纳米粒组合物

摘要

本发明描述了包含药理学活性物质的聚碳酸亚乙基酯(PEC)纳米粒、它们的制备方法以及它们在施用后用来缓释药理学活性剂的用途。

权利要求

1.非肠道药物组合物，该药物组合物包含纳米粒混悬剂，该混悬剂包含由至少一种药理学活性剂、至少一种聚(碳酸亚乙基酯)聚合物和任选可药用赋形剂组成的纳米粒。

2.权利要求1的药物组合物，其是纳米粒混悬剂的形式。

3.权利要求1的药物组合物，其中纳米粒具有小于1000nm的尺寸。

4.权利要求1的药物组合物，其中纳米粒具有小于500nm的尺寸。

5.权利要求1的药物组合物，其中PEC聚合物的分子量小于2000kDa。

6.权利要求1的药物组合物，其中PEC聚合物的分子量小于500kDa。

7.权利要求1的药物组合物，其中药理学活性剂选自化学化合物、生物学活性剂、核酸、肽和蛋白质。

8.权利要求7的药物组合物，其包含进一步选自生长抑素类似物抑制剂、二膦酸盐、调脂药和免疫抑制剂的药理学活性剂。

9.权利要求1的药物组合物，其中聚(碳酸亚乙基酯)具有至少一种下列特征：(a)碳酸亚乙基酯含量为70至100Mol%，(b)在20℃氯仿中测定的特性粘度为0.4至4.0dl/g，和/或(c)玻璃化转变温度为5至50℃。

10.权利要求1-9中任意一项的药物组合物，其中PEC纳米粒混悬剂具有缓释特性。

11.权利要求1-9中任意一项的药物组合物，其中PEC纳米粒混悬剂是贮库制剂。

12.制备权利要求1至11中任意一项的药物组合物的方法，其通过制备包含至少一种药理学活性剂和至少一种聚(碳酸亚乙基酯)聚合物的纳米粒混悬剂进行。

13.权利要求12的方法，其中纳米粒混悬剂应用溶剂置换法、溶剂蒸发法或盐析法制备。

14.权利要求12的方法，其中粒径通过改变聚合物的浓度调节。

15.制备权利要求1至11中任意一项的药物组合物的方法，其通过应用溶剂置换法、溶剂蒸发法或盐析法进行。

说明书

纳米粒组合物

发明领域

[0001] 本发明涉及包含药理学活性剂的聚(碳酸亚乙基酯)(PEC)纳米粒、它们的制备方法以及它们作为药物组合物的用途，特别是作为纳米粒混悬剂的用途。

[0002] 发明背景

[0003] 聚合物纳米粒作为颗粒载体在药物和医学领域已被广泛研究，因为它们作为药物递送系统提供了有前景的优势。纳米粒通常被定义为可能是或可能不是生物可降解的固体亚微米大小的药物载体。术语“纳米粒”是纳米球和纳米囊的总称。纳米球具有骨架型结构。药物被吸附到球表面或者被包封于颗粒中。纳米囊是导管体系，其内的药物被限制在由聚合物膜包围的内部液体核组成的腔内。在这种情况下，活性物质通常溶于内核，但也可能吸附到囊表面。纳米粒用于递送治疗药物正受到重要关注。

[0004] 特别的是，由于其空间和时间控制的药物递送机理，可注射的纳米粒载体被认为具有彻底改变疾病治疗的能力。例如，将毒性和其它有效药物的释放仅空间定位到特别的治疗位点可以降低整体的系统剂量和这些药物在不同方面产生的危害。对药物释放的时间控制还可以帮助减少不希望的副作用，否则该副作用可能由于全身化学水平的自然昼夜节律波动而出现。在疾病治疗中这些改善的整体益处是增加了患者的顺应性和生活质量。已经用于制备聚合物纳米粒的典型的聚合物是例如聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(氰基丙烯酸乙酯)、聚丙烯酰胺、聚氨基甲酸酯、聚(乳酸)、聚苯乙烯、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)或聚(ε-己内酯)。

[0005] 为了使药物递送装置获得上述益处，其必须在血流中存在足够长的时间，以达到或实现其作用的治疗方面。但是，单核吞噬细胞系统(MPS)，又称为网状内皮系统(RES)对机体内纳米粒药物载体的调理或清除，是实现这些目标的主要障碍。MPS的巨噬细胞具有在静脉内施用的数秒内将未保护的纳米粒从血流中清除的能力，这使得它们作为次要的特别药物递送装置时失效。这些巨噬细胞典型地是枯否细胞或肝脏巨噬细胞，其不能直接确定纳米粒本身，而是识别结合到颗粒表面的特别的调理素蛋白。

[0006] 目前用于制备纳米粒的聚合物具有被快速识别从而被巨噬细胞系统清除，或对水解不稳定的缺点。一种广泛用于减缓纳米粒调理作用(并且因此被巨噬细胞清除)的方法是应用表面吸附的或嫁接的屏蔽的基团，其能阻断帮助调理素结合到颗粒表面的静电和疏水相互作用。这些基团可以是长的亲水性聚合物链和非离子表面活性剂。已经被尝试用作屏蔽基团以减缓调理作用和相应的巨噬细胞清除的聚合物系统的某些实例包括：多糖、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、PEG和含有PEG的共聚物。

[0007] 本发明的目的是提供具有改善的稳定性、适合用作药物组合物的纳米粒并且特别是纳米粒混悬剂。

[0008] 发明概述

[0009] 根据一个方面，本申请涉及包含含有药理学活性剂的聚(碳酸亚乙基酯)(PEC)纳米粒的药物组合物。这些PEC纳米粒不仅描述了物理和化学稳定性，而且描述了与常规的聚合物纳米粒相比对吞噬作用的生物学稳定性。由于这种较低的吞噬率，PEC纳米粒被巨噬细胞系统清除较慢。这些重要特性使得本申请的PEC纳米粒适于用作递送药理学活性剂的药物组合物。其独特的性质使得PEC成为适合的包含药理学活性剂、优选包封药理学活性剂的控释或缓释纳米粒载体。特别的是，改善的对吞噬作用的稳定性允许应用根据本发明的PEC纳米粒作为非肠道贮库，通过PEC纳米粒的生物降解来释放包封的药理学活性剂，从而使得所述的药理学活性剂历经较长的释放期间可用于全身。因此，将PEC纳米粒用作药理学活性剂的载体与本领域已知的聚合物纳米粒相比，具有显著的优势。

[0010] 根据进一步的方面，本申请涉及聚(碳酸亚乙基酯)纳米粒的混悬剂，优选包含药理学活性剂。各种PEC纳米粒混悬剂是物理稳定的，并且适于皮下局部递送。根据进一步的方面，本申请涉及PEC纳米粒的混悬剂在制备药物组合物中的用途。

[0011] 根据进一步的方面，本申请涉及制备包含含有药理学活性剂的聚(碳酸亚乙基酯)纳米粒的药物组合物，特别是通过溶剂置换法制备PEC纳米粒混悬剂的方法。

[0012] 通过以下描述和附加的权利要求，本申请的其它目的、特征、优点和方面对于所属领域的技术人员而言将变得显而易见。但是应理解的是，以下描述、附加的权利要求和特别的实例表示本申请优选的实施方案，仅通过举例说明来提供。通过阅读以下内容，在所公开发明的精神和范围内的多种改变和修饰对于那些所属领域的技术人员而言将变得显而易见。

[0013] 本发明通过非限制性的实例进一步被阐述，但是，其组成了本发明的优选实施方案。另外，本申请中引用的所有参考文献完全并入本文作为参考。

[0014] 附图简述

[0015] 图1：显示了通过改变聚合物浓度调节未载药的纳米粒的粒径(图1a是PEC95，图1b是PEC99)。该图显示了应用不同的聚合物浓度的三个不同批次的由PCS获得的纳米级粒径(参见实施例4)。一式三份样的平均PDI在商品名后的括号内显示。尺寸的标准差通过棒图表示。

