一种黄烷衍生物的用途转让专利
申请号 : CN201110246893.4
文献号 : CN102247353B
文献日 : 2013-03-20
发明人 : 崔承彬 , 李长伟 , 蔡兵 , 韩冰 , 李明明 , 范明
申请人 : 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
摘要 :
本发明涉及药用植物南酸枣所含黄酮与黄烷衍生物，其制备方法，以及这些化合物用于制备抗缺氧药物、抗缺氧保健品等功能性食品的用途。
权利要求 :
1.式III化合物或其药学上可接受的盐用于制备抗缺氧药物以及抗缺氧保健品的用途，
2.式III化合物或其药学上可接受的盐用于制备预防和/或治疗各种缺氧性疾病或改善和减轻低氧环境下与缺氧相关的各种不适症状的药物的用途。
3.药物组合物，其包含式III化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂；所述药物组合物用于预防和/或治疗各种缺氧性疾病或改善和减轻低氧环境下与缺氧相关的各种不适症状。
4.保健食品，其包含式III化合物或其药学上可接受的盐；所述保健食品用于预防和/或治疗各种缺氧性疾病或改善和减轻低氧环境下与缺氧相关的各种不适症状。
说明书 :
一种黄烷衍生物的用途
[0001] 本申请是基于申请号为200810211765.4，申请日为2008年9月24日，发明名称为“黄酮与黄烷衍生物的制备方法及其用途”的中国专利申请的分案申请。技术领域：
[0002] 本发明涉及药用植物南酸枣所含黄酮与黄烷衍生物的制备方法，以及这些化合物用于制备抗缺氧药物、抗缺氧保健品等功能性食品的用途。背景技术：
[0003] 氧在人的生命活动中是不可或缺的，在体内组织和细胞的能量代谢中氧分子发挥着重要作用。多种因素可导致人体组织和细胞的供氧不足，如某些疾病或身处特殊低氧环境(如高原)等，而缺氧又反过来可造成细胞、组织损伤乃至各种严重疾病，如严重的呼吸系统疾病以及并发的心脑血管疾病、免疫机能低下等。严重缺氧往往还成为许多相关危重病人死亡的直接原因。因此，抗缺氧剂的研究与开发受到关注。
[0004] 南酸枣Choerospondias axillaries(Roxb.)Burtt.et Hill.为漆树科南酸枣属植物，其树皮和果实入药(江苏新医学院编，中药大辞典，上册，上海，上海人民出版社，1977年，第397-398页和第1564页)，干燥果实已作为中药“广枣”收入我国2005年版药典(国家药典委员会，中华人民共和国药典，一部，北京，化学工业出版社，2005年，第29-30页)。南酸枣的化学成分有些已有报道，其粗提物、总黄酮或某些单体化合物的抗菌、抑制血小板聚集、抗肿瘤等活性也有报道(李长伟等；南酸枣的研究进展：解放军药学学报，2008年第24卷第3期，第231-234页)。此外，南酸枣果实总黄酮的缺氧保护作用也曾有文献记载(李增晞等；广枣总黄酮对动物耐缺氧和急性心肌缺血的保护作用：中草药，1984年第
15卷第6期，第25-27页)，但并未阐明其中抗缺氧活性成分。本发明涉及的从南酸枣中分离制备的黄酮及黄烷类化合物的抗缺氧活性及其用途至今未见报道。
发明内容：
15卷第6期，第25-27页)，但并未阐明其中抗缺氧活性成分。本发明涉及的从南酸枣中分离制备的黄酮及黄烷类化合物的抗缺氧活性及其用途至今未见报道。
发明内容：
[0005] 本发明旨在提供具有抗缺氧活性的黄酮与黄烷衍生物的制备方法，以及这些化合物作为抗缺氧剂的用途。
[0006] 本发明人发现药用植物南酸枣的含水醇浸膏、含水醇浸膏的乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及柱层析组分等具有很好的抗缺氧活性，并从中首次分离得到了具有抗缺氧活性的柚皮素-4′-O-(6″-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖)苷(式I化合物，以下又称作化合物I)、槲皮素-7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(式II化合物，以下又称作化合物II)、3′-O-没食子酰基花青素B-3(式III化合物，以下又称作化合物III)、(+)-儿茶素(6′-8)(+)-儿茶素(式IV化合物，以下又称作化合物IV)、dihydrodicatechin A(式V化合物，以下又称作化合物V)、gambiriinA3(式VI化合物，以下又称作化合物VI)、gambiriin A1(式VII化合物，以下又称作化合物VII)等七个黄酮与黄烷衍生物，其中化合物I为新化合物。
