、中和液、磁珠结合液、洗涤液和洗脱液六种组分，菌体重悬液：40～60mmol/L葡萄糖，PH7.6～8.4、20～
30mmol/L Tris，PH7.6～8.4、5～15mmol/L EDTA，95～115℃灭菌10～30min，2～4℃保存；裂解液：0.15～0.3mol/L NaOH，质量浓度0.8～1.6% 的SDS；中和液：4～5mol/L乙酸钾，4.5～5.5mol/L冰乙酸；其特征是：磁珠结合液：95～105ml异丙醇，3.5～4.5ml磁珠混悬液，二者混合配制成混悬液，其中磁珠混悬液由磁珠和水按照1:2体积比混合配置而成；磁珠粒径为2～6微米；
洗涤液：由20～30mmol/L Tris，8～13mmol/L EDTA，140～160mmol/L Na盐和无水乙醇混合组成，其中Tris、EDTA、Na盐与无水乙醇的价体积比为30%：70%；
洗脱液：6～10mmol/L Tris，PH8.0～8.5。
2.根据权利要求1所述的磁珠法提取细菌质粒DNA的试剂盒，其特征是：所述各组分中采用的水为蒸馏水、双蒸水或去离子水，其中洗脱液中采用双蒸水。
3.一种权利要求1所述的试剂盒提取细菌质粒DNA的方法，其特征是：其包括以下步骤：步骤1、取常规方法培养过夜的细菌培养液1～1.5ml，加入到离心管中，离心12000～
15000r/min，5～10min，收集菌体，加入50～150μl菌体重悬液，振荡5～10秒钟，重悬菌体；
步骤2、向重悬菌体中加入100～150μl裂解液，上下颠倒离心管4～8次混匀，持续时间2～3分钟，直至溶液变粘稠但清澈可见；
步骤3、向步骤2得到的裂解产物中加入50～100μl中和液，立即上下颠倒离心管3～
7次，至溶液出现絮状物沉淀，离心12000～15000 r/min，5～10min，贴近溶液上表面小心吸取上清150～250μl，转移到另一个新的离心管中；
步骤4、向步骤3得到的溶液中加入混匀的磁珠结合液150～300μl，振荡3～7秒钟混匀，室温下放置8～13分钟，然后将离心管放在磁力架上，进行磁分离，吸弃液体，保留磁珠；
步骤5、向步骤4的离心管中加入250～850μl洗涤液，振荡3～7秒钟混匀，放置
10～20秒钟，然后用磁力架进行磁分离，彻底吸净离心管上盖及管底的残液，室温下打开管盖干燥磁珠5～10分钟；
步骤6、向步骤5得到的溶液中加入30～150μl洗脱液，抽吸 6～8次混匀，室温下放置10～15分钟或57℃温育7～10分钟，然后进行磁分离，小心吸取上清液转移至新的离心管，即得细菌质粒DNA备用。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是：步骤4中，在室温下放置过程中每隔2～3分钟将离心管颠倒数次。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征是：步骤6中，在室温下放置或57℃温育过程中每隔2～3分钟轻摇离心管3～4下。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征是：所述重悬液和洗脱液储存于2～8℃，其它试剂储存于室温。
磁珠法提取细菌质粒DNA的试剂盒及其提取方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及一种磁珠法提取细菌质粒DNA的试剂盒及其提取方法。
背景技术
[0002] 分子生物学的诞生与发展是整个自然科学的一件大事，它使生命科学的研究上升到一个全新的阶段。DNA不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的合成和一系列重大生命的生长和变异过程中起决定性的作用。无论是基因工程或蛋白质工程，都首先要对DNA进行提取和纯化，特别是在基因工程中，对细菌质粒DNA的提取非常重要。
[0003] 目前，从细菌中提取质粒DNA常采用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS裂解法等，这些方法主要由细菌的培养（质粒DNA的扩增）、细菌的裂解（质粒DNA的释放）及质粒DNA的分离与纯化三个步骤组成。现有的商品化质粒DNA提取试剂盒大都具有无需有机溶剂酚仿抽提的优点，比起传统的提取方法好了许多，但仍摆脱不了繁琐的高速离心、真空抽滤、柱分离以及不能用仪器实现自动化提取的缺陷。