[0016] 图2：显示了通过改变聚合物浓度调节载药的纳米粒的粒径。该图显示了应用不同的聚合物浓度的三个不同批次的由PCS获得的纳米级粒径。尺寸的标准差通过棒图表示。

[0017] 图3：显示了不同温度下PEC95纳米粒的尺寸变化。贯穿线对应于在4℃下制备的一式三份样的平均尺寸，其穿过了气候培养箱的所有温度变化(参见实施例5.2)。

[0018] 图4：显示了不同温度下PEC99纳米粒的尺寸变化。贯穿线对应于在4℃下制备的一式三份样的平均尺寸，其穿过了气候培养箱的所有温度变化(参见实施例5.2)。

[0019] 图5：显示了通过PCS分析的由PEC99(A)或PEC95(B)构成的纳米粒的膨胀试验的结果(参见实施例5.3)。在蒸发过程中显示了尺寸的变化。纳米粒应用PEC99或PEC95制备。在注入至PVA溶液(T＝0)后，对时间点取等分样并且应用PCS描述和分析粒径。仅显示了第一个24小时(t＝0、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时和24小时)的数据。误差棒显示了一式三份样的标准差。

[0020] 图6a：显示了应用原子力显微镜(AFM)分析PEC95颗粒(0.1mg/5mL)。图6b显示了应用原子力显微镜(AFM)分析PEC95颗粒(3mg/5mL)。

[0021] 图7：显示了应用原子力显微镜(AFM)分析PEC99颗粒(0.1mg/5mL)。

[0022] 图8：显示了在颗粒制备过程中蒸发过程的第一个半小时内PEC95(3mg/mL)的膨胀特征(参见实施例5.3)。

[0023] 图9：显示了载药的PEC95和PEC99纳米粒混悬剂在37℃下通过FACS测定的荧光(参见实施例8)。

[0024] 图10：显示了不同纳米粒加上NaN3在4℃和37℃下通过FACS测定的荧光(参见实施例8)。

[0025] 发明详述

[0026] 根据本申请的一个方面，提供了包含含有药理学活性剂的聚(碳酸亚乙基酯)纳米粒的药物组合物。

[0027] 与应用常规的生物可降解且水解可降解的聚合物(例如PLGA或聚(ε-己内酯))相比，应用聚(碳酸亚乙基酯)(PEC)作为聚合物纳米粒的基质材料很有利。PEC纳米粒具有很高的载药能力并且PEC在水性溶液中化学稳定并且仅在体内降解。PEC在体内和体外-1是生物可降解的，特别是通过超氧阴离子基团O2 ，所述的阴离子在体内主要由炎性细胞产-1
生。这种由产生O2 的细胞进行的非水解生物降解在生物可降解的聚合物中相当独特。另外，PEC的生物降解产物仅具有非常低的毒性或甚至没有毒性。

[0028] 另外，发明人惊奇地发现，PEC纳米粒与其它本领域已知的聚合物纳米粒(例如聚苯乙烯纳米粒)相比，其较少被吞噬，从而较少被巨噬细胞除去/清除。由于这种重要的特征，从PEC纳米粒较少受攻击并且因此较少被巨噬细胞清除，从而能比常规的聚合物纳米粒在更长时期内释放所含药物的意义上讲，本发明的PEC纳米粒在生物学上更加稳定。

[0029] 这些重要的方面一PEC纳米粒的物理稳定性、PEC纳米粒的化学稳定性以及它们对抗吞噬作用的生物学稳定性，使得本发明的PEC纳米粒适合用作递送药理学活性剂的药物组合物。PEC独特的性质使其成为适合的纳米粒载体，用以控释或缓释包含的，优选包封的药理学活性剂。本文所用的术语“缓释”或“控释”是指在将装置植入到人体或动物体后3至10天、例如7天内所用的PEC纳米粒对溶解或分散其中的药理学活性剂的释放不超过
10、20、30、40或50％至60、70、80或90％重量。

[0030] 特别的是，改善的对抗吞噬作用的稳定性允许应用根据本发明的PEC纳米粒作为通过PEC纳米粒的生物降解释放所包封的药理学活性剂的非肠道贮库，从而使得所述的药理学活性剂历经更长的释放时期全身可利用。因此，与本领域已知的聚合物纳米粒相比，应用PEC纳米粒作为药理学活性剂的载体具有显著的优势。

[0031] 在本发明中，药物组合物包含至少一种含有在PEC纳米粒中的药理学活性剂，并且药理学活性剂可以被例如包封、溶解或分散其中。本发明的纳米粒可用于给患者控制或缓慢递送药理学活性剂。本文所用的术语“缓释”或“控释”应如以上定义被应用。

[0032] 本发明的PEC纳米粒具有范围为1-1000nm的直径。纳米粒的直径可以小于800、750、700、650、600、550、500nm和/或小于450nm，优选具有窄的尺寸分布。如果所用的纳米粒混悬剂欲用于注射，那么更小直径的纳米粒能用于较小的针头尺寸。

[0033] 本文所用的术语“药理学活性剂”包括任何当施用于活的生物体时能产生生理学响应的物质。这类物质通常以治疗有效量施用。本文所用的术语“治疗有效量”通常指有效减少、消除、治疗、预防或控制影响哺乳动物的疾病或病症的症状或发展的量或浓度。控制是指所有的过程，其中可以有减缓、中断、阻止或停止影响哺乳动物的疾病或病症的进程或发展。但是，“控制”并不必须表示所有疾病和病症症状的完全消除，而是还包括预防性治疗。对所属领域的技术人员而言已知的是，适合的治疗有效量会随着所用的治疗化合物和注明的适应证而不同。本文所用的术语“药物活性剂”、“活性成分”、“药理学活性化合物”、“活性物质”或“药物”的含义应理解为等同的。

[0034] 许多不同的药理学活性剂可以用根据本发明的PEC纳米粒递送/配制。治疗类的药物的实例包括但不限于：抗高血压药、抗焦虑剂、抗凝血剂、抗惊厥剂、降血糖剂、抗组胺剂、镇咳药、抗肿瘤剂、β-阻断剂、抗炎剂、抗精神病剂、认知增强剂、抗动脉粥样硬化剂、降胆固醇剂、抗肥胖剂、自身免疫障碍剂、抗阳痿剂、抗菌剂和抗真菌剂、免疫抑制剂、催眠剂、抗抑郁药、抗病毒剂、抗生素、化学治疗剂、避孕药、镇静剂、类固醇、维生素、酶、抗原以及前述的组合。

[0035] PEC纳米粒特别适用于药理学活性剂，其在低的量下具有药理学活性，并且在延长的期间内需要具有不间断的血液水平，例如激素、肽或蛋白质、对生物靶标具有高亲和力的化学实体(例如生长抑素、二膦酸盐、干扰素和白介素)。根据本发明的PEC纳米粒混悬剂特别适用于递送不稳定并且口服应用后或在胃肠系统中分解，从而优选非肠道施用的药理学活性剂。

[0036] PEC聚合物的长处在于能包封蛋白质而不会使它们变性。通过PEC的体内降解，不会产生酸性的微环境(典型地在PLGA聚合物中观察到)，其另一个优点是还可以将酸不稳定的蛋白质应用于PEC贮库中。

