一种植物转基因的方法

摘要

本发明公开了一种植物转基因的方法，包括利用可见的标记初步筛选在添加有选择压的培养基上诱导的愈伤组织，将阳性愈伤组织进行悬浮培养，再从悬浮培养的细胞团中再生出转化植株。本发明提供的转基因方法应用于苹果转基因，转化植株再生率达到了33％，转化植株再生时间由原来的8周缩短到了4周。

权利要求

1.一种植物转基因方法在苹果转基因育种中的应用，包括如下步骤：

1）将刻伤的苹果无菌苗幼嫩叶片置于携带有GFP基因的农杆菌工程菌液中浸泡8～

15分钟，将叶片转移至再生培养基上，黑暗共培养2～3天，再将叶片转接添加了选择压的再生培养基，黑暗培养2～3周；

2）将携带绿色荧光蛋白的愈伤组织切成小块，接种至添加了抑菌抗生素的液体悬浮培养基中，黑暗振荡培养20～30天，悬浮培养物用120μm筛网过滤，滤液离心后弃上清，沉淀加入新鲜的添加了抑菌抗生素的液体悬浮培养基进行增殖培养10～20天；

3）将悬浮培养液中的细胞团转接到再生培养基，黑暗培养2周，将携带绿色荧光蛋白的愈伤组织转接到添加了抑菌抗生素的再生培养基，光照培养4周，获得转化植株，其中，-1

所述再生培养基为：以MS为基本培养基，添加3.0～5.0mg·l 6-苄基腺嘌呤、0.3～-1 -1 -1 -1

0.5mg·l 萘乙酸、3.0mg·l TDZ，30g·l 蔗糖和0.6g·l 琼脂，高压灭菌前pH为5.8；

-1

所述液体悬浮培养基为：以MS为基本培养基，添加1.0～1.5mg·l 6-苄基腺嘌呤、-1 -1

2.0mg·l 2,4-二氯苯氧乙酸，30g·l 蔗糖，高压灭菌前pH为5.8。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的苹果无菌苗为叶片诱导的再生苗。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的再生苗按如下步骤获得：取增殖培养基上继代培养20～30天的苹果试管苗顶部展开嫩叶，在无菌操作台上用手术刀片垂直叶片主脉横切2-3刀，不伤及叶缘，将叶片转到再生培养基上，23～27℃，暗培养2周，随后转到光下培养3-4周，获得再生小植株，-1

其中，所述的增殖培养基为：以MS为基本培养基，添加0.5～1.0mg·l 6-苄基腺嘌-1 -1呤、0.01～0.05mg·l 萘乙酸，30g·l 蔗糖，高压灭菌前pH为5.8。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苹果选自嘎拉、昌红、长富2或姬神。

-1

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抑菌抗生素为200mg·l 的头孢噻肟。

说明书

一种植物转基因的方法

技术领域

[0001] 本发明属于果树遗传转化技术领域，具体涉及一种利用细胞悬浮培养系统和GFP标记高效获得苹果转化植株的方法。

背景技术

[0002] 目前，病虫害日益猖獗，苹果生产面临着严峻的考验，急需培育品质优良的抗病新品种。由于苹果杂交育种实生苗童期长、基因重组不易控制和性状分离等难题，通过传统杂交育种的方法难于获得抗病新品种，利用基因工程技术获得抗病的转基因苹果则是有效的育种途径之一。

[0003] 苹果的转化技术始自上世纪八十年代，迄今已将一些功能基因导入苹果中。但研究表明这些功能基因的整合与表达特性却差异显著。Faize等发现只有约15％的转化植株中功能基因得到强烈表达，而有55％的转化植株则未检测到与对照植株的差异。研究表明这是由于功能基因插入位点的随机性和其完整性在不同转化植株中的差异造成的。因此深入探查苹果转化过程中外源基因的整合与表达特性，对于构建高效质粒载体，推动苹果基因工程育种的发展具有重要意义。而如何建立稳定高效的苹果基因转化体系，快速获得规模化的转化植株群体，则成为这一研究的首要先决条件。