[0007]
[0008] 式I
[0009]
[0010] 式II
[0011]
[0012] 式III 式IV
[0013]
[0014] 式V 式VI 式VII
[0015] 本发明化合物I、II、III、IV、V、VI、VII可通过所含酚羟基等酸性基团与碱金属或碱土金属形成盐，或铵盐，也可以与镁、钙、铁等多价金属离子形成络合物或螯合物。
[0016] 因此，本发明的第一个方面涉及二氢黄酮类化合物I(式I化合物)或其药学上可接受的盐、络合物或螯合物及其用于制备抗缺氧药物、抗缺氧保健品等功能性食品中的用途。
[0017] 本发明的第二个方面涉及上述黄酮类化合物II(式II化合物)和黄烷衍生物类化合物III(式III化合物)、IV(式IV化合物)、V(式V化合物)、VI(式VI化合物)、VII(式VII化合物)或其药学上可接受的盐、络合物或螯合物用于制备抗缺氧药物、抗缺氧保健品等功能性食品中的用途。
[0018] 本发明的第三个方面涉及上述二氢黄酮类化合物I(式I化合物)、黄酮类化合物II(式II化合物)、黄烷衍生物类化合物III(式III化合物)、IV(式IV化合物)、V(式V化合物)、VI(式VI化合物)和VII(式VII化合物)或其药学上可接受的盐、络合物或螯合物类的制备方法，所述方法包括用醇或含水醇对植物原料如南酸枣进行提取，再经过分离纯化得到目标化合物。
[0019] 本发明进一步的方面涉及化合物I(式I化合物)。
[0020] 本发明更进一步的方面涉及抗缺氧药物组合物，其包含一种或多种上述化合物I、II、III、IV、V、VI、VII，或其药学上可接受的盐、络合物或螯合物，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
[0021] 本发明的第五个方面涉及抗缺氧保健品等功能性食品，其含有上述一种或多种化合物I、II、III、IV、V、VI、VII，或其药学上可接受的盐、络合物或螯合物。
[0022] 具体来说，上述化合物I、II、III、IV、V、VI和VII的制备方法如下：用含水醇浸泡提取药用植物南酸枣材料，获得含有上述化合物的粗浸膏，再用常规分离手段纯化得到粗浸膏中的上述化合物。
[0023] 所述含水醇是的含水乙醇，优选的是60％～95％(v/v)的含水乙醇。所述的常规分离手段包括天然产物化学领域的专业人士所熟知的液-液萃取、柱层析、薄层层析、高效液相层析及重结晶等。
[0024] 本发明采用大鼠嗜铬细胞瘤PCI2细胞，用MTT法测试评价了上述化合物I、II、III、IV、V、VI、VII的抗缺氧活性。经实验证实，上述化合物对PCI2细胞的缺氧损伤均具有很好保护作用。
[0025] 因此，本发明的上述化合物I、II、III、IV、V、VI、VII均可作为抗缺氧剂用于防治各种缺氧性疾病或改善和减轻低氧环境下与缺氧相关的各种不适症状。
[0026] 本发明化合物可以单独使用或组合使用，也可与药学上可接受的各种载体、赋形剂或辅料配伍，制成抗缺氧药物用于防治缺氧引起的各种病症，或可以制成具有抗缺氧功能的保健品或食品添加剂，用于预防、改善或减轻缺氧条件下的各种症状。
[0027] 本发明中的术语“药学上可接受的盐”是指药用无机或有机盐。化合物I、II、III、IV、V、VI、VII中所含酚羟基等酸性基团可以使化合物与碱金属或碱土金属形成药用盐，也可以形成药用铵盐，优选但不限于铵(或胺)盐、钠盐、钾盐、镁盐或钙盐。本发明中的术语“药学上可接受的络合物或螯合物”是指药用金属络合物或螯合物，优选但不限于镁、钙、铁等金属络合物或螯合物。
[0028] 本发明的化合物可以单独或以药物组合物的形式给药。给药途径可以是口服、非肠道或局部给药。药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。
[0029] 本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。
[0030] 当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