[0037] 本发明应用的药理学活性剂可以选自化学化合物、生物学活性剂、核酸、肽和蛋白质。本文所用的术语“生物学活性剂”指可能与生物学组分反应的活性剂。更特别的是，本说明书中应用的生物学活性剂设计用来改变与活细胞相关的自然过程。就本说明书的目的而言，细胞自然过程是在递送生物学活性剂之前与细胞相关的过程。生物学活性剂的实例包括但不限于：药物、蛋白质、肽、多肽、酶抑制剂、激素、细胞因子、抗原、病毒、寡核苷酸、酶和多聚核苷酸。

[0038] 本文所用的术语“蛋白质”是指多肽(即至少由两个氨基酸通过肽键彼此相连的链)。蛋白质可以包括除氨基酸外的其它部分(例如可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可以被处理或修饰。所属技术领域的技术人员应理解的是，“蛋白质”可以是由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或者可以是其特征部分。所属技术领域的技术人员应理解的是，蛋白质有时可以包含多于一条多肽链，例如通过一个或多个二硫键相连或通过其它方式关联。有用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化等。在某些实施方案中，蛋白质可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。术语“肽”通常用来指长度小于约100个氨基酸的多肽。蛋白质和肽的实例包括但不限于：细胞因子(例如白介素、G-CSF、M-CSF、GM-CSF或LIF)、干扰素、促红细胞生成素、环孢菌素或激素或者它们的类似物。

[0039] PEC纳米粒特别适合用作小于2500Da的低分子量(MW)的药理学活性剂的载体。另外，根据优选的实施方案，药理学活性剂具有亲脂性或包含亲脂性基团。不同的活性剂被PEC基质有效包封以形成本发明的PEC纳米粒。

[0040] 药理学活性剂可以选自生长抑素类似物(例如帕瑞肽(pasireotide)、兰瑞肽、奥曲肽、伐普肽及其盐)、二膦酸盐(例如唑来膦酸及其盐)和调脂药。生长抑素类似物是具有生长抑素样活性的化合物。几种具有生长抑素样活性的已知生物学活性寡肽抑制生长激素从哺乳动物垂体的释放。这些生物学活性寡肽及其作用机理在本领域是众所周知的，例如被Weckbecker等人，2003(Nature Reviews，第2卷，第999-1016页)和Murray等人，2004(J Clin Invest，第114卷，第349-356页)公开，将它们均并入本文作为参考。除了生长抑素本身，这些生物学活性寡肽包括但不限于奥曲肽、兰瑞肽、伐普肽和帕瑞肽，及其可药用盐，优选乙酸盐。

[0041] 就本发明的目的而言，术语“二膦酸盐”是指含有两个膦酸盐基团的药物。二磷酸盐被分为含N二磷酸盐样的帕米膦酸、奈立膦酸、阿仑膦酸、伊班膦酸或利塞膦酸，以及非含N二膦酸盐样的依替膦酸、氯膦酸和替鲁膦酸。例如，唑来膦酸可以用于本发明的递送系统。二膦酸盐唑来膦酸被化学命名为(1-羟基-2-咪唑-1-基-膦酰基乙基)膦酸一水合物，并且其结构式列举为式A：

[0042]

[0043] 可选择的是，调脂药也可以载入到本发明的纳米粒中。就本发明的目的而言，表述“调脂药”是指改变脂质或脂蛋白的血浓度的任何药物，例如胆固醇、甘油三酯、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、中间密度脂蛋白(IDL)、高密度脂蛋白(HDL)、极高密度脂蛋白(VHDL)、脂蛋白a和乳糜微粒。这些药物包括但不限于胆固醇吸收抑制剂、烟酸、贝特或他汀。调脂药非限制性的实例是来适可(Lescol)、烟酸受体激活剂和甲状腺β受体激活剂。

[0044] 可选择的是，免疫抑制剂也可以载入到本发明的纳米粒中。免疫抑制剂非限制性的实例是皮质醇、地塞米松、烷化剂、氮芥、亚硝基脲，以及硫唑嘌呤、雷帕霉素、环孢菌素、FK506和甲氨蝶呤。

[0045] 药理学活性剂可以以占组合物重量的至多约70％，占组合物重量的约0.5％至约60％、占组合物重量的约10％至约40％或者占组合物重量的约1.0％至10％的量存在。但是，药理学活性剂的特别水平将根据药物领域众所周知的因素进行选择，包括所用PEC中药理学活性剂的溶解度、施用模式以及个体的尺寸和病症。

[0046] 治疗类药物的实例包括但不限于：抗高血压药、抗焦虑剂、抗凝血剂、抗惊厥药、降糖剂、减充血剂、抗组胺药、镇咳药、抗肿瘤剂、β-阻断剂、抗炎剂、抗精神病剂、认知促进剂、抗动脉粥样硬化剂、降胆固醇剂、抗肥胖剂、自身免疫障碍剂、抗阳痿剂、抗菌剂和抗真菌剂、催眠剂、抗生素、抗抑郁剂、抗病毒剂以及前述的组合。

[0047] 制备根据本发明的PEC纳米粒所用的PEC聚合物可以包含具有式A的碳酸亚乙基酯单元：

[0048] -(-C(O)-O-CH2-CH2-O-)- (式A)

[0049] 其具有至少一种以下特征：

[0050] -碳酸亚乙基酯的含量为70至100Mol％，和/或

[0051] -在20℃氯仿中测定的特性粘度为0.4至4.0dl/g，和/或

[0052] -玻璃化转变温度为5至50℃。

[0053] 所用的PEC聚合物的碳酸亚乙基酯的含量为70至100Mol％。优选的是，PEC聚合物中亚乙基的含量为80至100％、优选90至99.9％。

[0054] 所用的PEC聚合物在20℃氯仿中测定的特性粘度为0.4至4.0dl/g。优选的是，PEC聚合物在20℃和浓度为1g/dl的氯仿中测定的特性粘度为0.4至3.0dl/g。

[0055] 所用的PEC聚合物的玻璃化转变温度为5℃至50℃、优选15℃至25℃。

[0056] 所用的PEC聚合物的分子量小于约2000kDa。优选的是，分子量小于500kDa，可以通过例如凝胶渗透色谱，以二氯甲烷作为洗脱剂并且聚苯乙烯作为对照来测定。

[0057] 在进一步的实施方案中，PEC聚合物可以以(共)聚物的形式存在，例如含有式B的环氧乙烷单元作为共有单元：

[0058] -(-CH2-CH2-O-)- (式B)

[0059] 如果PEC聚合物含有环氧乙烷单元，那么PEC聚合物具有碳酸亚乙基酯和环氧乙烷的随机分布，根据总式Am-Bn

[0060] -(C(O)-O-CH2-CH2-O-)-m-(-CH2-CH2-O-)-n (式C)

[0061] 其中m/(n+m)×100＝70至100。但是，本发明的PEC聚合物中的大多数环氧乙烷单元在统计学上与碳酸亚乙基酯单元毗邻，特别是当环氧乙烷单元的摩尔比例小的时候。这意味着，在这些情形下，大多数产生的醚官能团沿着聚合物链在碳酸酯官能团之间随机
1
分布。普通的技术人员能理解的是，本发明的产物在DCCl3中的 H-NMR图谱证实了该假设。

[0062] 本发明的PEC聚合物在热水(90-100℃)中能稳定几小时，而不会出现大量的分子量降低。在暴露于沸腾的双蒸水中数小时后，例如高达18℃以上，例如28℃，观察到玻璃化转变温度明显增加。

[0063] PEC聚合物可以以占组合物重量的至多约99％、占组合物重量的约0.5％至约80％、占组合物重量的约10％至约30％或者占组合物重量的约1至约10％的量存在。

[0064] 根据一个实施方案，药物组合物采用纳米粒混悬剂的形式。与应用PEC微粒相比，应用生物可降解的PEC纳米粒混悬剂是有利的，因为纳米粒混悬剂与微粒混悬剂相比不会沉降，而会形成物理稳定的混悬剂。

