一种中药复方有效药味的筛选方法

摘要

一种中药复方有效药味的筛选方法，以本院制剂愈肾颗粒为例，根据中医病机，拆成小复方三组，第一组黄芪400g、丹参200g、白花蛇舌草320g；第二组黄芪400g、紫草320g、益母草320g；第三组黄芪400g、白茅根320g和小蓟320g组成；药味三组每组三味中药材。应用血清药理学方法分别制备药理血清，模拟药物在人体内代谢过程，此过程可应用与任何合理药物剂量及中药复方制剂的药味筛选。做相应体外肾小球系膜细胞培养实验，检测干预后的药理血清对靶器官和靶细胞的影响，通过对细胞因子及相关酶类的基因、蛋白的测定结果、对组方进行验证，筛选出有效药味。

权利要求

1.一种中药复方有效药味的筛选方法，其特征在于包括下述步骤：①、根据中医病机、组方原则拆方重组为小复方，三组每组三味中药材、药对三组每组三味中药材；

药原组方为：黄芪400g、生地黄320g、牡丹皮240g、丹参240g、紫草320g、白茅根320g、小蓟320g、益母草320g、芡实320g、太子参160g、甘草240g、鸡冠花160g和白花蛇舌草

320g；按益气化瘀解毒、益气化瘀和益气解毒细化拆出第一复方、第二复方和第三复方；

所述第一复方为益气化瘀解毒组方，由中药材黄芪400g、丹参240g和白花蛇舌草320g组成；

所述第二复方为益气化瘀组方，是由中药材黄芪400g、紫草320g和益母草320g组成；

所述第三复方为益气解毒组方，是由中药材黄芪400g、白茅根320g和小蓟320g组成；

②、应用血清药理学方法，分别制备第一复方、第二复方和第三复方药理血清和原处方正常组药物血清，并按照实验方案灌胃，采血，通过此方法来模拟药物在人体内代谢过程；

其中第一复方、第二复方和第三复方中药的制备方法为：

将第一复方、第二复方和第三复方的上述中药材分别放入容器内，用冷水浸泡30分钟，然后分别煎煮三次，煎煮方法为：先武火煮沸后文火保持微沸状态30分钟，将药液滤出，重新加水煎煮，沸后文火保持20分钟，过滤，合并滤液，浓缩至所需浓度，即得；第一复方为300%、第二复方为270%、第三复方为315%；

③、做相应体外肾小球系膜细胞培养实验，用血管紧张素Ⅱ造肾小球系膜细胞增殖模型后，用药理血清干预，直接针对靶细胞，通过此方法来减少实验过程中对药物的干预因素；

④、应用ELISA法检测体外培养的肾小球系膜细胞中模型组纤维连接蛋白FN、Ⅳ型胶原的含量，以判断造模是否成功；

⑤、检测干预后药理血清对靶器官、靶细胞的影响，分别从基因含量RT-PCR、蛋白表达western-blot、细胞增殖情况MTT或流式细胞仪角度分析筛选有效药味；

⑥、通过对细胞因子及相关酶类MMP3、MMP2、TIMP1、TIMP2的基因、蛋白的检测结果，对组方进行验证，筛选出有确切疗效的药味。

说明书

一种中药复方有效药味的筛选方法

技术领域

[0001] 本发明涉及天然药物领域，具体涉及中药有效药味的筛选方法，具体过程是通过对已知具有防治肾小球硬化作用的中药复方－愈肾颗粒的拆方重组，从血清药理学、现代分子生物学、细胞生物学角度，从基因蛋白水平研究其对肾小球细胞相关细胞因子表达的影响，最终筛选出具有延缓和防治肾小球硬化进程的有效药味及其有效组分。

背景技术

[0002] 近年来，中药复方或中成药的有效成分越来越受广大研究者的重视，中药的有效药味及成分是药学研究的根本，但中药复方或大或小，若确证中药复方中的有效药味过程复杂、成分不易控制，对于中药复方有效药味的筛选，目前尚无公认的方法。一般是将中药粗制剂直接进行总体分离，这样的方式实验周期较短，但不足之处在于：中药成分复杂，尤其是粗制剂中含有较多杂质，如直接加入体外反应体系，其酸碱度、渗透压、无机盐等非特异性因素将干扰实验，不利于进一步明确其作用机理，亦难以确定药物真正疗效。

