毛萼乙素在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用

摘要

本发明涉及毛萼乙素在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。毛萼乙素在制备治疗感染性疾病药物中的应用。本发明优点在于：本发明为毛萼乙素发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域；本发明的毛萼乙素安全无毒，药效明显，预示着很好的药用前景；毛萼乙素能够抑制细胞因子相关的JAK/STAT传导通路的活化，特异性地抑制EAE小鼠体内具有致病性的Th1和Th17细胞分化；同时对于NF-κB信号通路异常活化有抑制作用，改变炎症微环境组分的炎性基因转录；并且完全抑制过继移植小鼠的EAE病情，从而对EAE小鼠起到有效的治疗和预防作用。上述研究预示着毛萼乙素具有很好的治疗自身免疫性疾病及感染性疾病的药用前景。

权利要求

1.毛萼乙素在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的毛萼乙素在制备治疗自身免疫性脑脊髓炎疾病药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的自身免疫性疾病是Th1或Th17细胞相关的自身免疫性疾病。

说明书

毛萼乙素在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种中药提取物的应用，具体地说，是毛萼乙素在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

背景技术

[0002] 自身免疫性疾病、感染性疾病有着类似的发病机制，都存在炎症反应失控。多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一种主要累及中枢神经系统的自身免疫性疾病。患者往往从中青年时期就开始起病，多数患者会伴随进行性的神经功能障碍而逐渐残疾，丧失劳动能力给家庭和社会带来沉重的经济负担。多发性硬化的病理特征为中枢神经系统炎性浸润以及由之导致的白质脱髓鞘。自身抗原反应性效应T细胞的异常激活所导致的炎症反应与疾病的发生和发展有着密切的关系。经胸腺选择的CD4+T细胞处于未致敏的亚群分化前状态，称为幼稚T细胞（naïve T cells），位于外周免疫器官（脾脏和淋巴结）内。在特殊抗原的刺激下，幼稚T细胞将分化为各种效应T细胞，是介导适应性免疫应答的主要细胞，负责清除入侵机体的病原体，但他们的异常激活也会导致各种组织炎症。根据分泌的细胞因子和生物学功能，CD4＋ T辅助细胞主要分为三个亚群：Th1，Th2，和Th17。Th1细胞主要分泌前炎性细胞因子，包括干扰素γ(interferonγ，IFNγ)，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)和白介素2（interleukin2，IL2）等，IFNγ可以通过自分泌的方式促进Th1细胞的分化。Th1细胞介导细胞免疫反应，通过活化巨噬细胞清除胞内病原微生物。Th2细胞主要分泌细胞因子白介素4（interleukin4，IL4），负责清除胞外微生物。Th17细胞主要产生IL17家族的细胞因子，通过招募中性粒细胞至感染部位，使机体抵御致病或非致病的细胞外病原微生物。Th1和Th17细胞在诱发器官特异性自身免疫病和慢性感染等疾病的发病中起着重要的作用。另外，幼稚T细胞还可以分化成调节性T细胞（Treg）。Treg细胞特征性地表达转录因子Foxp3，主要行使免疫抑制功能，负责维持机体的免疫耐受以及防止自身免疫反应的发生。

[0003] 小 鼠 实 验 性 自 身 免 疫 性 脑 脊 髓 炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是由CD4+ T辅助细胞介导的自身免疫性疾病，典型病征为中枢神经系统炎性浸润和白质脱髓鞘。EAE小鼠被广泛接受为人类自身免疫性多发性硬化的疾病模型，是研发炎症性疾病，尤其是自身免疫性疾病药物以及探索相关药理机制的有力工具。EAE可以通过髓鞘蛋白类似物，如髓少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）或者自身抗原特异性T细胞对相应遗传易感性的动物进行诱导发病。

[0004] 目前，自身免疫性疾病的治疗方案多为皮质类固醇激素和各种类型的免疫抑制剂，如甲氨喋呤、米托蒽醌、环磷酰胺等。但是，这些经典治疗方案对于疾病的缓解程度往往很有限，并且可能产生较为明显的毒副作用，包括肺部，肝脏毒性以及骨髓抑制。寻找更为安全有效且具有针对性的药物具有十分重要的意义。

[0005] 我国中药资源丰富，是筛选疾病治疗药物的珍贵宝库。毛萼乙素是一种从我国西南部特产的植物，毛萼香茶菜属（Isodon eriocalyx）疏花毛萼香茶菜(Isodon eriocalyx var. laxiflora)中分离得到的对映贝壳杉烯类二萜化合物。已有基础研究显示，包括毛萼乙素在内的许多二萜类化合物能直接干扰NF-κB与靶DNA序列的结合能力，从而抑制NF-κB信号通路的活化。NF-κB在自身免疫与炎症相关疾病中的重要致病作用促使我们着手研发毛萼乙素在自身免疫性和感染性疾病制药领域中的应用潜力。