[0065] 几种药物动力学特点可能在注射纳米混悬剂之后产生。通过皮下、肌内或皮内途径的递送贮库提供了延长的药物释放，因为它们能够将更多的药量安全载入到小注射体积内。PEC纳米粒混悬剂强大的载药能力是本发明的纳米粒混悬剂重要的有利特点。

[0066] 因此，本发明的PEC纳米粒可以有利地以混悬剂的形式应用，特别是以非肠道制剂的形式应用。本文所用的术语“非肠道制剂”是指应用注射器和针头或导管通过非消化道的途径施用的组合物。这包括静脉内、动脉内、肌内、心内、皮下、骨内(intraosseus)、皮内、鞘内、腹膜内、膀胱内、透皮、经粘膜、硬膜外和玻璃体内的应用。PEC纳米粒混悬剂特别适用于皮下局部递送。

[0067] 由于它们有益的稳定性特点，本发明的PEC纳米粒可以以即用非肠道贮库的形式应用，该非肠道贮库可以例如皮下注射。为此，由于PEC纳米粒的小尺寸，还可以应用非常小的针头尺寸(例如27G或更小)。这些特征使得各自的贮库制剂还可以家庭应用和自己施用。

[0068] 几种非肠道应用形式和各种药物制剂是所属领域的技术人员已知的并且包括注射剂、输注剂、浓缩物和植入物。包含PEC纳米粒的药物组合物可以通过适合的盖仑赋形剂制备，并且任选地在其中加入适合的分散剂。

[0069] 为了增加PEC纳米粒混悬剂的稳定性，该制剂可以进一步包含稳定剂，例如防止纳米粒聚集或沉淀的表面活性剂。例如，可以应用离子或非离子表面活性剂。表面活性剂的实例包括但不限于：脂肪酸；烷基磺酸盐；聚氧乙烯脂肪酸；脱水山梨醇衍生物；聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯；卵磷脂；磷脂；单、二和三甘油酯；及其混合物。表面活性剂在药物组合物中的应用对于技术人员而言是已知的。为了方便，参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：药物科学与实践)，第20版，2000。

[0070] 在本申请的进一步的方面，包含PEC聚合物和药理学活性剂的药物组合物可以进一步包含可药用赋形剂，例如离子或非离子表面活性剂、粘合剂或粘胶剂、抗氧化剂、润滑剂和/或pH调节剂。应理解的是，这类进一步的成分是本领域众所周知的。所以，PEC纳米粒可以进一步包含聚合物和/或添加剂。实例包括纳米粒内部或表面的自由基清除剂，例如甲萘醌和/或维生素C。各种添加剂可以包埋在(共)聚物内，并且可以减少例如聚(碳酸亚乙基酯)的降解速率，从而使得药物释放的进一步延长和因此的纳米粒制剂的贮库活性。

[0071] 这类表面活性剂的实例包括但不限于：天然或氢化蓖麻油和环氧乙烷的反应产物，例如来自BASF Corp.(Mt.Olive，NJ)的CREMOPHOR系列；

[0072] 聚氧乙烯脂肪酸酯包括聚氧乙烯硬脂酸酯，例如来自Uniqema(New Castle，DE)的MYRJ系列；脱水山梨醇衍生物，例如来自Uniqema(New Castle，DE)的TWEEN系列；聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和嵌段共聚物或泊洛沙姆，例如来自Uniqema的SYNPERONIC PE/F 87/108/127L44和来自BASF的PLURONIC(Lutrol F127)；聚氧乙烯烷基醚；从Eastman Chemical Co.(Kingsport，TN)可获得的熔点为约36℃的水溶性生育酚PEG琥珀酸酯；具有例如5-35个[CH2-CH2-O]单元、例如20-30个单元的PEG甾醇醚，例如来自Chemron(Paso Robles，CA)的SOLULAN C24(Choleth-24和Cetheth-24)；聚甘油脂肪酸酯，例如来自Nikko Chemicals(Tokyo，Japan)的DECAGLYN、HEXAGLYN和TETRAGLYN；以及亚烷基多元醇醚或酯化合物。

[0073] 粘合剂或粘胶剂的实例包括但不限于：单独或组合的阿拉伯胶；西黄蓍胶；蔗糖；明胶；葡萄糖；淀粉，例如但不限于预胶化淀粉；海藻酸和海藻酸盐；硅酸镁铝；PEG；瓜尔胶；多糖酸；膨润土；聚维酮，例如聚维酮K-15、K-30和K-29/32；聚甲基丙烯酸酯；HPMC；羟丙基纤维素；和乙基纤维素。

[0074] 抗氧化剂的实例包括但不限于：抗坏血酸及其衍生物、生育酚及其衍生物、丁基羟基茴香醚和丁基羟基甲苯。维生素E中如α-生育酚特别有用。

[0075] 润滑剂的实例包括但不限于：硬脂酸镁、硬脂酸钙、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇、滑石粉和硬脂酸。

[0076] pH调节剂的实例包括但不限于：NaOH、LiOH、KOH、Na2CO3、NaHCO3、K2CO3、KHCO3、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、KH2PO4、K2HPO4、K3PO4、葡甲胺、Ca(OH)2、Mg(OH)2、Zn(OH)2、Al(OH)3、吡哆醇、三乙醇胺、氢氧化铵、胞嘧啶、二乙胺、葡甲胺、鸟氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、胆碱、普鲁卡因、二乙基乙醇胺、氨基葡萄糖、鸟嘌呤、烟酰胺、哌嗪、胍、乙醇胺、哌啶、三乙胺、氨丁三醇、苄星、苄星、腺嘌呤，其混合物等。

[0077] 在本申请的进一步的方面，聚(碳酸亚乙基酯)纳米粒是混悬剂的形式。

[0078] PEC纳米粒在混悬剂中的特征在上面已经描述，我们参考上面的公开。

[0079] 根据一个实施方案，PEC纳米粒混悬剂包含至少一种药理学活性剂，并且具有至少一种以下附加特征：

[0080] a)具有至少一种以下特征的PEC聚合物：

[0081] -碳酸亚乙基酯的含量为70至100Mol％，

[0082] -在20℃的氯仿中测定的特性粘度为0.4至4.0dl/g，和/或

[0083] -玻璃化转变温度为5至50℃；

[0084] b)PEC纳米粒混悬剂是非肠道制剂；

[0085] c)PEC纳米粒混悬剂具有缓释特征；

[0086] d)PEC纳米粒混悬剂是非肠道贮库制剂；

[0087] e)混悬剂的纳米粒的直径小于1000nm、800nm、750nm、700nm、650nm、600nm、550nm、500nm和/或小于450nm；和/或

[0088] f)所用的PEC聚合物的分子量小于2000kDa。

[0089] 混悬剂的PEC纳米粒包含药理学活性剂，特别是上述的药理学活性剂。混悬剂的PEC纳米粒任选可以包含另外的可药用赋形剂，例如离子或非离子表面活性剂、粘胶剂、稳定剂、抗氧化剂、润滑剂和/或pH调节剂和/或添加剂，例如纳米粒内部或表面的自由基清除剂，例如甲萘醌和/或维生素C。我们参考也应用于此的上述详细公开内容。

[0090] 本发明还涉及各种PEC纳米粒混悬剂在制备药物组合物中的用途。

[0091] 本发明还提供了通过制备包含药理学活性剂的聚(碳酸亚乙基酯)纳米粒的混悬剂来制备上述药物组合物的方法。

[0092] 纳米粒混悬剂可以通过多种技术获得。适合用来制备纳米粒混悬剂的方法在例如Rice等人，Nanomedicine：Nanotechnology，Biology，and Medicine 2(2006)8-21中有详细描述，将其完全并入本文作为参考，并且其还可以用来制备本文描述的PEC纳米粒混悬剂。特别的是，溶剂蒸发法、盐析法和溶剂置换法是最有利的。随后应用了溶剂置换法，因为其赋予了纳米粒均一分布的尺寸。

