本发明公开了基于EST-SSR标记的草鱼分类方法。方法包括提取草鱼的DNA，使用EST-SSR标记扩增，根据扩增结果分析出草鱼的遗传结构。本发明方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点。且操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。
1.基于EST-SSR标记的草鱼分类方法，包括提取草鱼的DNA，使用EST-SSR标记对作为引物进行PCR扩增；根据扩增结果对草鱼进行分类，其特征在于：所述的EST-SSR标记对为： F:AAGCCCAAAGCCACAGAA SEQ ID NO：1
1 R:GCAGTAGAAGAGTGAAAAGCATC SEQ ID NO：2 F:GCTGCTGTCACTCCTAAACTC SEQ ID NO：3
2 R:TGAAAGGTCCAAAGAAAGAAC SEQ ID NO：4
3 F:AAGTGAGACTATGCTGATAAAACCG SEQ ID NO：5 R:ATTGAAACAGATGCCTGCTTG SEQ ID NO：6 F:CTGTGATGGGTAGATTTAGGG SEQ ID NO：7
4 R:GCCTGGTGAGTTGGTATGG SEQ ID NO：8
5 F：GCTAACACTCCTTTACTATCAT SEQ ID NO：9 R:TTGAAACGCTGATTGAGA SEQ ID NO：10
6 F:GGTCTCGTCTTCGCCATCCT SEQ ID NO：11 R:CCTGCGGTTTGCGTGGTAT SEQ ID NO：12
7 F:GAGCGACTCCAGTGAGATAA SEQ ID NO：13 R:CCAGGATGAACGAACAAATA SEQ ID NO：14
8 F:TCAGCCTTATGCCTTGGT SEQ ID NO：15 R:GCCACTGAACTGGTAACG SEQ ID NO：16
9 F:TCTAATACTGTGCCTGTTCTA SEQ ID NO：17 R:CACTTACTTACTGCTTGATTGT SEQ ID NO：18
10 F:TGTCGCTCAGTCATTCTCC SEQ ID NO：19 R:GCAAGTATTGTCAACCAAGTGT SEQ ID NO：20 F:TAAGTAACGCTCCTTGAAAA SEQ ID NO：21
11 R:GAGTGTCTGTTTGCCTGTG SEQ ID NO：22 F:AAGGAACAGCATAAACCGAAAT SEQ ID NO：23
12 R:GGAACCAAGCATCTGAAACTG SEQ ID NO：24 F:AGATAAACTGGGGCGGC SEQ ID NO：25
13 R:TGGAGACAGGTCGTCAACAC SEQ ID NO：26 F:CAGAGTTCGGAGACAAAGAG SEQ ID NO：27
14 R:GAATGGTGTTTCTATGTAAGTGT SEQ ID NO：28
15 F:TAAGGAAGTGATAGGGACATT SEQ ID NO：29 R:TAGTTGCTCGTTGTGATGTG SEQ ID NO：30
16 F:TGATTGCCAAGATTGTTTCG SEQ ID NO：31 R:ATACAGGGAGGTTATTACGACA SEQ ID NO：32
17 F:ATTTCAGTAGTAACCCATCAC SEQ ID NO：33 R:ACAGGACCAATAAGGAACA SEQ ID NO：34
18 F:GCAGGACTGAGACTGAAGGA SEQ ID NO：35 R:GAGGTCTTTGCGGTTGTAT SEQ ID NO：36
19 F:AAAATCCCAGTGAGACAATC SEQ ID NO：37 R:ATCCCATAATGCCTTGC SEQ ID NO：38
2.根据权利要求1所述的基于EST-SSR标记的草鱼分类方法，其特征在于：扩增的反应体系为：
3.根据权利要求1或2所述的基于EST-SSR标记的草鱼分类方法，其特征在于：扩增的反应条件为：
基于EST-SSR标记的草鱼分类方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种鱼类的分类方法，特别涉及一种基于EST-SSR标记的草鱼分类方法。
背景技术