[0006] 中国专利文献200510110089.8公开了一种毛萼乙素在制药中的应用，该发明涉及毛萼乙素在制备治疗急性白血病药物中的应用，和毛萼乙素在制备治疗伯基特淋巴瘤药物中的应用。中国专利文献200710041559.9公开了β-抑制蛋白1在调节T细胞存活和自身免疫中的应用。但是关于毛萼乙素在制备治疗自身免疫性和感染性疾病药物中的应用目前还未见报道。

发明内容

[0007] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供毛萼乙素在制备治疗自身免疫性疾病和感染性疾病药物中的应用。

[0008] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：毛萼乙素在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

[0009] 所述的毛萼乙素在制备治疗多发性硬化疾病药物中的应用。

[0010] 所述的毛萼乙素在制备治疗自身免疫性脑脊髓炎疾病药物中的应用。

[0011] 所述的自身免疫性疾病是Th1或Th17细胞相关的自身免疫性疾病。

[0012] 毛萼乙素在制备治疗感染性疾病药物中的应用。

[0013] 本发明的目的是通过以下技术方法来实现的：

[0014] （一）实验动物：

[0015] C57BL/6小鼠购自中国科学院上海实验动物中心，动物饲养于上海交通大学医学院实验动物科学部〔SCXK（沪）2009-0021〕无特殊病原体环境中。

[0016] （二）试剂：

[0017] 毛萼乙素（纯度>99%）溶解于DMSO中，储存液浓度为100mM，-20℃保存。Th1、Th17检测抗体购自BD Bioscience。调节性T细胞（Treg）检测试剂盒购自eBioscience公司。细胞因子（IFNγ、TNF、IL2、IL6、IL17、IL4和 IL10）检查采用试剂盒（BD CBA Th1/Th2/Th17）购自BD Bioscience。抗Jak2和抗Try221磷酸化Jak2，抗STAT1和抗Try701磷酸化STAT1，抗IκB，抗P65和抗Ser536磷酸化P65抗体均购自Cell Signaling公司，抗STAT3和抗Try705磷酸化STAT3，抗STAT4和抗Try693磷酸化STAT4抗体购自BD Bioscience公司。

[0018] （三）EAE的诱导和评估：

[0019] MOG抗原35-55位的氨基酸序列为：Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr- Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys，由吉尔生化有限公司合成（上海，中国），纯度大于95%。操作步骤为：第一天，小鼠皮下注射含有300μg MOG35-55肽段和5mg/ml热灭活的结核分支杆菌H37Ra的完全弗氏佐剂（CFA），以及每只小鼠尾静脉注射200ng百日咳毒素（PT）。第三天，再次每只小鼠尾静脉注射200ng PT。模型诱导后每天观察小鼠EAE病情，按照发病的严重程度进行打分，具体是：0分：无异常表现；1分：尾部无力；2分：后肢受累，无力，跛行；3分：后肢完全瘫痪；4分：双后肢瘫痪并前肢受累；5分：垂死或死亡。

[0020] （四）EAE的过继移植：

[0021] 按上述方法对小鼠进行EAE诱导，在模型建立的第十天，取模型小鼠的外周免疫器官（脾脏和淋巴结），制成细胞悬液。在含MOG35-55(20g/ml)的完全培养基中，分别加毛7
萼乙素（0.25mM）或者溶剂对照（DMSO）进行处理。培养三天后，将细胞按每只小鼠2×10个通过尾静脉注入同品系经半致死剂量（400cGy）照射的小鼠体内。在模型诱导的第一和第三天分别给予每只小鼠尾静脉注射200 ng百日咳毒素。EAE的病程评分如上所述。

[0022] （五）组织切片化学染色（H&E）：

[0023] 免疫后29天的EAE小鼠经PBS心脏灌注后用4%多聚甲醛进行内固定，取出脊髓组织，石蜡包埋、切片，苏木素-伊红染色（H&E）或者Luxol Fast Blue髓鞘染色。