[0093] 当应用溶剂置换法时，首先将聚合物溶于在定义的浓度可与水混溶的有机溶剂(例如丙酮、乙腈、二甲亚砜(DMSO)、N-1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、氯仿、1，4-二 烷、二甲基甲酰胺(DMF)或N-2-吡咯烷酮)中。然后，通过注射器或注射泵将混合物注射到水溶液(例如可以任选包含稳定剂的PBS缓冲液(pH 7.4，0.1M))中。随即，有机相在水相中快速扩散，从而导致胶体隔离(tyndallised)体系的产生。在常压或减压下用磁力搅拌器搅拌该溶液，直到有机溶剂完全蒸发。可以由溶剂置换法制备的纳米粒的尺寸可以通过改变不同的因素而不同。可以影响尺寸的重要因素是聚合物浓度、水溶液中任选的稳定剂的浓度以及有机相与水相的比例、注射毛细管的直径、聚合物/溶剂混合物的注射速率以及温度。特别是聚合物浓度是决定性的。溶剂置换法显示了特别是对于亲脂性化合物的高包封率，因此非常适合用于包封亲脂性药物化合物，如实施例所示的，用亲脂性荧光标记物香豆素-6作为模型物质。

[0094] 有机溶剂的实例包括但不限于：丙酮、乙腈、二甲亚砜(DMSO)、N-1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、氯仿、1，4-二 烷、二甲基甲酰胺(DMF)或N-2-吡咯烷酮；优选二甲亚砜(DMSO)或N-1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。

[0095] 为在纳米粒中载入至少一种药理学活性剂，通过将药理学活性剂溶于在定义的浓度下与水混溶的有机溶剂(例如丙酮或乙腈)中，制备药理学活性剂的第一储备溶液。药理学活性剂在第一储备溶液中的浓度范围可以为1至500微克/毫升有机溶剂、优选5至100微克/毫升有机溶剂、最优选25至7微克/毫升有机溶剂。第二储备溶液通过将PEC聚合物溶于在定义的浓度下与水混溶的有机溶剂(例如丙酮或乙腈)中制备。PEC聚合物在第二储备溶液中的浓度范围可以为0.1至100微克/毫升有机溶剂、优选0.5至50微克/毫升有机溶剂、最优选1至25微克/毫升有机溶剂。将需要量的第一储备溶液和第二储备溶液用移液管转移至Eppendorf杯中，并且用有机溶剂填充至1.5mL。涡旋并且注射到PVA溶液中后，获得希望的终浓度。用于确定储备溶液适合的浓度和量以获得希望的终浓度的方法对于技术人员而言是众所周知的。

[0096] 取决于药理学活性剂的物理和化学性质，药物的载量可以在0.1至70％重量之间不同。当制备包含药理学活性剂的PEC纳米粒时，与药理学活性剂相比，PEC聚合物的量可以在1至90％重量之间不同，优选约30％重量。

[0097] 根据一个实施方案，将PEC聚合物溶于乙腈，因为乙腈与水混溶并且能溶解PEC聚合物。

[0098] 将用于溶解PEC聚合物的溶剂用第二溶剂置换，优选含有乳化剂。细节在实施例部分也有描述。作为乳化剂，可以应用聚乙烯醇，优选Mowiol 18/88。

[0099] 根据一个实施方案，颗粒的尺寸用聚合物的浓度调整。试验表明，0.1mg/5mL PVA的PEC聚合物浓度适合用来获得尺寸小于200nm的纳米粒。3mg/5mL PVA的浓度使得纳米粒具有几乎不高于200nm的尺寸，因此是仍然在非常适合的范围内。

[0100] 本发明通过非限制性的实施例来进一步阐述，但是，其组成了本发明优选的实施方案。另外，本申请中引用的所有文献全部并入本文作为参考。实施例

[0101] 实施例1：合成聚(碳酸亚乙基酯)的试验方法

[0102] PEC可以由CO2和环氧乙烷反应，然后聚合而获得(参见例如Acemoglu等人，Poly(ethylene carbonate)s part I：Syntheses and structural effects on biodegradation(聚(碳酸亚乙基酯)第I部分：合成和对生物降解的结构影响)，Journal of controlled release，1997，49(2，3)：第263-275页和Vogdanis等人，Carbon dioxide as a monomer，The polymerization of ethylene carbonate(二氧化碳作为单体，碳酸亚乙基酯的聚合).Makromol.Chem.1986.Rapid Commun.7：第543-547页，将其并入本文作为参考)。

[0103] 随后，用于制备纳米粒的PEC聚合物PEC95和PEC99表现出表1所示的物理性质。PEC95的碳酸亚乙基酯含量[Mol％]为97％。

[0104] 表1：聚(碳酸亚乙基酯)的物理性质

[0105]

[0106] ＊在20℃和10mg/mL的浓度下

[0107] 实施例2：通过应用溶剂置换法制备PEC纳米粒

[0108] 根据以下修饰的溶剂置换法制备PEC-纳米粒混悬剂：

[0109] 首先，制备PEC99和PEC95的聚合物-乙腈-储备溶液。应用乙腈是因为它在水中混溶并且PEC溶于其中。在紫色杯中称取100mg PEC，并且在约24小时内将其溶于10mL乙腈中。储备溶液的浓度为10mg聚合物/mL。

[0110] 在加入200mL超纯水后，应用100mg Mowiol 18/88制备稳定溶液(终浓度：0.05％PVA)。将溶液在约90℃下磁力搅拌加热3小时，以使PVA完全溶解。将溶液冷却后通过0.2μm的醋酸纤维素滤膜过滤，并且在冰箱中保存。

[0111] 为了制备纳米混悬剂，将5mL PVA-溶液(室温)加入至通过压缩气体清洁的玻璃小瓶中，并且在外面标记溶液高度和装量(charge)。

[0112] 为了预期的终浓度，用移液管从PEC/乙腈溶液中取出预期量的聚合物，并且加入至1.5mL Eppendorf杯中。然后，加入乙腈以获得1.5mL的终体积。将杯密封并且用涡旋器匀化。将获得的溶液用23Gauche-套管吸取到2mL注射器(B Braun)中，并且将空气压出，以将注射过程中的湍流最小化。然后，将套管浸入到PVA溶液的中部，并且快速并且持续地压下活塞。

[0113] 之后，不应用磁力搅拌棒在通风橱(extractor hood)下将小瓶蒸发过夜。取走磁力搅拌棒能防止PEC的聚集。在蒸发后，检查没有乙腈残留物剩余，并且将蒸发的水加至标记。

[0114] 实施例3：载药PEC纳米粒的制备

[0115] 为了细胞分析，制备载有用作模型药物的荧光标记物香豆素-6(Sigma Aldrich)的纳米粒混悬剂。香豆素-6(C-6)的结构：

[0116]

[0117] 应用香豆素-6(吸收：485nm，发射：505-525nm)是因为它可以在光学上检测潜在的吞噬过程，而且它是亲脂性活性剂的适合模型。由于香豆素-6的亲脂特征和低水溶性，其可以通过溶剂置换法进行适当处理，以获得高的包封率。该包封率非常高并且接近100％。载药纳米粒的制备还可以应用实施例2中所述的修饰的溶剂置换法来进行。储备溶液中应用的香豆素-6为在乙腈中50μg/mL(储备溶液在冰箱中避光保存，例如通过应用铝箔)，并且PEC95和99聚合物为在乙腈中的10mg/mL储备溶液。所有样品都设定为一式三份。对于装载纳米粒，将所需量的PEC储备溶液和香豆素-6储备溶液混合，用乙腈填充至1.5mL并且涡旋(参见表2)。然后，根据常用方案将该溶液注入到PVA溶液中(参见上文)。