[0004] 当前可行的苹果转化方法主要是农杆菌介导的叶片转化，现有技术程序为：苹果划伤叶片在根癌农杆菌菌液中浸泡后，转移到固体培养基上共培养3天，将根癌农杆菌侵染后的苹果叶片转到添加了相应抗生素的固体增殖培养基上进行抗性筛选，培养约1～3个月后，获得完整的转基因植株。James等研究表明苹果的转化效率很低，一般只有1-3％，难以获得大量转化植株群体。究其原因主要因为现有的苹果转化技术存在以下难以调和的矛盾：在较低的抗性筛选压下，虽然可获得大量再生植株，但多为未转化的植株或嵌合体，很难获得转化植株；提高抗性筛选压，虽然再生植株中转化植株的比率增大，但植株再生受到抑制，再生率迅速降低至5％以下。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种植物转基因的方法。

[0006] 该植物转基因方法，包括利用可见的标记初步筛选在添加有选择压的培养基上诱导的愈伤组织，将阳性愈伤组织进行悬浮培养，再从悬浮培养的细胞团中再生出转化植株。

[0007] 其中，愈伤组织是通过将无菌苗的叶片刻伤后诱导获得。

[0008] 其中，所述的标记为绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。

[0009] 其中，在悬浮培养过程中，还包括用120μm筛网过滤去除大的细胞团，使得增殖获得的细胞团来源均一化。

[0010] 本发明的另一个目的是提供该转基因方法在苹果转基因育种中的应用。具体包括如下步骤：

[0011] 1)将刻伤的苹果无菌苗幼嫩叶片置于携带有GFP基因的农杆菌工程菌液中浸泡8～15分钟，将叶片转移至再生培养基上，黑暗共培养3天，在将叶片转接添加了选择压的再生培养基，黑暗培养2～3周；

[0012] 2)将携带绿色荧光蛋白的愈伤组织切成小块，接种至添加了抑菌抗生素的液体悬浮培养基中，黑暗振荡培养20～30天，再将培养物用120μm筛网过滤后，滤液离心去上清后，加入新鲜的添加了抑菌抗生素的液体悬浮培养基进行增殖培养10～20天；

[0013] 3)将悬浮培养液中的细胞团转接到再生培养基，黑暗培养2周，将携带绿色荧光蛋白的愈伤组织转接到添加了抑菌抗生素的再生培养基，光照培养4周，获得转化植株，[0014] 其中

[0015] 所述再生培养基为：以MS为基本培养基，添加3.0～5.0mg·l-16-苄基腺嘌呤、-1 -1 -1 -10.3～0.5mg·l 萘乙酸、3.0mg·l TDZ，30g l 蔗糖和0.6g l 琼脂，高压灭菌前pH为
5.8；

[0016] 所述液体悬浮培养基为：以MS为基本培养基，添加1.0～1.5mg·l-16-苄基腺嘌-1 -1呤、2.0mg·l 2，4-二氯苯氧乙酸，30g l 蔗糖，高压灭菌前pH为5.8。

[0017] 其中，步骤1)所述的苹果无菌苗优选为再生苗，按如下步骤获得：

[0018] 取增殖培养基上继代培养20～30天的苹果试管苗顶部展开嫩叶，在无菌操作台上用手术刀片垂直叶片主脉横切2-3刀，不伤及叶缘。将叶片转到植株再生培养基上，23～27℃，暗培养2周，随后转到光下培养3-4周，获得再生小植株。所述的增殖培养基为：以MS-1 -1 -1
为基本培养基，添加0.5～1.0mg·l 6-苄基腺嘌呤、0.01～0.05mg·l 萘乙酸，30g·l蔗糖，高压灭菌前pH为5.8。

[0019] 其中，所述的苹果优选为嘎拉、昌红、长富2或姬神等品种。

[0020] 所述的选择压可根据转化质粒上所用的筛选标记基因而定，如卡那霉素或潮霉-1素，优选浓度为10～30mg·l 。

[0021] 其中，所述的抑菌抗生素选自羧苄青霉素、头孢霉素或头孢噻肟，优选为-1200mg·l 的头孢噻肟。

[0022] 本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

[0023] 1)细胞悬浮培养系统，既可实现细胞的快速增殖，而且可对转化细胞进行纯化，保证了转化愈伤组织的均一性。

[0024] 由于叶片中不与筛选培养基接触的细胞可能再生形成愈伤组织，或者由于转化细胞团对未转化细胞的保护，从而导致逃逸植株或未转化植株的形成，极大的降低了苹果的转化效率。本发明利用细胞悬浮培养系统，在继代培养时，通过筛网过滤去除了大的细胞团，使得增殖获得的细胞团来源均一化，保证了转化愈伤组织的高度纯和。同时在愈伤组织增殖前通过荧光检查进一步去除了非转化或嵌合的愈伤组织。确保了在植株再生阶段在没有抗性筛选压下再生的植株均为转化植株。