[0024] H&E染色的具体步骤是：

[0025] A. 二甲苯，5min。

[0026] B. 100%酒精，5min。

[0027] C. 95%酒精，5min。

[0028] D. 70%酒精，5min。

[0029] E. 蒸馏水浸泡，5min。

[0030] F. 苏木精，5min。

[0031] G. 流水冲洗。

[0032] H. 氨水，润洗。

[0033] I. 流水冲洗。

[0034] J. 伊红，1min。

[0035] K. 95% 酒精，1min。

[0036] L. 100% 酒精，1min；重复一次。

[0037] M. 二甲苯 1min；重复一次。

[0038] N. 封片。

[0039] Luxol Fast Blue染色的具体步骤是：

[0040] A. 二甲苯，5min。

[0041] B. 100% 酒精，5min。

[0042] C. 95% 酒精，5min。

[0043] D. Luxol fast blue 染液，60℃，过夜。

[0044] E. 95% 酒精，润洗。

[0045] F. 蒸馏水，润洗。

[0046] G. 碳酸锂溶液，5sec。

[0047] H. 70% 酒精，10sec。

[0048] I. 蒸馏水，润洗。

[0049] J. 重复步骤G~I，直到脊髓灰质和白质的颜色达到最佳对比。

[0050] K. 70% 酒精，润洗。

[0051] L. 结晶紫溶液，1min。

[0052] M. 蒸馏水，润洗。

[0053] N. 脱水。

[0054] O. 透明。

[0055] P. 封片。

[0056] （六）细胞培养：

[0057] 无菌环境下取小鼠脾脏或淋巴结，研磨后通过70μm cell strainer（购自BD Bioscience）过滤，制备单细胞悬液。经红细胞裂解液（0.15M NH4Cl、10mM KHCO3、0.1 mM EDTA，pH 7.2~7.4）作用1分钟后立即用两倍体积的培养基中和以去除红细胞。加抗原MOG（20μg/ml）或者不加抗原刺激，细胞培养于完全RPMI1640培养基（含10%胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，5mM 2-巯基乙醇和100单位/ml青霉素和链霉素）。

[0058] （七）细胞增殖实验：

[0059] 小鼠脾脏单细胞重悬于完全培养基中，调整细胞浓度至5×106/ml。在96 孔平底细胞培养板中每孔加入100μl细胞悬液，加抗原MOG（20μg/ml）刺激，在含5% CO2的37℃3 3
培养箱中培养72 h，最后16～18 h每孔加入1μCi H-甲基胸腺嘧啶（[H]-TdR）。培养时间到达时，将细胞摄取的同位素转移到玻璃纤维素膜（Wallac，Finland）上。膜烘干后加
3
入闪烁液，放入Wallac MicroBeta 1450 液闪计数仪上检测细胞内掺入DNA中的 H-TdR的放射性相对数量（cpm）。

[0060] （八）流式细胞仪淋巴细胞亚群分析：

[0061] 检测Th1/Th17淋巴细胞亚群时，脾脏细胞以每孔1×106个/ 200μl培养在96孔平底板中，加抗原MOG（20μg/ml）刺激24小时，在最后5小时用佛波酯(Phorbol myfismte acetate，PMA) (50ng/ml)和离子霉素(ionomycin，Ion) (500 ng/ml)联合刺激，同时每孔加入0.2μl GolgiPlug。按BD Bioscience公司的说明依次进行细胞膜表面和胞内分子的染色。检测调节性T（Treg）淋巴细胞亚群时，每个样本取相同的脾脏细胞，按eBioscience公司Mouse Regulatory T Cell Staining Kit的说明依次进行细胞膜表面和胞内分子的染色。标记好的细胞洗涤后使用BD LSRⅡ流式细胞仪检测分析。

[0062] （九）细胞因子检测：

[0063] 将脾细胞重悬于完全培养基中，调整细胞浓度至每孔5×105个/ 200μl，加抗原MOG（20μg/ml）刺激，接种于96孔圆底板，在含5% CO2的37℃培养箱中培养48 h后，收集培养上清。按BD Bioscience公司的CBA Kit说明书进行操作，使用BD LSRⅡ 流式细胞仪检测培养上清中各种细胞因子的浓度。

[0064] （十）免疫印迹分析：

[0065] 用BIO-RAD垂直电泳槽进行SDS-PAGE分离，分离胶浓度为6～10%，浓缩胶5%。电泳条件：浓缩胶恒压80V，分离胶恒压110V。待指示剂溴酚蓝泳至凝胶边缘即终止电泳，取出凝胶用于转印。通过Mini Trans-Blot® (Bio-Rad) 转印仪把凝胶上的蛋白质区带转移至0.45μm孔径的聚偏氟乙烯（Hydrophobic polyvinylidene difluoride，PVDF）膜（GE healthcare）上。转印电压100V，4℃转印1h。转印终止后取出转印膜，用封闭液室温封闭
1h。洗涤后在用封闭液稀释后的一抗中4℃温和振摇过夜。TBST洗涤3次后，将膜放入稀释的HRP-二抗中室温作用1h，TBST洗涤4次，免疫复合物用辣根过氧化物酶化学发光检测试剂盒（millipore）检测。

[0066] （十一）统计分析：

[0067] 实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。P值小于0.05则认为具有统计学差异。所有的统计采用GraphPad Prism 5 Demo软件。