[0118] 在本试验中，选择香豆素-6的浓度为0.2％(与PEC的质量相关)。由于在浓度为3mg/5mL时，PEC95纳米粒比PEC99纳米粒要小，因此用1％PVA溶液代替0.05％PVA溶液制备一式三份的PEC95 3mg/5mL(0.2％香豆素-6)。

[0119] 表2：香豆素-6载药纳米粒反应批次表

[0120]

[0121] 尺寸的测定通过具有Malvem仪器zetasizer的光子相关光谱进行。

[0122] TEM分析表明，香豆素-6被掺入到纳米粒中。载药纳米粒为具有光滑表面的圆形。没有发现聚集。

[0123] 实施例4：通过聚合物溶液的浓度调节纳米粒的尺寸

[0124] 纳米粒混悬剂的制备应用以上实施例2描述的修饰的溶剂置换法进行，其应用了三种不同的PEC95或PEC99浓度(参见表3)。将所需量的储备溶液用移液管转移至Eppendorf杯中并且用乙腈填充至1.5mL。涡旋并且注入到PVA溶液中后，获得希望的终浓度。所有其它的反应条件(反应体积、温度、注入条件、蒸发时间和温度)保持恒定。反应制备一式三份，并且整个试验至少重复一次。

[0125] 表3：未载药纳米粒的反应批次表

[0126]

[0127] 获得的纳米粒的粒径通过应用“Zetasizer Nano ZS”(Malvern仪器)的光子相关光谱(PCS)测定。

[0128] 图1所示的PCS结果表明，聚合物浓度增加，粒径也增加。因此，通过聚合物的浓度可以调节纳米粒的尺寸。对于PEC95(参见图1a)，其比PEC99(参见图1b)获得更加均匀的尺寸分布。应用3mg聚合物/5mL的浓度时获得最好的结果，因为多分散指数相当窄。0.1mg/5mL的聚合物浓度非常适合制备直径小于200nm的纳米粒。3mg/5mL的浓度通常导致较大直径、例如大于200nm的纳米粒。

[0129] 实施例5：PEC纳米粒的表征

[0130] 1.载有香豆素-6的PEC纳米粒的尺寸测定

[0131] PEC95和PEC99的载药纳米粒混悬剂如上述制备成0.1mg和3mg聚合物/5mL的浓度。载药用0.2％(w/w)香豆素-6进行。当制备PEC99的未载药混悬剂时，获得尺寸为
300nm或更大的颗粒，而PEC95递送更均匀的尺寸。由于尺寸大于300nm的纳米粒更利于细胞试验，可以用1％PVA溶液制备3mg/5mL PVA溶液的浓度来增大PEC95纳米粒的尺寸。
如上所述制备PEC95(0.1mg/5mL)和PEC99(3mg/5mL)纳米粒。通过光子相关光谱(PCS)应用Zetasizer Nano ZS(Malvern仪器)测定在0.05％PVA的PVA溶液中的尺寸。将在1％PVA溶液中制备的3mg PEC95纳米粒样品应用超纯水稀释至0.05％PVA。

[0132] PCS的结果如图2所示。总之，颗粒的尺寸几乎等于未载药的颗粒尺寸，因为其尺寸仅略微增大。应用1％PVA也导致了尺寸的增加，但是用PCS测定没有超过300nm。

[0133] 2.不同温度下PEC95和PEC99纳米粒的稳定性分析

[0134] 对于气候试验，在不同温度下制备浓度为3mg/5mL的PEC95和PEC99纳米粒混悬剂，一式三份。

[0135] 在4℃下制备纳米粒混悬剂。因此，为了适应环境温度，将填充有PVA溶液的玻璃小瓶在气候培养箱中放置2小时。然后，注入PEC/乙腈溶液(第0天)。在蒸发处理48小时后(由于低温)，将样品萃取，并且通过zetasizer测定尺寸和ζ电位，并且重新将小瓶密封。将小瓶保持密封并且在4℃下贮存，并且在注入3天后，进行进一步的测定。将纳米粒一式三份平行保持在冰箱中，并且进行温度变化。每份新样品在更高的温度下制备并且分析。在最后一次测定(第4天)后的24小时，将气候培养箱的温度升高至14℃，并且因此在气候培养箱内14℃下制备两种相同浓度的新的两种PEC聚合物，一式三份。24小时后，蒸发新样品中的乙腈，并且通过zetasizer测定样品(第5天)。将气候培养箱的温度升高至24℃，并且在达到该温度后(第6天)进一步制备PEC95和99，一式三份。在24℃下制备纳米粒24小时后(第7天)，对新的和旧的纳米粒混悬剂进行分析，并且将气候培养箱的温度升高至31℃。在达到该温度后，制备两种新的一式三份样，并且在24小时后(第
10天)分析/测定在4℃和31℃制备的一式三份样。

[0136] PEC95和PEC99纳米粒的结果分别在图3和4给出。在4℃下制备的纳米粒没有显示出明显的粒径变化，并且历经至少10天保持稳定。对于在14℃、24℃和31℃下制备的纳米粒，仅31℃的反应温度显示出粒径的显著增加。

[0137] 由PEC95聚合物制备的纳米粒混悬剂表明，温度对粒径和ζ电位具有很小的影响。在4℃下制备的一式三份样表明，历经整个温度范围(并且因此也历经玻璃化转变温度)基本具有相同的尺寸和ζ电位。对于在高于玻璃化转变温度的温度下制备的一式三份样，检测到很小的尺寸增加。因此，如果有的话，温度在整个颗粒制备过程中具有很小影响，但是在未载药混悬剂的贮存过程中则不是。

[0138] 3.未载药纳米粒的尺寸和膨胀分析

[0139] 在PVA溶液中注入聚合物溶液(T＝0)，以及蒸发t＝30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时和24小时后立刻从PEC95和PEC99纳米粒反应混合物中取等份。然后，蒸发过程结束，并且将小瓶用盖密封。在T0后的t＝48小时、4天和9天对最后密封的纳米粒容器进行进一步的测定。

[0140] 将等份通过上述的PCS分析粒径。第一个24小时的PEC95和PEC99纳米粒的结果在图5中给出。对于两种聚合物，在第一个30分钟期间可以观察到粒径的增加。在t＝30分钟后，粒径在剩余的试验期间保持不变：

[0141] 表4：PEC99和PEC95的结果

[0142]样品 T0/分钟后的时间 尺寸/nm
PEC 99 0 235,7
30 272,5
60 270,9
90 274,1
120 275,2
12960 267,3

[0143]样品 T0/分钟后的时间 尺寸/nm
PEC95 0 187,9
30 193,8
60 190,1
90 189,7
120 192,2
12960 189,3

[0144] 基于该数据可以得出结论，纳米粒在30分钟内基本成熟，并且在蒸发期间和至多9天的贮存过程中不会有进一步的重大改变。通过原子力显微镜对纳米粒进行的平行分析表明，第一个30分钟过程中的粒径增加事实上是由单个颗粒的膨胀引起的，而不是由聚结引起的。

[0145] 为了清楚尺寸的增加是归因于颗粒的膨胀还是归因于颗粒的聚结和聚集，应用AFM做了进一步的试验。为此，应用“JEM 3010”(Jeol GmbH)通过原子力显微镜(AFM)对纳米粒进行分析。进行该试验是为了测定尺寸、颗粒分布和表面特征以及分析膨胀特征。

[0146] 制备PEC浓度(PEC95和PEC99)为0.1mg/5mL和3mg/5mL的纳米粒，并且在次日通过PCS测定。其后，应用AFM(见下文)对颗粒分布和表面特征进行分析以作为第一部分的分析，来确定表面特征和颗粒分布。