[0025] 2)转化植株再生阶段完全避免了抗生素筛选的抑制作用，保证规模化转化植株的获得

[0026] 根癌农杆菌介导的苹果转化成功要求既要保证转化植株的正常生长，又要抑制非转化植株。然而实际情况是抗性筛选在抑制非转化植株生长的同时，转化植株的生长也受到了不同程度的抑制，导致转化效率的降低甚至失败。本发明利用细胞悬浮培养系统，获得均一化的转化愈伤组织，避免了非转化细胞的干扰，所以在植株再生阶段可完全避免抗生素筛选，保证了规模化转化植株的获得。

[0027] 3)材料选择的控制，保证了转化细胞具有较高的植株再生能力

[0028] 悬浮培养可快速增殖细胞，有利于获得大量再生植株。然而研究表明苹果悬浮细胞的植株再生能力与细胞来源密切相关。本发明首次采用叶片再生的小植株嫩叶，进一步提高了悬浮细胞的植株再生能力，在再生培养基上转化愈伤组织可再生3个以上丛生的转化植株，转化植株再生率达到了33％，转化植株再生时间由原来的8周缩短到了4周。

附图说明

[0029] 图1为根癌农杆菌介导苹果转化的植物表达载体质粒图谱。

[0030] 图2为根癌农杆菌介导转化嘎拉苹果研究结果图。

[0031] 图3为嘎啦苹果转基因抗性植株中gfp的PCR检测图。

[0032] 图4为嘎啦苹果转基因抗性植株荧光观察及RT-PCR检测图。

具体实施方式

[0033] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0034] 实施例1

[0035] 以苹果品种‘嘎啦’为受体进行转基因，包括如下步骤：

[0036] (1)取增殖培养基上继代培养25天的‘嘎拉’苹果试管苗顶部刚展开嫩叶，在无菌操作台上用手术刀片垂直叶片主脉横切2-3刀，不伤及叶缘，并转到植株再生培养基上，诱导获得再生小植株。

[0037] (2)将导入了质粒的根癌农杆菌于YEB固体培养基上划线，27±2℃，黑暗条件下培养，然后挑取单菌落接种于YEB液体培养基中，27±2℃，黑暗条件下振荡培养12小时得到工程菌液。其中，所述的质粒图谱如图1所示。

[0038] (3)取再生小植株嫩叶，采用前述方法切伤，然后加入到工程菌液中侵染8分钟，取出后转移到植株再生培养基上，共培养3天。将叶片转移到筛选培养基(植株再生培养-1基添加10mg·l 卡那霉素)上，25±2℃，黑暗条件下培养2周诱导愈伤组织。

[0039] (4)将诱导获得的愈伤组织在荧光显微镜下观察，并标记转化的愈伤组织。然后将转化愈伤组织切成约0.1mm小块，转到液体悬浮培养基中，25±2℃，黑暗条件在100rpm转速下振荡培养20天。将培养物用120μm不锈钢筛网过滤，滤液离心去上清后，加入新鲜液体悬浮培养基，增殖培养15天。

[0040] (5)将悬浮培养液中的小细胞团转到再生培养基(植株再生培养基添加-1200mg·l 头孢噻肟)上，25±2℃，黑暗条件下培养2周。在荧光显微镜下选取有绿色-1
荧光的愈伤组织，转到新鲜再生培养基(植株再生培养基添加200mg·l 头孢噻肟)上，
25±2℃，光下培养4周，获得再生转化植株。