[0002] 草鱼(Ctenopharyngodon idella) 具有生长快、养殖成本低等优点，为池塘、湖泊和水库的主要养殖对象，是我国淡水渔业中最重要的养殖品种之一。草鱼分布在亚洲的各大江河水系，在中国从黑龙江到西江（除新疆和青藏高原无自然分布外）都有其分布，形成了草鱼复杂的遗传背景和丰富的种质资源。近年来，天然水环境的变化和污染使得自然界草鱼种群数量明显下降 ，生产中近亲繁殖导致种质退化，已影响到草鱼养殖产业的正常发展。为有效保护和利用这一淡水鱼类资源，有必要开发和利用分子遗传标记，对不同水系的草鱼群体进行遗传结构分析，搞清其遗传背景，为草鱼选育种群的选择奠定基础。目前，已有学者采用同工酶、mtDNA-RFLP、微卫星等检测技术对长江水系草鱼种群的遗传结构进行了研究，但对不同水系之间草鱼群体遗传结构的研究工作并不多。
[0003] 表达序列标签（expressed sequence tag，EST）中存在一定数量的微卫星或简单重复序列（EST-SSR），它不仅具有在基因组中均匀分布、共显性和实验重复性好等优点，而且开发成本较低，已成功应用于群体遗传结构分析、QTL定位和分子标记辅助选择育种等研究领域。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种基于EST-SSR标记的草鱼分类方法。
[0005] 本发明所采取的技术方案是：
[0006] EST-SSR标记的草鱼分类方法，包括提取草鱼的DNA，使用EST-SSR标记作为引物进行扩增；根据扩增结果对草鱼进行分类，所述的EST-SSR标记对为： 。
[0007] PCR的反应体系为：
[0008] ddH2O 14.9µL
[0009] 10×PCR Buffer 2.0µL
[0010] MgCl2（25 mmol/L） 0.8µL
[0011] 4×dNTP（10mmol/L） 0.3µL
[0012] Taq 酶（5U/µL） 0.2µL
[0013] 上、下游引物（10µmol/L） 0.4µL
[0014] 模板DNA（40ng/µL） 1.0µL。
[0015] PCR的反应条件为：
[0016] 1) 94℃预变性4min，
[0017] 2) 94℃变性30s，
[0018] 3) 退火30s，
[0019] 4) 72℃延伸45s；
[0020] 5) 循环步骤2）～4）30～40次，
[0021] 6) 72℃延伸7min。
[0022] 本发明的有益效果是：
[0023] 本发明的方法，可以准确、快速地鉴定出不同来源草鱼的遗传结构和遗传背景，为筛选和建立草鱼德育基础群体提供参考。
附图说明
[0024] 图1是根据群体间的遗传距离矩阵构建5 个群体的UPGMA聚类图。
具体实施方式
[0025] 本申请人2009年构建了草鱼脑、肌肉、肝等组织cDNA文库，去冗余处理后得到45318 条EST序列，平均序列长度为650bp，用 trf（tandem repeats finder）软件从该序列中查找到5 556 个微卫星。选取重复次数在5 次以上的双碱基重复序列和重复次数在4 次以上的三碱基或四碱基重复序列，使用引物设计软件Primer Primer5.0进行引物设计，获得EST-SSR引物118 对。
[0026] 本申请人利用获得118 对EST-SSR引物对50 尾草鱼样本进行PCR扩增，其中87对引物扩增出单一条带、12 对引物无扩增产物、19 对引物能扩增出多态性片段，多态性引物占所有设计引物的16.00%。其中双碱基重复序列15 个，占83.16%；四个碱基重复序列4 个，占16.84%。而双碱基重复中以（AC）n/（GT）n为主，占73.33%；（AT）n/（AT）n占
13.33%，（CT）n/（AG）n占13.33%。
[0027] 1 9 对 E S T - S S R 引 物 的 序 列 如 下 ：
[0028] 具体的检测方法如下：
[0029] 模板DNA的提取
[0030] 1) 取待检测鱼的鳍条组织3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液（10 mmol/L Tris-HCl；0.1 mol/L EDTA；0.5% SDS；30mg/L RNase；100mg/L 蛋白酶K，pH8.0），55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动；
[0031] 2) 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；
[0032] 3) 加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；