[0004] 近几年发展起来的磁珠法提取基因组DNA技术，提取的基因组DNA纯度高、产量高，提取步骤简单省时，使核酸的提取纯化过程变得轻松和简便，并在欧美国家得到了广泛的应用。但是，目前还没有关于磁珠法提取细菌质粒DNA的相关技术和报道。
发明内容
[0005] 为解决上述问题，本发明的目的是提供一种磁珠法提取细菌质粒DNA的试剂盒及其提取方法，提取的质粒DNA纯度高、片段完整，提取过程方便快捷，高效安全。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 一种磁珠法提取细菌质粒DNA的试剂盒，其包括菌体重悬液、裂解液、中和液、磁珠结合液、洗涤液和洗脱液六种组分，各组分的内容如下：
[0008] 菌体重悬液：40～60mmol/L葡萄糖，PH7.6～8.4、20～30mmol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷），PH7.6～8.4、5～15mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸），95～115℃灭菌10～30min，2～4℃保存；
[0009] 裂解液：0.15～0.3mol/L NaOH，质量浓度0.8～1.6% 的SDS（十二烷基硫酸钠）；
[0010] 中和液：4～5mol/L乙酸钾，4.5～5.5mol/L冰乙酸；
[0011] 磁珠结合液：95～105ml异丙醇，3.5～4.5ml磁珠混悬液，二者混合配制成混悬液，其中磁珠混悬液由磁珠和水按照1:2体积比混合配置而成；
[0012] 洗涤液：由20～30mmol/L Tris，8～13mmol/L EDTA，140～160mmol/L Na盐和无水乙醇混合组成，其中Tris、EDTA、Na盐与无水乙醇的价体积比为30%：70%；
[0013] 洗脱液：6～10mmol/L Tris，PH8.0～8.5。
[0014] 上述的磁珠混悬液中的磁珠粒径为2～6微米。
[0015] 上述的磁珠法提取细菌质粒DNA的试剂盒中采用的水为蒸馏水、双蒸水或去离子水，其中洗脱液中采用双蒸水。
[0016] 上述的磁珠法提取细菌质粒DNA的试剂盒提取方法，其包括以下步骤：
[0017] 步骤1、取常规方法培养过夜的细菌培养液1～1.5ml，加入到离心管中，离心12000～15000r/min，5～10min，收集菌体，加入50～150μl菌体重悬液，振荡5～10秒钟，重悬菌体；
[0018] 步骤2、向重悬菌体中加入100～150μl裂解液，上下颠倒离心管4～8次混匀，持续时间2～3分钟，直至溶液变粘稠但清澈可见；
[0019] 步骤3、向步骤2得到的裂解产物中加入50～100μl中和液，立即上下颠倒离心管3～7次，至溶液出现絮状物沉淀，离心12000～15000 r/min，5～10min，贴近溶液上表面小心吸取上清150～250μl，转移到另一个新的离心管中；
[0020] 步骤4、向步骤3得到的溶液中加入混匀的磁珠结合液150～300μl，振荡3～7秒钟混匀，室温下放置8～13分钟，然后将离心管放在磁力架上，进行磁分离，吸弃液体，保留磁珠；
[0021] 步骤5、向步骤4的离心管中加入250～850μl洗涤液，振荡3～7秒钟混匀，放置10～20秒钟，然后用磁力架进行磁分离，彻底吸净离心管上盖及管底的残液，室温（20～
25℃）下打开管盖干燥磁珠5～10分钟；
[0022] 步骤6、向步骤5得到的溶液中加入30～150μl洗脱液，抽吸 6～8次混匀，室温下放置10～15分钟或57℃温育7～10分钟，然后进行磁分离，小心吸取上清液转移至新的离心管，即得细菌质粒DNA备用。
[0023] 上述的步骤4中，在室温下放置过程中每隔2～3分钟将离心管颠倒数次，以混匀溶液。
[0024] 上述的步骤6中，在室温下放置或57℃温育过程中每隔2～3分钟轻摇离心管3～4下，以混匀溶液。
[0025] 上述的提取步骤中，重悬液和洗脱液储存于2～8℃，其它试剂储存于室温。
[0026] 使用所述的试剂盒提取细菌质粒DNA时，需提前1小时将试剂盒放置室内，让其恢复到室温。检查裂解液是否有沉淀，如果有沉淀可37℃温浴15～25分钟重新溶解，轻轻摇晃使其混合均匀，取用后立即盖好盖子。
[0027] 质粒DNA的得率与多个因素有关，如细胞的质粒拷贝数、寄主细胞系和培养基的类型等。采用本发明的试剂盒及其提取方法，从1ml细胞培养物中可以得到1～3ug的质粒DNA。