[0068] 在这份研究中，我们使用了髓少突胶质细胞糖蛋白肽段35-55(myeloid oligodendrocyte glycoprotein，MOG 35-55)诱导的小鼠EAE疾病模型。小鼠起病前或者起病后开始给药的实验结果均显示，毛萼乙素可有效缓解小鼠EAE病情，降低发病率以及延迟起病时间。多发性硬化患者和EAE小鼠中都发现有中枢神经系统的炎性浸润以及由之介导的脊髓白质脱髓鞘。通过分析给药组与溶剂对照组EAE小鼠的脊髓病理组织切片，我们发现毛萼乙素给药后，小鼠脊髓的炎性浸润明显减少，由之介导的白质脱髓鞘也明显减轻。

[0069] 细胞因子在驱动幼稚T细胞的分化过程中发挥关键作用。IFNγ和 IL12是促进向Th1细胞方向分化的前炎症细胞因子，其中，IFNγ以正反馈的形式促进Th1细胞分化，与之相似，IL4也以自分泌的形式促进Th2细胞分化。而对于Th17细胞分化，IL6的刺激至关重要。自身抗原反应性效应T细胞的异常激活对于多发性硬化症以及EAE的发病有重要作用。在发病的高峰期，多发性硬化患者和EAE小鼠体内的IFNγ水平都明显上升，随着病情的缓解，IFNγ也相应下降。此外，过继移植分泌IFNγ的自身反应性Th1可以诱导正常小鼠爆发类似的EAE症状。所以，早期的研究认为这类疾病主要由失调的自身反应性的Th1细胞导致。近年来，新发现的T辅助细胞亚群Th17也被证实与诸多自身免疫性疾病的发病有关。其分泌的特征性细胞因子IL17参与激活多种炎症反应通路，并且可以诱导其他前炎症细胞因子以及趋化因子的分泌。在多发性硬化患者和发病的EAE小鼠体内，IL17的分泌水平也有所上升，并且，过继移植分泌IL17的自身抗原反应性Th17也同样可以诱导EAE发病。因此，Th1和Th17对于多发性硬化以及EAE都有重要的致病作用。调节性T细胞是维持机体免疫平衡的重要环节，可以通过分泌抗炎性细胞因子IL10抑制T辅助细胞的过度活化，在诸多自身免疫病患者中都发现调节性T细胞亚群的减少。Th2细胞的正常生理功能是清除胞外微生物，在哮喘和许多过敏性疾病的发病中多有Th2型细胞因子IL4和IL5大量分泌。我们的检测发现，在EAE发病高峰期，毛萼乙素处理组小鼠外周淋巴器官（脾脏）中T细胞针对自身抗原MOG的增殖反应性显著低于溶剂对照组小鼠。由此可以看出，毛萼乙素可抑制自身反应性T细胞的增殖。为了研究究竟是对哪些T细胞亚群起作用，我们对脾脏中的CD4+T细胞做进一步胞内染色分析，结果发现毛萼乙素给药后CD4+T细胞中具有致病能力的Th1和Th17细胞亚群的比例较溶剂对照组明显减少，而具有免疫抑制功能的Treg亚群分布不受影响。细胞因子的检测结果也显示相同的变化趋势：与溶剂对照组相比，毛萼乙素给药组中由致病性Th1细胞分泌的IFNγ、TNF、IL2和Th17细胞分泌的IL17的水平都明显下调；而与Treg相关的细胞因子IL10和与Th2相关的细胞因子IL4的分泌水平没有明显变化。上述实验结果说明，毛萼乙素治疗抑制EAE小鼠自身抗原特异性的T细胞增殖，并且特异性地降低自身反应性Th1和Th17效应T细胞的亚群比例，并降低相应的炎性细胞因子的表达水平，而对Treg与Th2细胞亚群无明显调变作用。

[0070] JAK/STAT家族成员是传递胞外细胞因子信号的主要分子，细胞因子受体偶联的Janus家族酪氨酸激酶（Janus family tyrosine kinases，JAKs）受前炎性（pro-inflammatory）细胞因子激活后，发生磷酸化，进一步激活相应的下游信号转导和转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)。受IFNγ激活的STAT1和受IL12激活的STAT4促进Th1细胞分化，IFNγ–STAT1通路还可以发挥正反馈的效应增强分泌IFNγ的Th1细胞的生成。Th17的分化主要受前炎性细胞因子IL6的调节，IL6与膜表面受体结合后，磷酸化激活JAK/STAT3信号转导，启动Th17细胞分化相关的基因转录。接着我们进一步探索毛萼乙素对胞内信号通路的影响。取给药组和溶剂组EAE小鼠脾脏细胞进行JAK/STAT相关蛋白免疫印迹分析发现：与正常小鼠相比，虽然这些蛋白的总蛋白水平没有明显调变，但EAE发病小鼠体内STAT1和STAT3的磷酸化水平明显上升，但经过毛萼乙素治疗后，两者的磷酸化水平都大幅下调；同时STAT4和它们的上游激酶JAK2的磷酸化水平也在毛萼乙素治疗组的小鼠中明显减低。这些结果提示，毛萼乙素通过阻滞JAK/STAT信号通路，抑制致病性Th1和Th17细胞分化。

