华支睾吸虫检测用引物组及检测方法

摘要

本发明公开了华支睾吸虫检测用引物组及检测方法，属于寄生虫分子检测技术领域。所述华支睾吸虫检测用引物组为SEQIDNO:1~6，所述检测方法是采用上述引物，通过环介导等温扩增反应对待检样品进行扩增，检测扩增产物，可以通过加入荧光显色剂后在自然光下用肉眼观察或者是用电泳方法检测是否有阳性梯度条带来确定样品中是否有华支睾吸虫。本发明的检测引物灵敏度高、特异性好，检测方法准确性高，操作简单，具有广泛的应用前景。

权利要求

1.一种华支睾吸虫检测用引物组，其特征在于，所述引物组如下：正向外侧引物 F3: SEQ ID NO:1； 反向外侧引物 B3: SEQ ID NO:2； 反向内侧引物 BIP: SEQ ID NO:3；

正向内侧引物 FIP: SEQ ID NO:4；

反向促环形成引物 Loop B: SEQ ID NO:5；

正向促环形成引物 Loop F: SEQ ID NO:6。

说明书

华支睾吸虫检测用引物组及检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于寄生虫分子检测技术领域，涉及一种华支睾吸虫的检测用引物及检测方法。

背景技术

[0002] 由华支睾吸虫感染引起的华支睾吸虫病（也称肝吸虫病）主要分布在朝鲜、韩国、越南北部、俄罗斯的少部分地区和中国的大部分地区。在中国，华支睾吸虫病主要流行于广东、广西、黑龙江、吉林和辽宁等省，共有27个省、市和自治区有本病流行或病例报告，广东、广西、吉林、黑龙江和辽宁尤为严重（方悦怡等，2008；魏德祥等，1980；武忠弼等，1995；赵慰先，1994；Chen et al.,1984;Chen et al.,1991a;Chen et al.1991b;Kam et al.,1994;Woo et al., 1998; Ko, 1991）。

[0003] 华支睾吸虫的生活史十分复杂，涉及数个中间宿主。第一中间宿主：根据报道有3 个科的淡水螺可以作为华支睾吸虫第一中间宿主，它们分别是豆螺科（Bithyniidae）, 黑螺科（Melaniidae）和拟沼螺科（Assimineidae）(刘宜升和陈明, 1998)，其中又以豆螺科里的纹沼螺（Parafassarulus striatulus），赤豆螺（Bithynia fuchsianus），长角涵螺（Alocinmalongicornis）为华支睾吸虫最常见的第一中间宿主(赵慰先，1994；Lun et al.,2005)。第二中间宿主：华支睾吸虫的第二中间宿主十分广泛，包含有近130 多种淡水鱼类（涉及近16个科），其中鲤科鱼类为主要中间宿主。淡水虾类也被证实能传播华支睾吸虫 (Komiya，1966; Rim，1986；Joo, 1988; 刘宜升和陈明，1998)。终宿主：除人以外，其他吃鱼的哺乳动物都有可能成为其终宿主，如狗、猫、猪、水貂、鼬、黄鼠狼和麝猫等，有些还可做为保虫宿主。在实验条件下，兔子、豚鼠和仓鼠都易感华支睾吸虫 (Lun et al., 2005)。在中国，狗和猫被认为是流行区最重要的动物宿主(Lun et al., 2005)。与许多其他国家不同，中国农村的猫狗不是作为宠物饲养，而是半自由养殖，所以经常有机会生吃到主人丢掉的带有囊蚴的鱼内脏及其他不宜食用的部位如鳃和鳍等而感染华支睾吸虫(赵慰先,1994; 蒋成玉,2001)。

[0004] 华支睾吸虫成虫主要寄生于人或其他哺乳动物肝内二级以上分支的胆管内，且偏爱左肝胆管（刘晓明等，1995；姚福宝等，1986）。严重感染者其胆囊、总胆管甚至胰管内也有成虫寄生（Evans et al.,1971;陈约翰，1963）。成虫的机械性损伤和分泌排泄物被认为是致病的主要因素。已有确切证据证明与华支睾吸虫感染有关的疾病包括有胆管炎、胆囊炎、胆石症、肝硬化、胆管癌、儿童生长发育障碍、消化性溃疡、胰腺炎和糖尿病等（Attwood et al.,1978;Choi et al.,2006;Lee et al.,2008;Lim et al.,2006;Shin et at.,1996）。