[0041] 所述增殖培养基组成为：以MS为基本培养基，添加0.5mg·l-1BA(6-苄基腺嘌呤)、-1 -1 -10.01mg·l NAA(萘乙酸)、30g·l 蔗糖和0.6g·l 琼脂，高压灭菌前pH为5.8。

[0042] 所述植株再生培养基组成为：以MS为基本培养基，添加3.0mg·l-1BA(6-苄基腺嘌-1 -1 -1 -1呤)、0.5mg·l NAA(萘乙酸)、3.0mg·l TDZ，30g·l 蔗糖和0.6g·l 琼脂，高压灭菌前pH为5.8。

[0043] 所述液体悬浮培养基组成为：以MS为基本培养基，添加1.0mg·l-1BA(6-苄基腺嘌-1 -1 -1呤)、2.0mg·l 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、200mg·l 头孢噻肟，30g·l 蔗糖，高压灭菌前pH为5.8。

[0044] 以gfp为报告基因，nptII作为筛选标记基因，‘嘎拉’苹果根据上述转化步骤进行试验，共获得96棵转化植株，转化植株再生率为30.6％。

[0045] 图2所示为根癌农杆菌介导转化嘎拉苹果研究结果。其中，A：‘嘎拉’苹果叶片再生小植株及其嫩叶；B：‘嘎拉’嫩叶共培养后在筛选培养基上培养2周获得转化愈伤组织；C：转化愈伤组织在悬浮培养体系中可快速增殖；D：荧光观察表明悬浮培养的小细胞团为均一的转化愈伤组织团；E：悬浮培养增殖的转化愈伤组织团转到植株再生培养基上诱导植株再生；F：植株再生培养基上再生的转化植株。

[0046] 将获得的‘嘎拉’苹果抗性苗进行PCR鉴定，扩增引物序列如SEQ ID No.1和2所示，方法同(Doyle and Doyle，1990)，结果如图3所示。

[0047] 图3所示为‘嘎拉’苹果转基因抗性植株中gfp的PCR检测图。其中，M：DNA marker；1-2：非转化植株(阴性对照)；3～6：各苹果转基因抗性植株。PCR扩增后获得gfp特异的624bp带，初步证实gfp已导入苹果转基因抗性植株中。

[0048] 对PCR呈阳性的转化植株进行荧光检测和gfp基因的RT-PCR表达分析，扩增引物序列如SEQ ID No.1和2所示，结果如图4所示。

[0049] 图4所示为‘嘎拉’苹果转基因抗性植株荧光观察及RT-PCR检测图。其中，A：转化植株在荧光显微镜下观察具有绿色荧光；B：苹果转化植株的RT-PCR检测，M：DNAmarker；1-2：非转化植株(阴性对照)；3～6：各苹果转基因抗性植株。结果表明，转基因植物能正常表达外源的GFP基因，并能显示绿色的荧光信号，表明在转基因植株体内能表达GFP蛋白，

[0050] 实施例2

[0051] 以苹果品种‘昌红’为受体进行转基因，包括如下步骤：

[0052] (1)取增殖培养基上继代培养20天的‘昌红’苹果试管苗顶部刚展开嫩叶，按实施例1的方法切伤，并转到植株再生培养基上，诱导获得再生小植株。

[0053] (2)将导入了携带有GFP标记的质粒的根癌农杆菌按实施例1方法培养得到工程菌液。

[0054] (3)取再生小植株嫩叶，切伤，然后加入到工程菌液中侵染15分钟，取出后转移到-1植株再生培养基上，共培养2天。将叶片转移到筛选培养基(植株再生培养基添加15mg·l卡那霉素)上，25±2℃，黑暗条件下培养3周诱导愈伤组织。

[0055] (4)将诱导获得的愈伤组织在荧光显微镜下观察，并标记转化的愈伤组织。然后将转化愈伤组织切成约0.3mm小块，转到液体悬浮培养基中，25±2℃，黑暗条件在100rpm转速下振荡培养30天。将培养物用120μm不锈钢筛网过滤，滤液离心去上清后，加入新鲜液体悬浮培养基中，增殖培养20天。

[0056] (5)将悬浮培养液中的小细胞团转到再生培养基(植株再生培养基添加-1200mg·l 头孢噻肟)上，25±2℃，黑暗条件下培养2周。在荧光显微镜下选取有绿色-1
荧光的愈伤组织，转到新鲜再生培养基(植株再生培养基添加200mg·l 头孢噻肟)上，
25±2℃，光下培养6周，获得再生转化植株。