[0071] 除了JAK/STAT通路，我们还研究了核因子κB（NF-κB）信号通路。NF-κB信号通路参与许多免疫和炎症反应，并在诱导T辅助细胞分泌细胞因子中起重要作用。在正常情况下，NF-κB以一种无活性的形式与其抑制性蛋白(inhibitory protein kappa B，IκB)相结合，存在于胞浆中。炎症等刺激因素可以通过一个或多个信号途径使IκB降解，从而使得NF-κB与之解离，由胞浆移位至胞核，与DNA上启动子区域相应的靶基因位点结合，启动一系列免疫相关的基因转录。抑制NF-κB的过度活化可以有效控制包括由感染、自身免疫性疾病等引起的许多炎症反应。外周免疫器官内NF-κB的激活对于EAE的发病至关重要，Th1细胞分泌的前炎性细胞因子IL2和TNF的表达受NF-κB的调控，同时他们又能够进一步激活NF-κB。诱导Th17细胞分化的IL6也是NF-κB的靶基因。IL17是Th17细胞分泌的前炎性细胞因子，它可以通过激活NF-κB以正反馈的形式促进IL6的表达。这些以NF-κB为核心的细胞因子调控网在放大炎症反应中具有重要作用。

[0072] 免疫印迹分析证明，毛萼乙素通过降低p65的磷酸化水平以及抑制IκB的降解，对NF-κB的活化进行了抑制。与之相对应，我们检测了MOG刺激后小鼠脾细胞培养上清中对于幼稚T细胞向致病性Th17和Th1/或非致病性的Th2效应T细胞分化有促进作用的细胞因子分泌水平。实验结果显示，与溶剂对照组相比，给药组中分别促进幼稚T细胞向致病性Th1和Th17细胞分化的前炎症细胞因子IFNγ和IL6的水平明显下调，由Th1细胞分泌的炎症细胞因子IL2和TNF以及Th17细胞分泌的IL17的表达水平也在给药组小鼠中有明显的下调，反映毛萼乙素对于EAE小鼠体内前炎症细胞因子有广泛的抑制效应。由此推论，毛萼乙素治疗有效降低了EAE小鼠体内NF-κB信号通路的异常活化，并且基于此改变了外周免疫器官的炎症微环境，影响T辅助细胞的分化，进一步放大其抗炎作用。

[0073] 综上所述，我们发现毛萼乙素可有效缓解小鼠EAE病情。给药治疗后，EAE小鼠外周免疫器官中的JAK/STAT通路受到抑制，从而受此通路调控的Th1和Th17细胞比例明显下调。同时毛萼乙素对NF-κB活性也有抑制作用，并由此阻滞对EAE发病有重要作用的前炎性细胞因子的分泌以及放大炎症反应的正反馈效应，从调节效应T细胞炎性微环境的角度协同抑制EAE的发病。此外，过继移植经过毛萼乙素处理后的MOG反应性T细胞，完全丧失使受体小鼠发病的致病性，反应了毛萼乙素可以去除自身抗原反应性T细胞的致病能力，进一步证实了毛萼乙素对于EAE具有保护作用。

[0074] 实验结果提示毛萼乙素可能具有多重的抗炎性质，因此预示着很好的治疗自身免疫性疾病及感染性疾病的药用前景。

[0075] 本发明优点在于：

[0076] 1、本发明为毛萼乙素发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域；

[0077] 2、本发明的毛萼乙素安全无毒，药效明显，预示着很好的药用前景；

[0078] 3、毛萼乙素能够抑制细胞因子相关的JAK/STAT转导通路的活化，特异性地抑制EAE小鼠体内具有致病性的Th1和Th17细胞分化；对于NF-κB信号通路异常活化有抑制作用，改变炎症微环境组分的炎性基因转录；可以完全抑制过继移植小鼠的EAE病情，预示着很好的治疗自身免疫性疾病及感染性疾病的药用前景。

附图说明

[0079] 图1显示毛萼乙素的化学结构。

[0080] 图2A显示毛萼乙素治疗方案改善小鼠EAE病情。建立EAE小鼠模型，待起病后（模型建立后的第11天），将小鼠随机分组，分别每天腹腔注射给予溶剂（200μl/小鼠，溶剂对照组，n=8）或者毛萼乙素（给药组，n=10），剂量为10mg毛萼乙素/kg体重，连续18天，每天观察小鼠状态，根据发病程度进行临床评分，P<0.05，具有显著差异。