[0005] 目前用于检测华支睾吸虫感染的主要方法是病原生物学检查方法，即在终末宿主粪便中检查虫卵、鱼体消化直接检查囊蚴、显微镜下解剖螺体鉴定雷蚴等。虽然这些方法也被广泛应用于临床诊断和流行病学调查，但同时也暴露出不少问题。粪检的问题是华支睾吸虫虫卵甚小，感染度轻时数量较少，而且排卵具有周期性，因此，粪检法易漏检，且常需重复多次。鱼和螺的病原生物学检查方法不但需要具有丰富寄生虫分类学知识的专业人员操作，且需要特定的仪器和设备，费时、费力、 繁琐、检出率不高，不适宜用于大规模的流行病学普查，所以在综合防治中的作用受到了很大限制。临床上鉴定人体感染华支睾吸虫的方法除了病原生物学方法外，还有免疫学检测方法，如皮内试验、间接血凝试验（IHA）、间接荧光抗体试验（IFAT）、对流免疫电泳试验（IGSS）、CIE 和酶联免疫吸附试验（ELISA）等。此外有些物理诊断工具如B超、CT、核磁共振等也可作为辅助检测工具（阮廷清等，2006;刘宜升和陈明，1998）。目前虽然有一些免疫学检测方法已应用于人体华支睾吸虫病的免疫检测，但在检测结果上存在着较高比例的假阳性、假阴性和交叉反应；而物理检测工具也存在着设备昂贵、要求操作人员专业水平高等缺点，同时对检测结果没有统一的鉴定标准，难以把握，无法广泛使用（刘宜升和陈明，1998）。理论上，控制华支睾吸虫的流行或避免感染华支睾吸虫最有效的方法是不要吃生鱼，也避免生吃有可能被华支睾吸虫囊蚴污染的食物。但人们的传统习惯很难一时予以戒除，因此，利用分子生物学技术从水产养殖区大规模检测华支睾吸虫中间宿主，特别是第一中间宿主螺类是否感染华支睾吸虫，检测结果可以通过政府有关部门对该地区的水产品发出警告，提醒人们不要生吃该地区的水产品从而达到控制该并流行的目的。

[0006] 2000 年，Notomi 报道了一种新的核酸扩增技术，即环介导等温核酸扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA，LAMP）（Notomi et al., 2000）。这种新的核酸扩增技术特异性甚高且快速高效。该技术的关键是需要能识别靶序列上8 个特定区域的6 个特异引物，和一种具有链置换特性的DNA 聚合酶，即Bst DNA 聚合酶。反应恒定温度为60～65℃，时间仅需要0.15-75min。LAMP技术相比PCR具有以下优点：灵敏度高；特异性强；快速高效，在1 h左右即可完成，若在靶序列上进一步设计两条促环形成引物, 扩增时间将在原来的基础上减少1/3～1/2；设备简单，在恒温金属浴锅或水浴锅中即可完成；产物检测方便，可肉眼直接观察焦磷酸镁沉淀或荧光显色剂SYBR GreenⅠ显色来判定结果。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于针对现有技术中华支睾吸虫检测方法繁琐、灵敏度不高、检测时间长等缺陷，提供一种华支睾吸虫的检测引物组。

[0008] 本发明的另一目的是提供一种华支睾吸虫的检测方法。

[0009] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：

[0010] 针对现已获得的华支睾吸虫序列：半胱氨酸蛋白酶1mRNA序列(GenBank登录号AY273802)，使用Primer Explored V4J分别设计特异引物对。同时将华支睾吸虫序列与相应麝猫后睾吸虫（Opisthorchis viverrini）序列进行比对，提高引物的特异性，获得1组引物对，所述的引物对的核苷酸序列如下所示：

[0011] 正向外侧引物 F3: SEQ ID NO:1；

[0012] 反向外侧引物 B3: SEQ ID NO:2；

[0013] 反向内侧引物 BIP: SEQ ID NO:3；

[0014] 正向内侧引物 FIP: SEQ ID NO:4；

[0015] 反向促环形成引物对 Loop B: SEQ ID NO:5；

[0016] 正向促环形成引物对 Loop F: SEQ ID NO:6。

[0017] 一种华支睾吸虫的检测方法，是基于环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，采用上述引物组序列，通过LAMP方法检测样品DNA的扩增产物中是否有华支睾吸虫的靶序列（即前述半胱氨酸蛋白酶1mRNA序列），有则说明检测结果呈阳性，没有则说明检测结果呈阴性。

[0018] LAMP的反应体系中引物、dNTP和Betaine等组分的浓度会直接影响LAMP反应的扩增效率和检测特异性，经过实验优化后，最终确定体系如下：

[0019] 2倍稀释的LAMP反应混合液12.5 μl，引物F3和引物B3各0.2 μM，引物FIP 和引物BIP各1.6 μM，引物Loop F和引物Loop B各0.8 μM，Bst DNA聚合酶8U，待检样品DNA模板1 μL，灭菌双蒸水补齐至25 μL；