发明内容

[0003] 本发明的目的，是提供一种中药复方有效药味的筛选方法，该方法是以药效学为导向，以中医理论为基础，体内和体外实验相结合，一方面其实验结果与体内实验结果有较好的一致性，排除一些特异性因素的影响，从而大大提高了中药药效实验的可信度。另一方面，此方法便于观察和追踪药物的吸收和代谢过程，可较为清楚的认识复方药物中中药有效药味及活性部位，为药物的进一步开发提供依据，为探讨中药复方作用规律提供思路。

[0004] 采用的技术方案是：

[0005] 一种中药复方有效药味的筛选方法，包括下述步骤：

[0006] 一、以中医病机、组方原则及功效作为处方优化的依据，针对病机以功效为路径进行拆方，以功效为益气化瘀、凉血解毒的复方制剂——愈肾颗粒（为院内制剂，该复方中药已授予专利权）为例：

[0007] 1、该药原组方为：黄芪400g、生地黄320g、牡丹皮240g、丹参240g、紫草320g、白茅根320g、小蓟320g、益母草320g、芡实320g、太子参160g、甘草240g、鸡冠花160g和白花蛇舌草320g；按益气化瘀解毒、益气化瘀和益气解毒细化拆出第一复方、第二复方和第三复方；

[0008] 所述第一复方，即益气化瘀解毒组方，由中药材黄芪400g、丹参240g和白花蛇舌草320g组成。

[0009] 所述第二复方，即益气化瘀组方，是由中药材黄芪400g、紫草320g和益母草320g组成。

[0010] 所述第三复方，即益气解毒组方，是由中药材黄芪400g、白茅根320g和小蓟320g组成。

[0011] 2、应用血清药理学方法，分别制备第一复方、第二复方和第三复方药理血清和正常组（即原处方）药物血清，并按照实验方案灌胃，采血，具体办法为：

[0012] （1）、第一复方、第二复方和第三复方中药的制备：

[0013] 将第一复方、第二复方和第三复方的上述中药材分别放入容器内，用冷水浸泡30分钟，然后分别煎煮三次，煎煮方法为：先武火煮沸后文火保持微沸状态30分钟，将药液滤出，重新加水煎煮，沸后文火保持20分钟，过滤，合并滤液，浓缩至所需浓度，即得。第一复方为300%、第二复方为270%、第三复方为315%。

[0014] （2）、正常大鼠血清的制备：每日正常饮食，第三日腹主动脉取血，离心取血清（1500rpm离心5分钟），56℃水浴30min灭火补体后，0.22μm无菌滤器过滤，分装-20℃冻存备用。

[0015] （3）、药物血清的制备：三组小复方分高中低三个剂量组，以临床用药量为低剂量组（13g∕kg∕d），中剂量组（39g∕kg∕d），高剂量组（117g∕kg∕d），按照2ml/100g/天的给药剂量灌胃，一天两次连续三天，第三日灌胃后2小时后腹主动脉取血，离心取血清（1500rpm离心5分钟），56℃水浴30min灭火补体后，0.22μm无菌滤器过滤，分装-20℃冻存备用。

[0016] 3、做相应体外肾小球系膜细胞培养实验，用血管紧张素Ⅱ造肾小球系膜细胞增殖模型后，分别用小复方各组药理血清干预。

[0017] 具体方法为：

[0018] （1）、将大鼠肾小球系膜细胞（MC）放在倒置显微镜下观察其形态：细胞生长状况良好，细胞呈梭型，中央有一清晰的卵圆形核，紧贴于培养瓶壁上，大部分细胞己经融合。

[0019] 换液时将培养瓶中原有的培养液吸弃其总量的1/2-2/3，加入新的培养液（10%FBS DMEM），所加入的液体覆盖培养瓶底即可，旋紧瓶盖后松半扣，然后放于37℃、5%CO2孵箱中进行培养，约2-3天换液一次。