[0031] 当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
[0032] 本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
[0033] 另外需要指出，本发明化合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、各种提取物或各种化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。具体实施方式：
[0034] 下列实施例将进一步说明本发明，但并不对本发明构成任何限制。
[0035] 在以 下 实 施例 中，称 为化 合 物I的 是 二氢 黄 酮 类化 合 物“柚 皮素-4′-O-(6″-O-没食子酰基-β-D-葡萄吡喃糖)苷，即式I化合物”；称为化合物II的是黄酮苷类化合物“槲皮素-7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷，即式II化合物”；称为化合物III的是没食子酰基花青素类化合物“3′-O-没食子酰基花青素B-3，即式III化合物”；称为化合物IV的是花青素类化合物“(+)-儿茶素(6′-8)(+)-儿茶素，即式IV化合物”；称为化合物V的是二聚儿茶素类化合物“dihydrodicatechin A，即式V化合物”；称为化合物VI的是一个查尔-儿茶素类化合物“gambiriin A3，即式VI化合物”，称为化合物VII的是另一个查尔-儿茶素类化合物“gambiriin A1，即式VII化合物”。
[0036]
[0037] 式I
[0038]
[0039] 式II
[0040]
[0041] 式III 式IV
[0042]
[0043] 式V 式VI 式VII
[0044] 实施例1.化合物I的分离制备
[0045] 南 酸 枣 Choerospondias axillaries(Roxb.)Burtt.et Hill.的 干 燥 树 皮3.2kg(1999年8月采自云南勐腊地区)粉碎后用市售医用乙醇室温浸提，每次用95％(V/V)的含水乙醇25升浸泡7天，共提4次，合并提取液，减压浓缩干燥，得乙醇提取物750g。
该乙醇提取物750g悬浮于3升水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各种溶剂每次用
3升，分别各萃取4次，合并相同萃取液，减压浓缩干燥，得到氯仿萃取物60g、乙酸乙酯萃取物310g、正丁醇萃取物300g和水层残留物80。
该乙醇提取物750g悬浮于3升水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各种溶剂每次用
3升，分别各萃取4次，合并相同萃取液，减压浓缩干燥，得到氯仿萃取物60g、乙酸乙酯萃取物310g、正丁醇萃取物300g和水层残留物80。
[0046] 取乙酸乙酯萃取物100g，用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(乙酸乙酯中柱床7.0cm×50cm)，用不同体积比的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩干燥，得到四个层析粗组分：E-1(4g，乙酸乙酯洗脱部分)、E-2(35g，乙酸乙酯-甲醇9∶1洗脱部分)、E-3(25g，乙酸乙酯-甲醇1∶1洗脱部分)和E-4(15g，甲醇洗脱部分)。
[0047] E-3(25g)用适量甲醇溶解，加入适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(柱床3.8cm×50cm)，用氯仿-甲醇(4∶1)溶剂系统洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩干燥，得三个组分E-3-1、E-3-2和E-3-3。将其中E-3-2(1.5g)用适量体积百分数90％的乙醇水溶解后进行Sephadex LH-20柱层析(柱床2.8cm×27cm)，用相同体积百分数90％的乙醇水洗脱得化合物I粗品，再经体积百分数30％的甲醇水溶液中重结晶精制得化合物I纯品(517mg)。