[0020] 所述LAMP反应混合液（Reaction Mix)由浓度分别为25μM的dNTP（即dTTP、dATP、dCTP和dGTP）与LAMP反应缓冲液按1：9的体积比混合而成；

[0021] 所述LAMP反应缓冲液（Reaction Buffer）每90ml含有以下溶质：pH值为8.8、1M的Tris-HCL 4 ml，0.15 g KCl，0.19 g MgSO4，0.26 g (NH4)2SO4，0.2 ml Tween 20，18.7 g Betaine（甜菜碱）。

[0022] 在LAMP反应过程中，扩增温度过高或过低都不利于LAMP反应获得最佳效果，经过发明人实验筛选，采用上述引物组和反应体系时，其扩增温度最佳为60℃，扩增时间最佳为60 min。

[0023] LAMP反应结束后，即可根据扩增产物判断待检测样品是否感染了华支睾吸虫，具体方法如下：

[0024] 在反应体系中加入1000倍稀释的荧光显色剂SYBR GreenⅠ1-2 μl，在自然光下用肉眼观察，若扩增产物变为黄绿色则为华支睾吸虫阳性，若扩增产物为棕色则为华支睾吸虫阴性；

[0025] 或者将LAMP反应产物加入至含有0.5 μg/mL 溴化乙锭染料的2%的琼脂糖凝胶中，180-200 v电泳1 h，在凝胶成相系统上成像观察结果，扩增产物由不同大小的区带组成阶梯式图谱的样品为华支睾吸虫阳性。

[0026] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0027] 1．检出率高：直接提取待检样品总DNA，提高了华支睾吸虫的检出率；

[0028] 2．灵敏度高：LAMP检测方法灵敏度高，利用琼脂糖凝胶电泳检测LAMP对华支睾吸虫基因组DNA的灵敏度可达10 fg/μl，与传统PCR相比，LAMP检测的灵敏度高3个数量级。

[0029] 3．特异性强：3对引物对靶序列的8个特异序列区的识别，保证了LAMP 扩增的高度特异性；

[0030] 4．准确性高：Bst DNA 聚合酶与传统PCR 的Taq 酶不同，不易受其它大分子有机物影响，另外LAMP反应体系中添加了牛血清白蛋白（BSA），从而降低了螺类样品中PCR抑制因子对LAMP反应的干扰，提高了检测的准确率。

[0031] 5．设备简单：不需要昂贵的PCR仪，在恒温水浴锅或金属浴锅中即可完成；

[0032] 6．检测方便：加入荧光显色剂1000×SYBR GreenⅠ至扩增产物后用肉眼即可观察结果。

附图说明

[0033] 图1. 华支睾吸虫基因组DNA电泳图，其中M为DL2000 marker，1为华支睾吸虫基因组DNA，2为双蒸水。

[0034] 图2. DNA扩增产物加入荧光显色剂SYBR GreenⅠ后照片。P管为华支睾吸虫阳性结果，溶液为黄绿色，N管为华支睾吸虫阴性结果，溶液为棕色。

[0035] 图3. 不同温度下对华支睾吸虫阳性样品LAMP检测结果电泳图，其中M为DL2000 marker，1-6分别为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃， N为阴性对照。

[0036] 图4. 不同时间下对华支睾吸虫阳性样品LAMP检测结果电泳图，其中M为DL2000 marker，1-5分别为反应时间15 min、30 min、45 min、60 min、75 min， N为阴性对照。

[0037] 图5. 不同种类的待测样品LAMP检测结果电泳图，其中M为DL2000 marker，P为华支睾吸虫阳性对照，F为草鱼，N为阴性对照。

[0038] 图6. 对其他寄生虫的种间特异性LAMP检测结果电泳图，其中M为DL2000 marker，1为华支睾吸虫，2为大片吸虫，3为肝片吸虫，4为血吸虫。

[0039] 图7. 对华支睾吸虫种间宿主LAMP检测方法敏感性检测结果电泳图，其中M为DL2000 marker，1-8分别为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl，N为阴性对照。

具体实施方式

[0040] 实施例1 检测中间宿主中华支睾吸虫

[0041] 1. 待检华支睾吸虫中间宿主样品的处理：

[0042] 在广东省清远市阳山县及佛山市三水区采集鱼类样本31份、虾类样本42份及螺类样本91份。将所采集的螺类样品清水浸泡24小时后去除外壳，虾类样品直接去除外壳。