[0020] 传代时吸弃原代培养瓶内的培养基，加5mlPBS洗涤细胞，重复一次，加入胰蛋白酶-EDTA混合液，37℃温育约3-5分钟，镜检发现细胞突起回缩，细胞间隙增大，或轻轻振动后绝大部分细胞悬浮、漂移，立即注入10%FBS-DEME中和胰酶并吹打细胞，使之脱离瓶壁形成悬液。

[0021] 按细胞计数结果，稀释后分装到几个培养瓶继续培养。约4-6天传代一次。

[0022] 每天常规在倒置显微镜下观察细胞的形态，并注意观察细胞融合程度，死细胞的量，待细胞融合达到90%-100%就可以进行传代。

[0023] （2）、血管紧张素Ⅱ造模：先将0.5mg的AngⅡ溶入50μl的DMEM培养液中，待完-6全溶解后，再加入DMEM500ml（此时浓度为10 mol/L），摇匀后，使用在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于4℃保存以备使用。

[0024] 应用ELISA法检测体外培养的肾小球系膜细胞中模型组纤维连接蛋白（FN）、Ⅳ型胶原的含量，采用双抗体夹心法对10%FBS组和AngⅡ组的细胞上清进行测定，取培养液100 ul，按血清FN、IV酶联免疫测定试剂盒操作说明书操作，于酶标仪测定OD值。各测定孔OD值减空白对照组OD值，为测试实际OD值。经检测表示造模成功。

[0025] 选择对肾小球系膜细胞基质金属蛋白酶 (matrix metallo proteinases, MMPS)MMP3及基质金属蛋白酶抑制物（tissue inhibitor of metallo proteinases, TIMPS）TIMP1 mRNA表达的影响为药理评价指标，研究三组小复方的主要药理效应。

[0026] 具体方法：RT-PCR法检测MMP3及TIMP1的mRNA表达

[0027] 1.1系膜细胞总RNA提取

[0028] 匀浆：取系膜细胞1x107加1mlTRIZOL制成匀浆，超声破碎10次。

[0029] 相分离：样品室温放置10分，使核蛋白化合物完全分解，加200ul氯仿，剧烈震荡15秒，室温放置2-3分，4℃12000rpm离心15分，样品混合物分离成两相，下层氯仿相，上层无色水相。

[0030] RNA沉淀：取上清加500ul异丙醇，摇匀，室温放置10分沉淀RNA，4℃1200Orpm离心10分。

[0031] RNA清洗：弃上清后加75%乙醇洗一次，75O0rpm离心5分。

[0032] 重新溶解RNA：弃乙醇，干燥10分，加25ulDEPC水溶解RNA沉淀。用蛋白核酸分析仪测定0D260和OD280，计算总RNA纯度。

[0033] 1.2.逆转录一多聚酶链反应(RT-PCR)

[0034] 1.2.1逆转录(RT):

[0035] 取2.5ul总RNA作为cDNA合成的模板，顺序加入2x逆转录缓冲液5ul，2+
25mMMg 2ul,dNTPO.5ul,Radom9 0.5ul,Bca1st poly 0.5ul，Rnase Inhibitar 0.25ul，总反应体积10ul。

[0036] 反转录条件:65℃1min、30℃5min、15-30min内匀速升温至65℃、65℃15-30min、98℃5min、5℃5min，终止反应。

[0037] 1.2.2多聚酶链反应(PCR):

[0038] 采用30ul体系，3ul逆转录产物，加入5xPCR缓冲液6ul，上、下引物各2ul，2+
dNTP2.4ul，TaqDNA酶2.4ul，Mg 2.4ul，加DEPC水终体积30ul混匀。

[0039] 扩增参数:94℃ 3min预变性，94℃ 30sec、56℃ 30sec、72℃ l min，30个循环后72℃延伸5min。

[0040] 1.2.3产物鉴定:

[0041] 均取10ul的PCR产物及DNAMarkerDL2000标准比较物，置1.5%琼脂糖凝胶电泳，以5v/cm电压电泳60min。以天能凝胶分析系统拍摄、定性定量分析。

[0042] f、通过对细胞因子及相关酶类（MMP3、TIMP1）的基因、蛋白等的检测结果，对组方进行验证。

[0043] 结果显示： 复方1号组较复方2、3号组有显著的促进基质金属蛋白酶－3（MMP3）基因表达的作用。复方1号组通过促进基质金属蛋白酶－3（MMP3）的基因表达，从而发挥延缓和防治肾小球硬化的作用。复方2号组与复方3号组对基质金属蛋白酶－3（MMP3）的基因表达有趋势。