[0048] 化合物I为白色结晶型粉末(甲醇)，熔点为160-162℃。正离子ESI-MS m/+ + +z：587[M+H]，609[M+Na]，625[M+K]，与其分子组成C28H26O4相应分子量586一致。
1
H-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：7.29(1H，d，J＝8.4Hz，2 ′，6′ -H)，7.10(2H，s，2″ ″，
6″″-H)，7.06(1H，d，J＝8.4Hz，3′，5′-H)，5.90(1H，d，J＝2.0Hz，6-H)，5.88(1H，d，J＝2.0Hz，8-H)，5.31(1H，dd，J＝2.8，12.8Hz，2-H)，4.91(1H，d，J＝7.6Hz，1″-H)，
4.61(1H，dd，J＝2.0，12.0Hz，6″-Ha)，4.38(1H，dd，J＝8.4，12.0Hz，6″-Hb)，3.78(1H，m，5″-H)，3.38～3.55(3H，m，2″-4″-H)，3.07(1H，dd，J＝12.8，16.8Hz，3-H-transe)，
13
2.66(1H，dd，J ＝ 2.8，16.8Hz，3-H-cis). C-NMR(100MHz，MeOH-d4)δ：197.3(C-4)，
167.9(C-1′″)，167.6(C-7)，164.9(C-5)，164.3(C-8a)，158.5(C-4′)，146.0(C-3″″，
5″ ″)，139.4(C-4 ″ ″)，133.5(C-1′ )，128.4(C-2′，6 ′)，120.8(C-1 ″″ )，
117.1(C-3′，5′)，109.8(C-2″″，6″″)，102.9(C-4a)，101.5(C-1″)，96.6(C-6)，
95.8(C-8)，77.5(C-3″ )，75.1(C-5″ )，74.3(C-2″ )，71.5(C-4″ )，64.4(C-6″ )，
43.3(C-3).
1
H-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：7.29(1H，d，J＝8.4Hz，2 ′，6′ -H)，7.10(2H，s，2″ ″，
6″″-H)，7.06(1H，d，J＝8.4Hz，3′，5′-H)，5.90(1H，d，J＝2.0Hz，6-H)，5.88(1H，d，J＝2.0Hz，8-H)，5.31(1H，dd，J＝2.8，12.8Hz，2-H)，4.91(1H，d，J＝7.6Hz，1″-H)，
4.61(1H，dd，J＝2.0，12.0Hz，6″-Ha)，4.38(1H，dd，J＝8.4，12.0Hz，6″-Hb)，3.78(1H，m，5″-H)，3.38～3.55(3H，m，2″-4″-H)，3.07(1H，dd，J＝12.8，16.8Hz，3-H-transe)，
13
2.66(1H，dd，J ＝ 2.8，16.8Hz，3-H-cis). C-NMR(100MHz，MeOH-d4)δ：197.3(C-4)，
167.9(C-1′″)，167.6(C-7)，164.9(C-5)，164.3(C-8a)，158.5(C-4′)，146.0(C-3″″，
5″ ″)，139.4(C-4 ″ ″)，133.5(C-1′ )，128.4(C-2′，6 ′)，120.8(C-1 ″″ )，
117.1(C-3′，5′)，109.8(C-2″″，6″″)，102.9(C-4a)，101.5(C-1″)，96.6(C-6)，
95.8(C-8)，77.5(C-3″ )，75.1(C-5″ )，74.3(C-2″ )，71.5(C-4″ )，64.4(C-6″ )，
43.3(C-3).
[0049] 实施例2.化合物II和III的分离制备
[0050] 将实施例1中得到的南酸枣正丁醇萃取物300g用适量甲醇溶解，加适量大孔树脂AB-8吸附、干燥，上大孔树脂AB-8柱(水中柱床8.5cm×48cm)，用不同体积比的水-乙醇(100∶0→0∶100)梯度洗脱，根据薄层检测结果收集合并洗脱液，减压浓缩干燥，依洗脱流出顺序得两个水洗组分B-1(20g)、B-2(38g)和若干后续流出含水乙醇洗脱组分B-3(共计230g，水-乙醇90∶10→0∶100洗脱部分)。