[0043] 2. 待检华支睾吸虫中间宿主样品中DNA的提取：

[0044] （1）将处理过的的待测样品加入200 μl蛋白酶K裂解液，于55℃水浴锅消化4~8 h；

[0045] （2）将步骤（1）的样品取出，加入酚：氯仿：异戊醇体积比为25：24：1的混合液，室温下震荡混匀成乳状液后静置2~5 min；

[0046] （3）将步骤（2）的混合液离心，转移上层水相到新的离心管中；

[0047] （4）向步骤（3）的水相中加入等体积的异丙醇沉淀DNA，离心后弃上清；

[0048] （5）将步骤（4）收集到的沉淀，用100 μl的70体积%乙醇洗涤，再高速离心（8000 rpm），弃上清，自然晾干DNA样品；

[0049] （6）用50 μl TE溶解DNA样品。

[0050] 蛋白酶K裂解液的组分及配比：先配置SNET缓冲液：pH为8.0的20 mmol/L Tris，5 mmol/L 的EDTA，400 mmol/L的 NaCl，1%十二烷基硫酸钠。再用SNET缓冲液溶解蛋白酶K，使其最终工作浓度为400μg/ml。

[0051] 3. 环介导的等温扩增：

[0052] （1）建立环介导的等温扩增反应体系

[0053] 选择前述第3组引物进行环介导等温扩增反应。

[0054] LAMP反应缓冲液（Reaction Buffer）：每90ml的LAMP反应缓冲液中含以下溶质：4 ml的 1M Tris-HCL(pH8.8)，0.15 g KCl，0.19 g MgSO4，0.26 g (NH4)2SO4，0.2 ml Tween
20，18.7 g Betaine。Reaction Mix(2×)由浓度为25 μM/每种的dNTP和Reaction Buffer按1:9的体积比混合而成。25 μl的LAMP反应体系包括12.5 μl的Reaction Mix(2×)，0.3 μmol/L的引物F3和引物B3，1.6 μmol/L的引物FIP 和引物BIP，0.8 μmol/L的引物Loop F和引物Loop B，8U的BstDNA聚合酶，1 μL DNA模板，灭菌双蒸水补齐至25 μL，其中阳性对照为华支睾吸虫基因组DNA，阴性对照为灭菌双蒸水；另外，检测螺类样本时在反应体系中加入终浓度为0.048%的BSA。

[0055] （2）环介导的等温扩增条件：60 ℃金属恒温浴反应60 min。

[0056] 4. 扩增产物分析：

[0057] 琼脂糖凝胶电泳：取5 μl的环介导等温扩增的最终反应产物，加入至含有0.5 μg/mL 溴化乙锭（EB）染料的2%的琼脂糖凝胶中，于180~200 V电压下电泳60 min，在凝胶成相系统上成像观察结果。扩增产物由不同大小的区带组成的阶梯式图谱的样品为华支睾吸虫阳性。结果如图1。

[0058] 显色反应：加入1-2 μl的荧光显色剂1000×SYBR GreenⅠ至25 μl的环介导等温扩增的最终产物，在自然光下用肉眼观察结果。若扩增产物变为黄绿色则为华支睾吸虫阳性，若扩增产物为棕色则为华支睾吸虫阴性。结果如图2。

[0059] 实施例2 华支睾吸虫LAMP检测体系温度的确定

[0060] 用华支睾吸虫阳性的样品总DNA为模板，来确定华支睾吸虫中间宿主LAMP检测体系温度，方法如下：

[0061] 1、按照实施例1的方法提取华支睾吸虫中间宿主总DNA。

[0062] 2、按照实施例1的方法进行LAMP检测，保留华支睾吸虫阳性的中间宿主样品总DNA，作为华支睾吸虫中间宿主LAMP检测体系温度确定的模板。

[0063] 3、LAMP检测体系温度的确定：

[0064] （1）建立环介导的等温扩增反应体系

[0065] LAMP反应缓冲液（Reaction Buffer）:每90ml的LAMP反应缓冲液中含以下溶质：4 ml的 1M Tris-HCL(pH8.8)，0.15 g KCl，0.19 g MgSO4，0.26 g (NH4)2SO4，0.2 ml Tween
20，18.7 g Betaine。Reaction Mix(2×)由浓度为25μM/每种的dNTP和Reaction Buffer按1:9的体积比混合而成。25μl的LAMP反应体系包括12.5 μl的Reaction Mix(2×),0.3 μmol/L的引物F3和引物B3，1.6 μmol/L的引物FIP 和引物BIP，0.8 μmol/L的引物Loop F和引物Loop B, 8 U的BstDNA聚合酶，1 μL DNA模板，灭菌双蒸水补齐至25μl, 其中阳性对照为华支睾吸虫基因组DNA，阴性对照为灭菌双蒸水；