[0057] 所述增殖培养基组成为：以MS为基本培养基，添加1.0mg·l-1BA(6-苄基腺嘌呤)、-1 -1 -10.05mg·l NAA(萘乙酸)、30g·l 蔗糖和0.6g l 琼脂，高压灭菌前pH为5.8。

[0058] 所述植株再生培养基组成为：以MS为基本培养基，添加5.0mg·l-1BA(6-苄基腺嘌-1 -1 -1 -1呤)、0.3mg·l NAA(萘乙酸)、3.0mg·l TDZ，30g·l 蔗糖和0.6g·l 琼脂，高压灭菌前pH为5.8。

[0059] 所述液体悬浮培养基组成为：以MS为基本培养基，添加1.5mg·l-1BA(6-苄基腺嘌-1 -1 -1呤)、2.0mg·l 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、200mg·l 头孢噻肟，30g·l 蔗糖，高压灭菌前pH为5.8。

[0060] ‘昌红’苹果根据上述转化步骤进行试验，共获得82棵转化植株，转化植株再生率为29％。对其中16株转化植株进行PCR和RT-PCR分析，结果表明gfp基因已转入到苹果植株中，并得到有效表达。

[0061] 实施例3

[0062] 以苹果品种‘长富2’为受体进行转基因，包括如下步骤：

[0063] (1)取增殖培养基上继代培养25天的‘长富2’苹果试管苗顶部刚展开嫩叶，按实施例1的方法切伤，并转到植株再生培养基上，诱导获得再生小植株。

[0064] (2)将导入了GFP标记的质粒的根癌农杆菌按实施例1的方法培养得到工程菌液。

[0065] (3)取再生小植株嫩叶，切伤，然后加入到工程菌液中侵染12分钟，取出后转移到-1植株再生培养基上，共培养3天。将叶片转移到筛选培养基(植株再生培养基添加15mg·l卡那霉素)上，25±2℃，黑暗条件下培养2周诱导愈伤组织。

[0066] (4)将诱导获得的愈伤组织在荧光显微镜下观察，并标记转化的愈伤组织。然后将转化愈伤组织切成约0.2mm小块，转到液体悬浮培养基中，25±2℃，黑暗条件在100rpm转速下振荡培养20天。将培养物用120μm不锈钢筛网过滤，滤液离心去上清后，加入新鲜液体悬浮培养基中，增殖培养10天。

[0067] (5)将悬浮培养液中的小细胞团在转到再生培养基(植株再生培养基添加-1200mg·l 头孢噻肟)上，25±2℃，黑暗条件下培养2周。在荧光显微镜下选取有绿色荧光-1
的愈伤组织，转到新鲜再生培养基(植株再生培养基添加200mg l 头孢噻肟)上，25±2℃，光下培养8周，获得再生转化植株。

[0068] 所述增殖培养基组成为：以MS为基本培养基，添加0.8mg·l-1BA(6-苄基腺嘌呤)、-1 -1 -10.01mg·l NAA(萘乙酸)、30g·l 蔗糖和0.6g·l 琼脂，高压灭菌前pH为5.8。

[0069] 所述植株再生培养基组成为：以MS为基本培养基，添加4.0mg·l-1BA(6-苄基腺嘌-1 -1 -1 -1呤)、0.4mg·l NAA(萘乙酸)、3.0mg·l TDZ，30g·l 蔗糖和0.6g·l 琼脂，高压灭菌前pH为5.8。

[0070] 所述液体悬浮培养基组成为：以MS为基本培养基，添加1.2mg·l-16-BA(6-苄基腺-1 -1 -1嘌呤)、2.0mg·l 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、200mg·l 头孢噻肟，30g·l 蔗糖，高压灭菌前pH为5.8。

[0071] ‘长富2’苹果根据上述转化步骤进行试验，共获得58棵转化植株，转化植株再生率为33％。对其中12株转化植株进行PCR和RT-PCR分析，结果表明gfp基因已转入到苹果植株中，并得到有效表达。

[0072] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。