[0147] 对于膨胀分析，用上述的AFM确定纳米粒的发展和膨胀特征。对于AFM分析的第一个样品绘图在T0进行，并且因此在0.05％PVA溶液中注入乙腈/PEC溶液后直接进行。

[0148] 对于AFM，将几滴纳米粒混悬剂应用于载玻片上。在纳米粒吸收到表面后，通过轻敲击除去多余的液体并且干燥载玻片。干燥后，将载玻片送入到AFM中。为了保护颗粒，用Si3N4尖端以160kHz敲击的模式进行微观分析。该分析应用“JPK”-软件和随后的应用“ImageJ”-软件的尺寸测量进行。

[0149] 示例性的结果如图6a、6b和7所示。

[0150] PEC95(0.1mg/5mL)

[0151] PCS测量显示，尺寸为200.5nm时PDI为0.295。AFM结果如图6a所示。大的圆点对应于纳米粒。AFM测量表明，颗粒为具有光滑表面的圆形。很显然，通过PCS测量的直径与真实尺寸不一致，因为AFM拍摄显示出更小的尺寸。根据AFM测量，颗粒具有100nm(标准差为28nm)的平均尺寸。但是，由此可推论的重要事实是证实了光滑、圆形和颗粒以单数的颗粒存在而不聚集的事实。

[0152] PEC95(3mg/5mL)

[0153] 对于PEC95(3mg/5mL)纳米粒，分析表明平均直径为202nm，其小于PCS观察到的235.9nm(PDI为0.03)。但是，推定由PCS测量的粒径更大，因为PCS检测的是包含溶剂层的颗粒。照片表明，具有光滑表面的圆颗粒几乎全部以没有聚结现象的单独颗粒存在。结果如图6b所示。

[0154] PEC99(0.1mg/5mL)

[0155] 颗粒在外观上相似。与PCS测量的139.8nm(PDI为0.216)相比，直径确定为106nm。PEC99纳米粒(3mg/5mL)有更强的趋势形成聚集物，并且更大。

[0156] 结果表明，通过AFM的测量在确定纳米粒的尺寸时更精确。

[0157] 各种未载药的PEC纳米粒的膨胀试验的结果如图8所示(对于PEC95(3mg/5mL))。结果表明，在蒸发过程的第一个半小时，PEC95纳米粒尺寸增加。如图所显示的，大多数颗粒不会聚结，但是由于膨胀过程它们的尺寸会增加。PEC99的纳米粒在蒸发过程的第一个小时显示出比PEC95颗粒更大的尺寸增加，并且更容易聚结。

[0158] 表5：PEC95和PEC99的结果

[0159]聚合物 时间/分钟 尺寸/nm 标准差/nm
PEC95 0 154 46
PEC95 20 227 81
PEC95 30 241 118
PEC99 0 261 49
PEC99 20 450 118
PEC99 30 400 91

[0160] 实施例6：体外培养的巨噬细胞对香豆素-6的摄取

[0161] 为了分析对载有香豆素-6的纳米粒的摄取，在37℃和8.5％CO2及相对湿度95％中培养鼠巨噬细胞系J744A.1(DSMZ Braunschweig)。每两天给细胞提供DMEM(PAA即用介质)、葡萄糖、谷氨酰胺和10％胎牛血清(FCS Cytogen)。在达到临界细胞数后，将培养物分离(通常每周2至3次)。对于CSLM(共聚焦激光扫描显微镜)分析，将细胞核用DAPI染色：

[0162]

[0163] 为了猝灭未吞噬的荧光纳米粒的荧光，在基质中加入非荧光染料锥虫蓝：

[0164]

[0165] 由于该染料不会被活的细胞掺入，因此仅细胞外的荧光被猝灭。

[0166] 通过CLSM分析细胞，以分析载药的纳米粒是如何被细胞处理的。应用Axiovert100M和510扫描仪(Zeiss)运行共聚焦显微镜，并且应用LSM图像浏览器软件分析。CSLM分析仅允许定性分析。

[0167] 通过沿Z-轴做光切(optical cuts)，可以确定香豆素-6的荧光是出现在细胞内部还是外部。作为对照，将部分巨噬细胞在4℃下温育。在该温度下，细胞的能量过程被抑制，并且因此也抑制了吞噬作用的过程。

[0168] 本文所用的PBS缓冲液具有以下浓度：KCl 0.2g、NaCl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO41.51g，蒸馏水加至1000mL。对于细胞试验，需要10×浓缩的PBS缓冲液。为此，缓冲液用蒸馏水填充至100mL而代替1000mL。将缓冲液调至pH 7并且应用0.2μm滤膜无菌过滤。

[0169] 对于该试验的第一部分，应用已知方案(参见上文)制备含有0.2％香豆素-6且浓度为0.1mg和3mg聚合物/5mL的不同装量的PEC99纳米粒。对于试验，选择装量为0.1mg/5mL具有126nm尺寸的颗粒和装量为3mg/5mL具有297nm尺寸的颗粒。

[0170] 对于该试验，在摄取试验前48小时，将密度为0.5×104/孔的J774-细胞接种到工作体积为400μL的两个腔室载玻片上。将存在的介质吸出并且加入320μL PEC99 0.1mg纳米粒混悬剂、40μL 10×浓缩的PBS缓冲液和40μL小鼠血清(PEC终浓度：16μg/mL)。在6个进一步的腔室中加入320μL PEC99 3mg纳米粒混悬剂，再次加入40μL小鼠血清和
10×PBS缓冲液(PEC终浓度：480μg/mL)。为了对未处理的细胞进行可比性研究，使载玻片上的4个腔室保持在基质中，并且不加入纳米粒。将细胞在37℃下温育1小时。之后，吸出基质，并且将细胞用PBS洗涤两次并且用DAPI染色。对与纳米粒温育的所有细胞以及两个腔室中的对比细胞进行染色。两个腔室中的细胞仅固定而不染色，以分析DAPI在香豆素-6的区域是否发射荧光。在试验最后，将腔室从载玻片上移走，并且用应用了几滴Fluorsave(Clabiochem)的盖玻片覆盖。样品避光保存，之后立即用CLSM分析。

[0171] 该试验的第二部分分析了纳米粒混悬剂在37℃和4℃下在不同浓度中的摄取。对于该试验，制备新的装量为含0.2％香豆素-6的PEC99 3mg(直径：约300nm)。

[0172] 在开始该试验前48小时，在密度为0.5×104/孔的三个腔室载玻片上接种巨噬细胞。为了在4℃下温育细胞，将腔室载玻片放在冰箱中保存。为了分析浓度依赖性，选择PEC混悬剂的浓度为480μg/mL、320μg/mL、120μg/mL(指载玻片腔室中的终浓度)。因此，除了四个腔室(比较样品)外，将所有腔室中的介质吸出，并且加入10％小鼠血清和PBS缓冲液，并且取决于希望的终浓度(80μL为120μg/mL、160μL为240μg/mL或320μL为480μg/mL)加入纳米粒混悬剂。将4个腔室在37℃下与不同浓度的PEC纳米粒温育1小时。在具有480μg/mL和240μg/mL PEC纳米粒的4个腔室中，在预冷载玻片上在4℃下进行多于1小时的温育。作为阴性对照，将4个腔室的细胞在37℃下保存，并且不与纳米粒温育。

[0173] 在温育1小时后，吸出液体，将细胞用PBS洗涤两次，并且固定和用DAPI染色(参见实施例7)。之后，将腔室从载玻片上移走，并且应用几滴Fluorsave(labiochem)后盖上盖玻片。样品避光保存，之后立即用CLSM分析。