[0033] 4) 用70%乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE（10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0）溶解DNA，4℃贮存备用。
[0034] PCR反应体系：
[0035] ddH2O 14.9µL
[0036] 10×PCR Buffer 2.0µL
[0037] MgCl2（25 mmol/L） 0.8µL
[0038] 4×dNTP（10mmol/L） 0.3µL
[0039] Taq 酶（5U/µL） 0.2µL
[0040] 上、下游引物（10µmol/L） 0.4µL
[0041] 模板DNA（40ng/µL） 1.0µL。
[0042] PCR的反应条件：
[0043] 1) 94℃预变性4min，
[0044] 2) 94℃变性30s，
[0045] 3) 退火30s，
[0046] 4) 72℃延伸45s；
[0047] 5) 循环步骤2）～4）32次，
[0048] 6) 72℃延伸7min。
[0049] 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
[0050] （1）8%非变性聚丙烯酰胺凝胶配制（35ml）
[0051] 双蒸水H2O 22.259ml
[0052] 30﹪聚丙烯酰胺原液 9.33ml
[0053] 10×TBE 3.27ml
[0054] 20﹪AP 0.117 ml
[0055] TEMED 0.024ml。
[0056] 配制步骤：
[0057] ①玻璃板的清洗：用水沾上洗剂把玻璃板擦洗干净后，再用超纯水冲洗，晾干备用；
[0058] ②凝胶的灌制：先将固定好的玻璃架倾斜，将凝胶沿着梳子插槽边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，然后立即插上梳子，让凝胶溢出，这样可以避免产生气泡。在胶液和梳子接触面加少量单蒸水，以免空气氧化胶液表面。等待胶液凝聚时，仔细观察有无漏胶或气泡产生。一般在灌胶后4-6min即开始凝聚，室温25℃左右20min便可以聚合完全。如室温较低时，聚合时间相应延长。
[0059] （2）上样与凝胶电泳
[0060] 扩增产物与上样缓冲液按体积比3:1混匀后，用毛细管进样器吸取4µL混合物上样，在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压230V，电泳2-3h。
[0061] 硝酸银染色
[0062] （1）电泳完毕将胶取出，放于盛有单蒸水的塑料容器（面积比胶稍大）中轻轻漂洗10s，去掉蒸馏水；
[0063] （2）加入1%的AgNO3溶液，在脱色摇床上轻摇3～4 min，倒掉AgNO3溶液；用蒸馏水漂洗两次，每次不超过10s，倒掉蒸馏水；
[0064] （3）快速加入显色液（NaOH 10g，Na2CO3 0.2g，HCHO 2ml，加蒸馏水定容至500ml）50ml，振荡30s后倒去；
[0065] （4）加入500mL显色液。一般3min内，带型显现；
[0066] （5）待带型清晰时，将胶取出放于凝胶成相系统拍照，并进行条带分析。
[0067] 数据统计与分析
[0068] (1)用POPGEN32软件计算有效等位基因数（effective numbers of allele，Ne），观测杂合度（observed heterozygosity，Ho），期望杂合度（expected heterozygosity，He），相对遗传距离（genetic distance，D），遗传相似系数（genetic similarity index，S），遗传分化指数（genetic differentiation index，Fst）和Hardy-Weinberg遗传偏离平衡指数（d）。
[0069]
[0070] 式中Pi为第i个等位基因的频率， n为等位基因数目。
[0071] 平均观测杂合度（Ho）：Ho =观察到的杂合子数/观察个体总数；
[0072]
[0073] 式中Pi为第 i个等位基因的频率。
[0074] 遗传相似系数（S）：Sij =Nij / [Ni + Nj + Nij]
[0075] 式中Sij 为任意两个个体间的遗传相似系数，Nij 为i 个体和j 个体共享位点数， Ni、Nj分别为i个体和j个体各自扩增的位点总数。
[0076]