[0051] 组分B-2(38g)用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(水中柱床7.5cm×18.5cm)，用不同体积比的水-丙酮梯度洗脱，根据薄层检测结果合并所收集的洗脱液，减压浓缩，得八个组分：B-2-1(10g，水洗脱部分)、B-2-2(2g，水洗脱部分)、B-2-3(1.5g，水-丙酮9∶1洗脱部分)、B-2-4(1.7g，水-丙酮9∶1洗脱部分)、B-2-5(2g，水-丙酮9∶1洗脱部分)、B-2-6(5g，水-丙酮7∶3洗脱部分)、B-2-7(5g，水-丙酮5∶5洗脱部分)和B-2-8(5g，丙酮洗脱部分)。B-2-2(2g)用适量水溶解，上Sephadex LH-20层析柱(柱床2.8cm×27cm)，用水-甲醇溶剂系统梯度洗脱，得到3个组分B-2-2-1(350mg，水-甲醇7∶3洗脱部分)、B-2-2-2(1.4g，水-甲醇4∶6甲醇洗脱部分)和B-2-2-3(200mg，甲醇洗脱部分)。B-2-2-3(200mg)再次经Sephadex LH-20柱层析，用水-甲醇2∶8洗脱，收集含化合物II的洗脱部分，减压浓缩并从甲醇中重结晶精制，化合物II(26mg)。
[0052] 化合物II为黄色结晶型粉末(甲醇)，熔点为173-175℃。ESI-MSm/z：465[M+H]+，- 1463[M-H]，与其分子组成C21H20O12相应分子量464一致；H-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：7.65(1H，br s，2 ′-H)，7.56(1H，d，J ＝8.2Hz，6 ′ -H)，6.78(1H，d，J＝ 8.2Hz，
5 ′ -H)，6.35(1H，d，J ＝ 2.0Hz，6-H)，6.62(1H，d，J ＝ 2.0Hz，8-H)，4.95(1H，d，J ＝
7.2Hz，1″-H)，3.84(1H，dd，J＝12.2，1.6Hz，6″-Ha)，3.63(1H，dd，J＝12.2，5.6Hz，
13
6″-Hb)，3.30-3.50(4H，m，2″-H～5″-H). C-NMR(100M Hz，MeOH-d4)δ：177.4(C-4)，
164.4(C-7)，162.1(C-5)，157.6(C-8a)，148.9(C-2)，148.7(C-3 ′ )，146.2(C-4 ′ )，
137.9(C-3)，123.9(C-1′)，121.8(C-6′)，116.2(C-2′)，116.1(C-5′)，102.3(C-4a)，
101.6(C-1 ″)，100.1(C-6)，95.5(C-8)，78.3(C-3 ″)，77.8(C-5 ″)，74.7(C-2 ″ )，，
71.2(C-4″)，62.4(C-6″)。
5 ′ -H)，6.35(1H，d，J ＝ 2.0Hz，6-H)，6.62(1H，d，J ＝ 2.0Hz，8-H)，4.95(1H，d，J ＝
7.2Hz，1″-H)，3.84(1H，dd，J＝12.2，1.6Hz，6″-Ha)，3.63(1H，dd，J＝12.2，5.6Hz，
13
6″-Hb)，3.30-3.50(4H，m，2″-H～5″-H). C-NMR(100M Hz，MeOH-d4)δ：177.4(C-4)，
164.4(C-7)，162.1(C-5)，157.6(C-8a)，148.9(C-2)，148.7(C-3 ′ )，146.2(C-4 ′ )，
137.9(C-3)，123.9(C-1′)，121.8(C-6′)，116.2(C-2′)，116.1(C-5′)，102.3(C-4a)，
101.6(C-1 ″)，100.1(C-6)，95.5(C-8)，78.3(C-3 ″)，77.8(C-5 ″)，74.7(C-2 ″ )，，
71.2(C-4″)，62.4(C-6″)。
[0053] 组分B-3(230g)用甲醇溶解后分批多次加入适量聚酰胺中吸附、干燥，进行聚酰胺柱层析(柱床7.0cm×50cm)，用乙醇-丙酮系统洗脱，主要分为乙醇洗脱部分(大部分物质)和丙酮洗脱部分(少量)，其丙酮洗脱部分继续反复进行Sephadex LH-20柱层析，用水-乙醇4∶6溶液洗脱，得到化合物III(84mg)。