[0066] （2）环介导的等温扩增条件：反应温度分别选择为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，进行金属恒温浴反应60min；

[0067] 结果分析：取5μl的环介导等温扩增的最终反应产物，加入至含有0.5 μg/mL 溴化乙锭（EB）染料的2%的琼脂糖凝胶中，于180-200 V电压下电泳60 min，在凝胶成相系统上成像观察结果，60℃-65℃均可以扩增出目的条带且条带亮度没有变化，考虑到节约能源的问题，故选择60℃为反应温度，如图3。

[0068] 实施例3：华支睾吸虫中间宿主LAMP检测体系时间的确定

[0069] 用华支睾吸虫阳性的样品总DNA为模板，来确定华支睾吸虫中间宿主LAMP检测体系时间，方法如下：

[0070] 1、按照实施例1的方法提取华支睾吸虫中间宿主总DNA。

[0071] 2、按照实施例1的方法进行LAMP检测，保留华支睾吸虫阳性的中间宿主样品总DNA，作为华支睾吸虫中间宿主LAMP检测体系时间确定的模板。

[0072] 3、LAMP检测体系时间的确定：

[0073] 1）建立环介导的等温扩增反应体系

[0074] LAMP反应缓冲液（Reaction Buffer）:每90ml的LAMP反应缓冲液中含以下溶质：4 ml的 1M Tris-HCL(pH8.8)，0.15 g KCl，0.19 g MgSO4，0.26 g (NH4)2SO4，0.2 ml Tween 20，18.7 g Betaine。Reaction Mix(2×)由浓度为25μM/每种的dNTP和Reaction Buffer按1:9的体积比混合而成。25 μl的LAMP反应体系包括12.5 μl的Reaction Mix(2×),0.3 μmol/L的引物F3和引物B3，1.6 μmol/L的引物FIP 和引物BIP，0.8 μmol/L的引物Loop F和引物Loop B, 8 U的BstDNA聚合酶，1 μl DNA模板，灭菌双蒸水补齐至25 μl, 其中阳性对照为华支睾吸虫基因组DNA，阴性对照为灭菌双蒸水；

[0075] 2）环介导的等温扩增条件： 60℃进行金属恒温浴反应，时间选择分别为15 min、30 min、45 min、60 min、75 min；

[0076] 结果分析：取5 μl的环介导等温扩增的最终反应产物，加入至含有0.5μg/mL 溴化乙锭（EB）染料的2%的琼脂糖凝胶中，于180-200 V电压下电泳60 min，在凝胶成相系统上成像观察结果，60 min反应时间观察到的电泳条带最亮，故选择60 min为反应时间，如图4。

[0077] 实施例4：华支睾吸虫中间宿主LAMP检测方法特异性实验

[0078] 1、与宿主的种间特异性

[0079] 市场上购得草鱼，直接压片法及消化取囊蚴法确定没有华支睾吸虫感染，按照实施例1的方法提取基因组DNA，并按照实施例1的方法进行LAMP扩增。按照实施例1中琼脂糖凝胶电泳方法进行扩增产物的分析，比较其与华支睾吸虫DNA的LAMP反应结果。结果如图5，表明LAMP引物对于区别宿主和华支睾吸虫具有很好的特异性。

[0080] 2、 与其他寄生虫之间的种间特异性

[0081] 以大片吸虫、肝片吸虫、血吸虫和华支睾吸虫基因组DNA按照实施例1进行LAMP反应。按照实施例1中琼脂糖凝胶电泳方法进行扩增产物的分析，结果如图6，只有华支睾吸虫作模板的反应体系出现LAMP反应特有的条带。

[0082] 实施例5：华支睾吸虫中间宿主LAMP检测方法灵敏度实验

[0083] 1、按照实施例1的方法提取华支睾吸虫中间宿主总DNA

[0084] 2、环介导的等温扩增

[0085] 按照实施例1的方法进行LAMP扩增，其中25 μl体系中加入1 μl不同浓度（100 ng/μl、10 ng/μl、1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl）的DNA。

[0086] 3、扩增产物分析

[0087] 按照实施例1中琼脂糖凝胶电泳方法进行扩增产物的分析，扩增产物由不同大小的区带组成的阶梯式图谱的样品为华支睾吸虫阳性，结果如图7。