[0081] 图2B显示毛萼乙素预防方案改善小鼠EAE病情。将小鼠随机分组后，在EAE模型建立的当天开始每天分别给予溶剂（200μl/小鼠，溶剂对照组，n=8）或者毛萼乙素（给药组，n=6剂量为10mg毛萼乙素/kg体重，连续28天，每天观察小鼠状态，根据发病程度进行临床评分，P<0.05，具有显著差异。

[0082] 图3A显示正常小鼠，EAE发病小鼠溶剂组与给药组脊髓病灶部位H&E组织切片染色。毛萼乙素治疗结束后，对EAE小鼠脊髓病灶部位的切片进行H&E染色，在光学显微镜下放大400倍观察。正常小鼠无炎性浸润，溶剂组小鼠脊髓的血管周组织存在大量细胞炎性浸润，而毛萼乙素治疗组小鼠的相应部位炎性浸润明显减少。

[0083] 图3B显示正常小鼠，EAE发病小鼠溶剂组与给药组脊髓病灶部位Luxol Fast Blue髓鞘组织切片染色。毛萼乙素治疗结束后，对EAE小鼠脊髓病灶部位的切片进行Luxol Fast Blue染色。在光学显微镜下放大400倍观察。正常小鼠无脱髓鞘病变，溶剂组小鼠脊髓的白质部分大量缺失，白质间空泡明显增多，而毛萼乙素治疗组小鼠相应部位的白质多保持完整，仅有少量缺失。

[0084] 图4A显示正常小鼠，EAE发病小鼠溶剂组与毛萼乙素给药组小鼠外周免疫器官（脾脏）对自身抗原反应的增殖能力，用增殖系数（Stimulation Index，SI），即MOG刺激后3 3
细胞 H摄入量与细胞自发 H摄入量的比值表示。正常小鼠脾细胞对MOG刺激无反应性；溶剂组小鼠EriB脾细胞对MOG刺激增殖反应性强；处理组小鼠脾细胞对MOG的反应性显著低于溶剂组小鼠，***P<0.001，具有显著差异。

[0085] 图4B显示溶剂组与给药组EAE小鼠Th1、Th17和Treg比例。对小鼠脾脏中的CD4+T细胞做胞内染色分析，结果显示给药组小鼠CD4+T细胞中以IFNγ为表面标志的Th1细胞和以IL17为表面标志的Th17细胞亚群的比例较溶剂组明显减少，而以Foxp3为表面标志的Treg细胞亚群的比例没有明显变化。

[0086] 图5显示免疫印迹检测正常小鼠，EAE发病小鼠溶剂组与毛萼乙素给药组小鼠体内JAK/STAT通路。与正常小鼠相比，EAE发病小鼠溶剂组中Th1分化相关的STAT1和Th17分化相关的STAT3磷酸化水平明显上调，毛萼乙素给药后它们的磷酸化大幅下调，STAT4以及它们的上游激酶JAK2的磷酸化水平也有所下调。这些蛋白的总蛋白水平没有调变。

[0087] 图6A显示溶剂组与给药组EAE小鼠体内炎性相关细胞因子浓度。与溶剂组相比，毛萼乙素给药组小鼠中Th1细胞相关的前炎症细胞因子IFNγ 、TNF 、IL2和Th17细胞相关的前炎症细胞因子IL17、IL6、分泌水平明显下调；促进向Th2效应T细胞分化的细胞因子IL4的水平有轻微的上升；Treg细胞相关的抗炎性细胞因子IL10的水平没有明显变化，* P<0.05, ** P<0.01，具有显著差异。

[0088] 图6B显示免疫印迹检测正常小鼠，EAE发病小鼠溶剂组与毛萼乙素给药组小鼠体内NF-κB通路。与正常小鼠相比，EAE发病小鼠溶剂组中NF-κB的活化形式磷酸化p65的水平明显上调，其上游抑制物IκBα的表达水平明显下调。毛萼乙素给药组中磷酸化p65的水平明显下调，与之相对应，其上游抑制物IκBα的表达水平明显上调。

[0089] 图7显示过继移植小鼠临床评分。单纯移植 MOG反应性T细胞的受体鼠爆发了典型的EAE症状，平均最高临床评分为3.75±0.43，而经过毛萼乙素处理后细胞移植的受体小鼠完全没有发病。

具体实施方式

[0090] 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

[0091] 实施例1 毛萼乙素缓解小鼠EAE病情

[0092] （A）治疗方案：

[0093] 建立EAE小鼠模型，待起病后（模型建立后的第11天），将小鼠随机分组，分别每天腹腔注射给予溶剂（200μl/小鼠，溶剂对照组，n=8）或者毛萼乙素（给药组，n=10），剂量为10mg毛萼乙素/kg体重，连续18天，每天观察小鼠状态，根据发病程度进行临床评分。溶剂对照组小鼠均爆发出典型的EAE病情，平均最高临床评分达到3.81±0.34，而给药组平均最高临床评分为2.80±0.29。