[0054] 化合物III为棕色无定形粉末。正离子ESI-MS m/z：731[M+H]+，753[M+Na]+，+ 1769[M+K]，与其分子组成C37H30O16相应分子量730一致.H-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：6.92(2H，s，2″，6″-H)，6.61～6.86(6H，m，2′(u)，5′(u)，6′(u)，2′(t)，
5 ′ (t)，6 ′ (t)-H)，6.01(1H，br s，8(u)-H)，5.84(2H，br s，6(u)，6(t)-H)，5.38(1H，br s，3(t)-H)，5.29(1H，br s，2(t)-H)，4.54(1H，br s，2(u)-H)，3.98(2H，br s，3(u)，
13
4(u)-H)，2.89(1H，br s，4(t)-Ha)，2.52(1H，br s，4(t)-Hb). C-NMR(100MHz，MeOH-d4)δ：167.0(C-1′)，155～157(C-5(u)，7(u)，8a(u)，5(t)，7(t)，8a(t))，146.1(C-3′(t)，
4′(t))，145.7(C-4′(u))，145.5(C-3′(u))，145.5(C-3″，5″)，139.7(C-4 ″)，
131.8(C-1 ′ (u)，1 ′(t))，121.3(C-1 ″ )，120.5(C-6 ′(t))，119.3(C-6 ′ (u))，
115.9(C-5′(u))，115.8(C-2′(u)，2′(t))，114.9(C-5′(t))，110.1(C-8(t)，2″，
6 ″ )，102.5(C-4a(t))，101.2(C-4a(u))，96.8(C-6(t))，96.0(C-6(u))，95.8(C-8(u))，
82.6(C-2(u))，75.9(C-2(t))，74.8(C-3(u))，68.5(C-3(t))，34.6(C-4(u))，
30.3(C-4(t)).
5 ′ (t)，6 ′ (t)-H)，6.01(1H，br s，8(u)-H)，5.84(2H，br s，6(u)，6(t)-H)，5.38(1H，br s，3(t)-H)，5.29(1H，br s，2(t)-H)，4.54(1H，br s，2(u)-H)，3.98(2H，br s，3(u)，
13
4(u)-H)，2.89(1H，br s，4(t)-Ha)，2.52(1H，br s，4(t)-Hb). C-NMR(100MHz，MeOH-d4)δ：167.0(C-1′)，155～157(C-5(u)，7(u)，8a(u)，5(t)，7(t)，8a(t))，146.1(C-3′(t)，
4′(t))，145.7(C-4′(u))，145.5(C-3′(u))，145.5(C-3″，5″)，139.7(C-4 ″)，
131.8(C-1 ′ (u)，1 ′(t))，121.3(C-1 ″ )，120.5(C-6 ′(t))，119.3(C-6 ′ (u))，
115.9(C-5′(u))，115.8(C-2′(u)，2′(t))，114.9(C-5′(t))，110.1(C-8(t)，2″，
6 ″ )，102.5(C-4a(t))，101.2(C-4a(u))，96.8(C-6(t))，96.0(C-6(u))，95.8(C-8(u))，
82.6(C-2(u))，75.9(C-2(t))，74.8(C-3(u))，68.5(C-3(t))，34.6(C-4(u))，
30.3(C-4(t)).
[0055] 实施例3.化合物IV和V的分离制备
[0056] 将实施例1中经体积百分数95％乙醇提取后的药渣进一步用体积百分数60％的乙醇水室温浸提，每次用含水乙醇25升浸泡7天，共提3次，合并提取液，减压浓缩干燥，得含水乙醇提取浸膏90g。
[0057] 取该含水乙醇提取浸膏80g，用适量甲醇溶解，加聚酰胺150g吸附、干燥，上聚酰胺柱(水中装填250克聚酰胺，柱床8.5cm×22cm)，用水-乙醇-丙酮系统洗脱，根据薄层检测结果收集合并洗脱液，减压浓缩干燥，得到五个组分：WE-1(10g，水洗脱部分)、WE-2(17g，水洗脱部分)、WE-3(2g，水-乙醇体积比75∶25溶剂洗脱部分)、WE-4(15g，乙醇洗脱部分)和WE-5(20g，丙酮洗脱部分)。
[0058] WE-4(15g)用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(柱床4.5cm×50cm)，用不同体积比的乙酸乙酯-甲醇溶剂梯度洗脱，根据薄层检测结果