[0028] 由于采用如上所述的技术方案，本发明具有如下优越性：
[0029] 该磁珠法提取细菌质粒DNA的试剂盒，其提取的质粒DNA纯度高，片段完整，对于低拷贝质粒，纯化能力强大，价格低廉，经济实用；该磁珠法提取细菌质粒DNA的提取方法不使用有毒试剂，除菌液常规处理外，磁珠法提取无需离心，也不需要真空抽滤、柱分离等，除可以手工提取操作外，还特别适宜于仪器自动化操作，质粒DNA的纯度为1.8±0.1，而且提取时间短，环保无污染。
附图说明
[0030] 图1是本发明的试剂盒提取的质粒DNA的琼脂糖电泳图；其中1、2泳道是市售离心方法质粒DNA提取试剂盒提取的质粒DNA条带，3、4泳道为本发明的试剂盒提取的质粒DNA条带。
具体实施方式
[0031] 从图1中可以看出，本发明的试剂盒提取的质粒DNA在纯度和片段完整性方面，与普通商品化质粒DNA提取试剂盒相比不差上下。
[0032] 参照以下实施例可以对本发明作进一步详细说明；但是，以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。
[0033] 实施例一
[0034] 一种磁珠法提取细菌质粒DNA的试剂盒提取方法，其具体包括以下步骤：
[0035] 步骤1、取1.0ml培养过夜的细菌培养液，加入到1.5ml的离心管（EP）中，12000 r/min离心7分钟，弃上清，保留菌体，加入50μl重悬液，涡流振荡5秒，重悬菌体，保证重悬后没有可见的小块；
[0036] 步骤2、向重悬菌体中加入100μl 裂解液，上下颠倒离心管5 次混匀，持续2分钟，不要剧烈振动，否则会造成基因组DNA 被剪切，直到溶液变粘稠但清澈可见；
[0037] 步骤3、向步骤2得到的裂解产物中加入75μl中和液，立即上下颠倒离心管5次，至溶液出现絮状物沉淀，12000 r/min离心10分钟，形成紧密的白色沉淀，贴近溶液上表面小心吸取上清200μl，转移到另一个新的离心管中；注意不要吸入沉淀物，否则会造成基因组DNA污染；,
[0038] 步骤4、结合：向步骤3得到的溶液中加入混匀的磁珠结合液250μl，振荡5秒钟混匀，室温下放置10分钟，其中每隔3分钟将离心管颠倒3次混匀，10分钟后，将离心管放在磁力架上，进行磁分离，用较细吸头吸弃液体，保留磁珠；
[0039] 步骤5、洗涤：向步骤4的离心管中加入500μl洗涤液，振荡5秒钟混匀，放置15秒钟，然后用磁力架进行磁分离，彻底吸净离心管上盖及管底的残液，室温（20～25℃）下打开管盖干燥磁珠5分钟；
[0040] 步骤6、洗脱：向步骤5得到的溶液中加入60μl洗脱液，抽吸 6次混匀，室温下放置10分钟，每隔3分钟轻摇离心管3下混匀，然后进行磁分离，小心吸取上清液转移至新的离心管，即得细菌质粒DNA备用。
[0041] 实施例二
[0042] 一种磁珠法提取细菌质粒DNA的试剂盒提取方法，其具体包括以下步骤：
[0043] 步骤1、取1.5ml培养过夜的细菌培养液，加入到2.0ml的离心管（EP）中，13000 r/min离心10分钟，弃上清，保留菌体，加入65μl重悬液，涡流振荡6秒，重悬菌体，保证重悬后没有可见的小块；
[0044] 步骤2、向重悬菌体中加入130μl 裂解液，上下颠倒离心管5 次混匀，持续3分钟，不要剧烈振动，否则会造成基因组DNA 被剪切，直到溶液变粘稠但清澈可见；
[0045] 步骤3、向步骤2得到的裂解产物中加入100μl中和液，立即上下颠倒离心管5次，至溶液出现絮状物沉淀，13000 r/min离心10分钟，形成紧密的白色沉淀，贴近溶液上表面小心吸取上清230μl，转移到另一个新的离心管中；注意不要吸入沉淀物，否则会造成基因组DNA污染；,
[0046] 步骤4、结合：向步骤3得到的溶液中加入混匀的磁珠结合液260μl，振荡5秒钟混匀，室温下放置10分钟，其中每隔3分钟将离心管颠倒3次混匀，10分钟后，将离心管放在磁力架上，进行磁分离，用较细吸头吸弃液体，保留磁珠；
[0047] 步骤5、洗涤：向步骤4的离心管中加入700μl洗涤液，振荡5秒钟混匀，放置10秒钟，然后用磁力架进行磁分离，彻底吸净离心管上盖及管底的残液，室温（20～25℃）下打开管盖干燥磁珠10分钟；
[0048] 步骤6、洗脱：向步骤5得到的溶液中加入100μl洗脱液，抽吸 6次混匀，57℃温育10分钟，每隔3分钟轻摇离心管3下混匀，然后进行磁分离，小心吸取上清液转移至新的离心管，即得细菌质粒DNA备用。