[0094] （B）预防方案：

[0095] 将小鼠随机分组后，在EAE模型建立的当天开始每天分别给予溶剂（200μl/小鼠，溶剂对照组，n=8）或者毛萼乙素（给药组，n=6），剂量为10mg毛萼乙素/kg体重，连续28天，每天观察小鼠状态，根据发病程度进行临床评分。溶剂对照组小鼠都爆发出典型的EAE病情，平均起病时间为模型建立后的第12.75±0.75天，平均最高临床评分达到3.59±0.25，而给药组仅有66.7%的小鼠发病，平均最高临床评分也降低为1.75±0.56。此外，给药组的平均起病时间也延迟到模型建立后的第17.25±2.29天。

[0096] 治疗和预防方案的临床评分分别如图2A和图2B所示，数据以平均数±标准差的形式表示 (* P<0.05)。治疗和预防方案的结果均显示，毛萼乙素给药可显著地抑制小鼠的EAE病情。

[0097] 实施例2 毛萼乙素治疗后EAE小鼠脊髓病理观察

[0098] （A）H&E染色

[0099] 对正常小鼠，EAE发病小鼠溶剂组与给药组脊髓病灶部位进行H&E组织切片染色。正常小鼠无炎性浸润，溶剂组小鼠脊髓的血管周组织存在大量细胞炎性浸润，而毛萼乙素治疗组小鼠的相应部位炎性浸润明显减少。

[0100] （B）Luxol Fast Blue染色

[0101] 对正常小鼠，EAE发病小鼠溶剂组与给药组脊髓病灶部位进行Luxol Fast Blue髓鞘组织切片染色。正常小鼠无脱髓鞘病变，溶剂组小鼠脊髓的白质部分大量缺失，白质间空泡明显增多，而毛萼乙素治疗组小鼠相应部位的白质多保持完整，仅有少量缺失，与H&E染色切片中炎性浸润明显减少相对应。

[0102] H&E和Luxol Fast Blue的染色结果分别如图3A和图3B所示。正常小鼠无炎性浸润和脱髓鞘病变，溶剂对照组中均可观察到脊髓组织出现的大量炎性浸润，脊髓白质的正常结构被严重破环。毛萼乙素治疗组中，小鼠脊髓的炎性病灶和白质脱髓鞘区域都显著减少。以上结果表明，毛萼乙素治疗可以显著改善EAE小鼠中枢神经系统炎性浸润，从而保护髓鞘白质。

[0103] 实施例3 毛萼乙素抑制EAE小鼠自身抗原特异性T细胞增殖和分化[0104] 特定的炎症微环境和对应的抗原刺激下，幼稚CD4+T被激活，并分化成为各种辅助性T细胞（Th），介导效应作用。在EAE发病中Th1和Th17细胞具有致病作用，调节性T细胞（Treg）对应EAE的发病具有抑制作用。为揭示毛萼乙素保护EAE小鼠的机制，我们首先检测了在EAE发病高峰期EriB处理组和溶剂对照组小鼠体内针对自身抗原MOG刺激后的增殖能力，结果显示，正常小鼠对MOG无反应性；溶剂组小鼠EriB脾细胞对MOG刺激增殖反应性强；毛萼乙素处理组小鼠外周淋巴器官（脾脏）中T细胞对MOG的反应性显著低于溶剂对照组小鼠（图4A）。由此可以看出，体内给予毛萼乙素后，显著抑制了自身抗原特异性T细胞增殖。毛萼乙素可抑制自身反应性T细胞的增殖，为了研究毛萼乙素究竟是对哪些T细胞亚群起作用，我们对脾脏中的CD4+T细胞做胞内染色分析，结果发现毛萼乙素给药组小鼠外周淋巴器官（脾脏）CD4+T细胞中具有致病能力的Th1和Th17细胞亚群的比例较溶剂对照组明显减少，而Treg亚群分布不受影响（图4B）。上述实验结果说明，毛萼乙素治疗可以抑制EAE小鼠自身抗原特异性的T细胞增殖，并且特异性地降低自身反应性Th1和Th17效应T细胞的亚群比例，对Treg细胞亚群无明显调变作用。