收集合并洗脱液，减压浓缩干燥，得到七个组分：WE-4-1(2.2g，乙酸乙酯洗脱部分)、WE-4-2(300mg，乙酸乙酯-甲醇20∶1洗脱部分)、WE-4-3(520mg，乙酸乙酯-甲醇20∶1洗脱部分)、WE-4-4(1.5g，乙酸乙酯-甲醇20∶1洗脱部分)、WE-4-5(2.8g，乙酸乙酯-甲醇15∶1洗脱部分)、WE-4-6(0.7g，乙酸乙酯-甲醇15∶1洗脱部分)、WE-4-7(4.5g，甲醇洗脱部分)。
收集合并洗脱液，减压浓缩干燥，得到七个组分：WE-4-1(2.2g，乙酸乙酯洗脱部分)、WE-4-2(300mg，乙酸乙酯-甲醇20∶1洗脱部分)、WE-4-3(520mg，乙酸乙酯-甲醇20∶1洗脱部分)、WE-4-4(1.5g，乙酸乙酯-甲醇20∶1洗脱部分)、WE-4-5(2.8g，乙酸乙酯-甲醇15∶1洗脱部分)、WE-4-6(0.7g，乙酸乙酯-甲醇15∶1洗脱部分)、WE-4-7(4.5g，甲醇洗脱部分)。
[0059] WE-4-6(0.7g)用适量氯仿-甲醇(体积比1∶1)溶液溶解上Sephadex LH-20层析柱，用氯仿-甲醇(1∶1)溶剂系统洗脱，主要洗脱流份经反复聚酰胺、Sephadex LH-20柱层析得到化合物IV(105mg)。WE-4-7(4.5g)进行聚酰胺柱层析(柱床2.8cm×30cm)，用乙酸乙酯-甲醇(3∶1)溶剂系统洗脱，根据薄层层析结果合并流分得到4个组分WE-4-7-1(1.2g)、WE-4-7-2(1.4g)、WE-4-7-3(1.1g)、WE-4-7-4(0.5g)，其中WE-4-7-4经反复聚酰胺、Sephadex LH-20柱层析得到化合物V(37mg)。
[0060] 化合物IV为棕色无定型粉末。ESI-MS m/z：579[M+H]+，596[M+NH4]+，577[M-H]-，与其分子组成C30H26O12相应分子量578一致.
[0061] 1H-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：6.71(1H，d，J＝2.0Hz，2′(t)-H)，6.70(1H，d，J＝8.0Hz，5′(t)-H)，6.82(1H，s，2′(u)-H)，6.64(1H，s，5′(u)-H)，6.59(1H，dd，J＝2.0，
8.0Hz，6′(t)-H)，6.08(1H，s，6(t)-H)，5.90(1H，d，J＝2.0Hz，8(u)-H)，5.82(1H，d，J＝
2.0Hz，6(u)-H)，4.78(1H，d，J＝6.0Hz，2(u)-H)，4.73(1H，d，J＝6.0Hz，2(t)-H)，4.01(1H，m，3(u)-H)，3.97(1H，m，3(t)-H)，2.73(1H，dd，J＝5.2，16.0Hz，4(t)-Ha)，2.66(1H，dd，J＝4.8，16.0Hz，4(u)-Ha)，2.60(1H，dd，J＝5.8，16.0Hz，4(t)-Hb)，2.42(1H，dd，J＝5.8，
13
16.0Hz，4(u)-Hb). C-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：157.3(C-7(u)，8a(u))，156.7(C-5(u))，
156.4(C-8a(t))，154.6(C-5(t))，153.0(C-7(t))，145.6(C-3 ′ (t)，4 ′ (t))，
145.5(C-3′(u)，4′(u))，132.2(C-1′(t))，131.6(C-1′(u))，126.2(C-6′(u))，
119.6(C-5 ′ (u))，119.1(C-6 ′ (t))，115.7(C-5 ′ (t))，114.3(C-2 ′ (t))，
114.0(C-2 ′ (u))，108.0(C-8(t)or 6(t))，100.5(C-4a(t))，100.1(C-4a(u))，
96.1(C-8(u)or 6(u))，95.7(C-6(t)or 8(t))，95.2(C-6(u)or 8(u))，81.7(C-2(t))，
79.9(C-2(u))，68.1(C-3(t))，67.6(C-3(u))，27.0(C-4(t))，26.3(C-4(u)).