[0077] 式中Sij为两种群间的遗传相似系数，Si，Sj分别表示种群i 和种群j 的遗传相似系数。
[0078] 群本间遗传分化指数（Fst）：1－ Fst = (1－Fis ) × (1－Fit)[0079] 式中Fis、Fst、Fit分别代表群体内近交系数、群体间分化系数和总群体近交系数。
[0080] Hardy-Weinberg遗传偏离平衡指数（d）：d =Ho － He / He
[0081] (2)多态信息含量（Polymorphic information content，PIC），[0082]
[0083] 式中 Pi、Pj分别为第 i和第 j个等位基因的频率，n 为等位基因数目。
[0084] (3)用MEGA 4软件根据群体间的遗传相似性指数和遗传距离，采用非加权配对算术平均法（unweithted pair group method using arithmetic,UPGMA）构建5 个草鱼群体的系统树，以分析群体间的亲缘关系。
[0085] 本申请人在2010年5月－7月对5个不同来源草鱼群体进行了样品采集，监利群体、石首群体和长沙群体分别是长江监利江段、长江石首江段和长江湘江江段渔获的野生草鱼水花，长至性成熟；清远群体和肇庆群体来自珠江水系清远江段和肇庆江段的草鱼，属于四代繁育后代，长至性成熟，共181 尾。采样地点和数量见表1。每个样本剪取鳍条，保存于95%的乙醇中备用。
[0086]
[0087] 应用19 对微卫星引物对5 个草鱼群体共181 尾草鱼样本进行多态性检测，共获得93 个等位基因，每对引物检测到的等位基因数为2～8 个，平均为4.89 个，扩增产物片段大小为87～339 bp；其多态信息见表2。
[0088]
[0089] 本申请人利用数据统计及分析软件对181 尾草鱼样本进行遗传多样性与哈代-温伯格平衡分析，群体遗传多样性的统计分析结果见表3，5 个草鱼群体的平均等位基因数为（Na）3.526 3～4.315 8，平均有效等位基因数为（Ne）1.929 3～2.139 0，平均观测杂合度为（Ho）0.415 8～0.501 3，平均期望杂合度为（He）0.450 6～0.502 8，平均多态信息含量为（PIC）0.4154～0.4604；长沙群体平均多态信息含量和平均期望杂合度最高为0.460 4和0.502 8；监利群体的平均观察杂合度和平均期望杂合度最低为0.415 8 和0.450 6。通过计算基因型的P值检验，5 个草鱼群体Hardy-Weinberg平衡偏离常数均发生了不同程度的偏离，结果见表4，在石首群体中，16165位点发生显著偏离，4703、17329和
30977位点发生极显著偏离；在长沙群体中，23426位点发生显著偏离，23460、5476、16165、
4218、784、4996、17329和16158位点发生极显著偏离；在监利群体中，23426和17329位点发生显著偏离，4218位点发生极显著偏离；在肇庆群体中，4703、5476和23426位点发生显著偏离，23460和13118位点发生极显著偏离；在清远群体中，23426和17329位点发生显著偏离，4218位点发生极显著偏离。
[0090]
[0091]
[0092] 本申请人对不同草鱼群体间进行遗传相似系数与遗传距离分析，依据 Nei（1978）计算群体间的遗传距离和遗传相似系数，结果表明：监利群体与清远群体遗传距离最远（0.0862），遗传相似系数最小（0.9174），说明两者亲缘关系较远；而长沙群体与石首群体遗传距离最近（0.019 8），遗传相似系数最大（0.9804），说明两者亲缘关系最近。根据群体间的遗传距离矩阵构建5 个群体的UPGMA聚类图（图1）。可以看出，5 个草鱼群体聚成了两支，长沙群体、监利群体和石首群体聚成一支；肇庆群体和清远群体聚成一支。
[0093]
[0094] 注：对角线以上为遗传相似系数，对角线以下为遗传距离
[0095] 利用筛选到的19个具有丰富多态的EST--SSR标记，对不同群体的草鱼DNA样品进行PCR检测，扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺进行检测，利用生物技术和数据分析软件进行相关分析，利用本方法能将生产中来源不同的草鱼群体进行其遗传结构和遗传聚类分析，为草鱼选育基础群体的选定和草鱼良种选育奠定基础。该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点。且操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。