[0105] 实施例4 毛萼乙素抑制EAE小鼠体内JAK/STAT信号通路

[0106] JAK/STAT家族成员是传递胞外细胞因子信号的主要分子，细胞因子受体偶联的Janus家族酪氨酸激酶（Janus family tyrosine kinases，JAKs）受前炎性（pro-inflammatory）细胞因子激活后，发生磷酸化，进一步激活相应的下游信号转导和转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)。受IFNγ激活的STAT1和IL12激活的STAT4在Th1细胞分化中发挥关键作用，IFNγ–STAT1通路还可以发挥正反馈的效应增强分泌IFNγ的Th1细胞的生成。Th17的分化主要受前炎性细胞因子IL6的调节，IL6与膜表面受体结合后，磷酸化激活JAK/STAT3信号转导，启动Th17细胞分化相关的基因转录。取给药组和溶剂组EAE小鼠脾脏细胞进行JAK/STAT相关蛋白免疫印迹分析发现：与正常小鼠相比，虽然这些蛋白的总蛋白水平没有明显调变，但EAE发病小鼠体内STAT1和STAT3的磷酸化水平明显上升，经过毛萼乙素治疗后，两者的磷酸化水平都大幅下调；同时STAT4和它们的上游激酶JAK2的磷酸化水平也在毛萼乙素治疗组的小鼠中明显减低（图5）。这些结果提示，毛萼乙素通过阻滞JAK/STAT信号通路，抑制致病性Th1和Th17细胞分化。

[0107] 实施例5毛萼乙素改变炎症微环境与抑制EAE小鼠NF-B信号通路相关[0108] 除了JAK/STAT通路，我们还研究了核因子κB（NF-κB）信号通路，NF-κB信号通路参与许多免疫和炎症反应，并在诱导T辅助细胞分泌细胞因子中起重要作用。在正常情况下，NF-κB以一种无活性的形式与其抑制性蛋白(inhibitory protein kappa B，IκB)相结合，存在于胞浆中。炎症等刺激因素可以通过一个或多个信号途径使IκB降解，从而使得NF-κB与之解离，由胞浆移位至胞核，与DNA上启动子区域相应的靶基因位点结合，启动一系列免疫相关的基因转录，抑制NF-κB的过度活化可以有效控制包括由感染、自身免疫性疾病等引起的许多炎症反应。外周免疫器官内NF-κB的激活对于EAE的发病至关重要， Th1细胞分泌的前炎性细胞因子IL2和TNF的表达受NF-κB的调控，同时他们又能够进一步激活NF-κB。诱导Th17细胞分化的IL6也是NF-κB的靶基因。IL17是Th17细胞分泌的前炎性细胞因子，它可以通过激活NF-κB以正反馈的形式促进IL6的表达。这些以NF-κB为核心的细胞因子调控网在放大炎症反应中具有重要作用。因此，我们进一步探索了毛萼乙素给药后对小鼠炎症微环境的改变是否与对NF-κB信号通路的影响相关。免疫印迹分析证明，毛萼乙素通过降低p65的磷酸化水平以及抑制IκB的降解，对NF-κB的活化进行了抑制。与之相对应，我们检测了MOG刺激后小鼠脾细胞培养上清中对于幼稚T细胞向致病性Th17和Th1/或非致病性的Th2效应T细胞分化有促进作用的前炎症细胞因子分泌水平。实验结果显示，与溶剂对照组相比，给药组中分别促进幼稚T细胞向致病性Th1和Th17细胞分化的前炎症细胞因子IFNγ和IL6的水平明显下调，由Th1细胞分泌的炎症细胞因子IL2和TNF以及Th17细胞分泌的IL17的表达水平也在给药组小鼠中有明显的下调（图6A），反映毛萼乙素对于EAE小鼠体内前炎症细胞因子有广泛的抑制效应。由此推论，毛萼乙素治疗有效降低了EAE小鼠体内NF-κB信号通路的异常活化，并且基于此改变了外周免疫器官的炎症微环境，影响T辅助细胞的分化，进一步放大其抗炎作用。

[0109] 实施例6 毛萼乙素抑制EAE小鼠MOG反应性T细胞的致病性

[0110] 过继移植EAE发病小鼠的MOG反应性T细胞可以诱导受体小鼠爆发同样的EAE病情，为确定毛萼乙素对于EAE的保护作用，我们进行了过继移植实验，取免疫后10天的EAE发病小鼠脾细胞，用MOG（20μg/ml）刺激培养3天，同时加入毛萼乙素或者溶剂对照处理。将培养后的两种细胞按相同的数量通过尾静脉注射入经半致死剂量照射的同品系C57BL/6小鼠内。实验结果显示，单纯移植 MOG反应性T细胞的受体鼠爆发了典型的EAE症状，平均最高临床评分为3.75±0.43，而移植经过毛萼乙素处理的脾细胞的受体小鼠完全没有发病（图7）。这进一步反应了毛萼乙素可以去除自身抗原反应性T细胞的致病能力，对于EAE具有保护作用。

[0111] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。