[0174] 该分析的第一部分(定性分析)的结果表明，与PEC纳米粒(126nm和297nm)的温育导致细胞内的荧光。为了分析通过活性吞噬作用是否有摄取出现，该试验的第二部分在不同的温度进行。如果PEC纳米粒通过活性吞噬过程处理，在4℃温育的细胞应当显示出没有荧光或大量的荧光减少。CSLM结果表明，荧光的增加相应于纳米粒浓度的增加。但是，在4℃与480μg/mL和240μg mL纳米粒温育的细胞也表现出了荧光。这表明PEC纳米粒降低了巨噬细胞的活性吞噬作用。

[0175] 实施例7：DAPI-染色(15mL的工作体积)

[0176] 在含介质的细胞中加入2mL固定液(一部分为PBS并且一部分为4％低聚甲醛)，然后吸出全部液体。之后，在细胞中加入两次5mL固定液，温育5分钟并且吸出。之后，将细胞在空气中干燥15分钟，并且在暗处与DAPI溶液(1mL PBS+20μL DAPI)温育30分钟。在染色过程最后，将DAPI吸出，并且用PBS洗涤三次。

[0177] 实施例8：以荧光聚苯乙烯胶乳珠作为标准品，通过FACS在37℃和4℃并且加入NaN3下比较PEC99和PEC95纳米粒的吞噬作用

[0178] 荧光激活细胞分选仪(FACS)提供了在短时间内分析和表征大量细胞尺寸、紧密度和荧光的可能性。

[0179] 该试验的目的是通过FACS来确定不同尺寸的PEC纳米粒是否比荧光标记的聚苯乙烯标准品(PSS)(其在468nm被激活，并且在508nm发射荧光)更易或更难被巨噬细胞摄取/处理。一个对照通过加入作为吞噬抑制剂的NaN3来进行。另一个对照在4℃的温育温度下进行，因为细胞过程和相应的吞噬作用在该温度被抑制/减缓。

[0180]材料 生产商
NaN3 Acros
DAPI Invitrogen Karlsruhe
FACS扫描 BD Biosciences，San
FACS流 BD Biosciences,San
FCS快车软件 Devonso ftware
荧光聚苯乙烯标准品100nm Duke科学公司
荧光聚苯乙烯标准品500nm Duke科学公司
锥虫蓝 Invitrogen

[0181] 对于第一个试验，在开始前24小时，将J774细胞以6×104/孔的密度接种到24孔板(工作体积1mL)上。为了测定巨噬细胞的吞噬速率，制备浓度为0.1mg和3mg以及0.2％香豆素-6/5mL的PEC95和PEC99纳米粒混悬剂。另外，通过应用1％PVA溶液作为稳定剂，制备更大的PEC95型纳米粒。作为阴性对照，板上有6孔不用巨噬细胞处理。为了与纳米粒混悬剂温育，将剩余孔中的介质吸出，并且在加入10％小鼠血清和PBS下，加入一式三份的PEC95-NP 0.1mg(137nm)和3mg(239nm)和PEC99-NP 0.1mg(133nm)和3mg(283nm)。在0.1mg和3mg PEC-NP一式三份中，每种在孔中的终浓度为16μg/mL，并且另外一种一式三份的3mg的PEC-NP终浓度为480μg/ml。温育在温育器中在37℃下进行1小时。在温育期的最后，将对照细胞中的混悬剂和介质吸出并且用PBS洗涤两次。为了猝灭细胞表面的荧光纳米粒，将细胞与0.4％锥虫蓝温育5分钟，并且用PBS洗涤两次。随后，加入100μL胰蛋白酶，并且旋转孔板以除去孔板上的巨噬细胞。在细胞中加入200μL低聚甲醛∶FACS流(1∶1)，并且将样品转移至玻璃管中，并且通过FACS分析。

[0182] 第一个试验的目的是分析载药的PEC99和PEC95纳米粒在相同浓度下是否有吞噬作用的差异。结果如图9所示。在减去盲探针(blind probe)(即未处理细胞)的荧光后，显示的荧光值相应于荧光测定的算术平均值。结果表明，细胞内的荧光主要取决于所应用的纳米粒浓度。

[0183] 第二个试验的目的是通过FACS分析与加入荧光聚苯乙烯纳米粒(其是标准的聚合物纳米粒)后的荧光相比，温育PEC99和PEC95后巨噬细胞的荧光。该试验在4℃和37℃下进行。为了应用进一步抑制活性吞噬过程的可能性，将37℃试验的某些细胞与吞噬抑制剂NaN3温育。因此，制备60mM NaN3溶液，例如通过将39mg NaN3溶于10mL超纯水中。

[0184] 试验开始前24小时，以6×104/孔的密度将细胞接种于两个24孔板上。然后，制备载有0.2％香豆素-6的浓度为0.1mg和3mg/5mL的PEC95和PEC99纳米粒混悬剂。

[0185] 在开始试验前1小时，将一个孔板置于4℃的冰箱中。在开始试验前3小时，，将在37℃贮存的其它板中的一半细胞在吸出介质后用500μL NaN3和500μL介质补充(NaN3的终浓度：30mMol/L)。在NaN3溶液中温育3小时后，分别在4℃贮存1小时，开始细胞试验。因此，将孔中的介质吸出(除了盲样)。向在4℃冷却的板上的每个孔中加入PEC-NP0.1mg(108nm)、PEC-95 3mg(285nm)、PEC-99 0.1mg(110nm)和PEC-99 3mg(297nm)的混悬剂。在对所有样品加入10％小鼠血清和PBS缓冲液后，孔中PEC纳米粒的终浓度为16μg/mL。另外，在加入10％小鼠血清和PBS下，在不同的孔中加入尺寸为100nm和500nm的荧光聚苯乙烯标准品。孔中标准品的终浓度为20μg/mL。

[0186] 在37℃下贮存的细胞分别在用NaN3处理的一侧(一半)和未用NaN3处理的一侧(一半)同样用颗粒制备。

[0187] 在加入颗粒后，细胞在4℃或37℃温育下1小时，然后吸出混悬剂，用PBS洗涤两次，并且在加入0.4％锥虫蓝后，温育5分钟。之后，将细胞再次用PBS洗涤、用胰蛋白酶处理并且用FACS流∶低聚甲醛(参见以上)转移至玻璃管中。

[0188] FACS分析的结果如图10所示。在减去盲探针，即未处理的细胞的荧光后，显示的荧光值对应于荧光测定的算术平均值。荧光强度是纳米粒吞噬作用程度的一种量度。聚苯乙烯标准品显示了有吞噬作用出现(37℃，无抑制剂)的条件下预期的高水平荧光，以及吞噬作用被抑制/延缓(4℃或加入NaN3)情况下的低荧光。因此，聚苯乙烯纳米粒被有效吞噬，这使得它们在体内被巨噬细胞快速消除，从而在生物学上不稳定。本发明的PEC纳米粒的结果表现出非常不同的特点，因为在吞噬作用被抑制/延缓时没有显著差异(参见在4℃和用NaN3的结果)。

[0189] 特别是对于更小的纳米粒，聚苯乙烯-NP和PEC-NP之间的吞噬作用差异很大，如当比较“PEC95 16μg/mL 108nm 37℃”和“PEC99 16μg/mL110nm 37℃”的低荧光值(＝低的吞噬作用水平)与“聚苯乙烯20μg/mL 100nm 37℃”的高荧光值(＝高的吞噬作用水平)时所得到的。因此，根据本发明的PEC纳米粒较少被巨噬细胞攻击，从而允许应用PEC纳米粒作为非肠道贮库，通过生物降解来释放包封的药理学活性剂，并且使得药理学活性剂分别在整个或更长的释放期间全身可利用。另外，结果表明，较小的PEC纳米粒比较大的PEC纳米粒更少被吞噬。