[0044] g、通过优化设计、系统研究和反复验证，最终建立适用于中医药复方的有效药味的处方优化技术，得到新的中药药味。为进一步确定有效成分提供技术保障。

[0045] 二、 以组方原则与功效为依据，进行药对配伍拆方研究。

[0046] 1、将功效为益气化瘀、凉血解毒的复方按照功能主治拆方进行优化，化裁为益气摄血组（黄芪、太子参）、凉血化瘀组（丹皮、丹参）、解毒化瘀（益母草、紫草）组，每组各拆分为高中低剂量组。

[0047] 2、应用血清药理学方法，分别制备各小复方组药理血清及正常组药物血清，并按照实验方案灌胃，采血。

[0048] 具体方法同前。

[0049] 3、做相应体外肾小球系膜细胞培养实验，用血管紧张素Ⅱ造肾小球系膜细胞增殖模型后，分别用小复方各组药理血清干预。

[0050] 具体方法同前

[0051] 4、应用ELISA法检测体外培养的肾小球系膜细胞中模型组纤维连接蛋白（FN）、Ⅳ型胶原的含量，采用双抗体夹心法对10%FBS组和AngⅡ组的细胞上清进行测定，取培养液100 ul，按血清FN、IV酶联免疫测定试剂盒操作说明书操作，于酶标仪测定OD值。各测定孔OD值减空白对照组OD值，为测试实际OD值。经检测表示造模成功。

[0052] 5、选 择 对 肾 小 球 系 膜 细 胞 基 质 金 属 蛋 白 酶 (matrix metallo proteinases, MMPS)MMP2及基质金属蛋白酶抑制物（tissue inhibitor of metallo proteinases,TIMPS）TIMP2mRNA表达的影响为药理评价指标，研究三组小复方的主要药理效应。

[0053] 具体方法同前。

[0054] 6、通过对细胞因子及相关酶类（MMP2、TIMP2）的基因、蛋白等的检测结果，对组方进行验证，筛选出有确切疗效的药味。

[0055] 得出如下结果：益气组具有显著抑制基质金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）基因表达的作用。益气组通过抑制基质金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）的基因表达，从而发挥防治肾小球硬化的作用。凉血化瘀及解毒化瘀两组药对对基质金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）的基因表达有抑制趋势。

[0056] 7、通过优化设计、系统研究和反复验证，最终建立适用于中医药复方的有效药味的处方优化技术，得到新的中药药味。为进一步确定有效成分提供技术保障。

[0057] 三、对于拆分后的有效复方组及单味药做进一步对比研究。

[0058] 1、将前期实验效果最佳的小复方拆分为单味药进行疗效对比及优化，化裁为黄芪组、丹参组、白花蛇舌草组、小复方（黄芪、丹参、白花蛇舌草）组，每组各拆分为高中低剂量组。

[0059] 2、应用血清药理学方法，分别制备各小复方组药理血清及正常组药物血清，并按照实验方案灌胃，采血。

[0060] 具体方法同前。

[0061] 3、做相应体外肾小球系膜细胞培养实验，用血管紧张素Ⅱ造肾小球系膜细胞增殖模型后，分别用小复方各组药理血清干预。

[0062] 具体方法同前

[0063] 4、应用ELISA法检测体外培养的肾小球系膜细胞中模型组纤维连接蛋白（FN）、Ⅳ型胶原的含量，采用双抗体夹心法对10%FBS组和AngⅡ组的细胞上清进行测定，取培养液100 ul，按血清FN、IV酶联免疫测定试剂盒操作说明书操作，于酶标仪测定OD值。各测定孔OD值减空白对照组OD值，为测试实际OD值。经检测表示造模成功。

[0064] 5、选择对肾小球系膜细胞基质金属蛋白酶 (matrix metallo proteinases, MMPS)MMP3及基质金属蛋白酶抑制物（tissue inhibitor of metallo proteinases, TIMPS）TIMP1 mRNA表达的影响为药理评价指标，研究黄芪组、丹参组、白花蛇舌草组、小复