8.0Hz，6′(t)-H)，6.08(1H，s，6(t)-H)，5.90(1H，d，J＝2.0Hz，8(u)-H)，5.82(1H，d，J＝
2.0Hz，6(u)-H)，4.78(1H，d，J＝6.0Hz，2(u)-H)，4.73(1H，d，J＝6.0Hz，2(t)-H)，4.01(1H，m，3(u)-H)，3.97(1H，m，3(t)-H)，2.73(1H，dd，J＝5.2，16.0Hz，4(t)-Ha)，2.66(1H，dd，J＝4.8，16.0Hz，4(u)-Ha)，2.60(1H，dd，J＝5.8，16.0Hz，4(t)-Hb)，2.42(1H，dd，J＝5.8，
13
16.0Hz，4(u)-Hb). C-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：157.3(C-7(u)，8a(u))，156.7(C-5(u))，
156.4(C-8a(t))，154.6(C-5(t))，153.0(C-7(t))，145.6(C-3 ′ (t)，4 ′ (t))，
145.5(C-3′(u)，4′(u))，132.2(C-1′(t))，131.6(C-1′(u))，126.2(C-6′(u))，
119.6(C-5 ′ (u))，119.1(C-6 ′ (t))，115.7(C-5 ′ (t))，114.3(C-2 ′ (t))，
114.0(C-2 ′ (u))，108.0(C-8(t)or 6(t))，100.5(C-4a(t))，100.1(C-4a(u))，
96.1(C-8(u)or 6(u))，95.7(C-6(t)or 8(t))，95.2(C-6(u)or 8(u))，81.7(C-2(t))，
79.9(C-2(u))，68.1(C-3(t))，67.6(C-3(u))，27.0(C-4(t))，26.3(C-4(u)).
[0062] 化合物V黄色结晶型粉末(甲醇)，熔点为196-198℃。ESI-MSm/z：577[M+H]+，+ - 1599[M+Na]，575[M-H]，与其分子组成C30H24O12相应分子量576一致.H-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：6.84(1H，d，J＝ 2.2Hz，2 ′ (t)-H)，6.78(1H，d，J＝ 8.0Hz，5 ′ (t)-H)，
6.73(1H，dd，J＝2.2，8.0Hz，6′(t)-H)，6.41(1H，s，5′(u)-H)，6.11(1H，s，6(t)-H)，
5.89(1H，d，J ＝ 2.6Hz，8(u)-H)，5.52(1H，d，J ＝ 2.6Hz，6(u)-H)，4.90(1H，d， 被水 峰 掩 盖，2(t)-H)，4.10(1H，m，3(t)-H)，3.96(2H，m，2(u)，3(u)-H)，2.92(1H，dd，J ＝ 5.8，14.4Hz，4(u)-Ha)，2.85(1H，dd，J ＝ 5.2，16.4Hz，4(t)-Ha)，2.67(1H，d，J ＝ 11.6Hz，2 ′ (u)-Ha)，2.52(1H，dd，J ＝ 9.0，14.4Hz，4(u)-Hb)，2.48(1H，d，J ＝
13
11.6Hz，2 ′ (u)-Hb). C-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：192.8(C-4 ′ (u))，166.7(C-7(t))，
164.9(C-5(t))，162.8(C-6 ′ (u))，156.7(C-8a(u))，156.4(C-7(u))，153.8(C-8a(t))，
155.0(C-5(u))，145.2(C-4 ′ (t))，145.0(C-3 ′ (t))，129.9(C-1 ′ (t))，
118.4(C-6 ′ (t))，115.0(C-5 ′ (t))，113.5(C-2 ′ (t))，111.5(C-5 ′ (u))，
104.3(C-8(t))，102.6(C-4a(t))，99.1(C-4a(u))，95.7(C-8(u))，94.4(C-6(u))，
94.0(C-3 ′ (u))，89.6(C-6(t))，88.5(C-1 ′ (u))，82.1(C-2(t))，78.1(C-2(u))，
66.5(C-3(t))，65.5(C-3(u))，44.3(C-2′(u))，27.0(C-4(u))，26.5(C-4(t))。
6.73(1H，dd，J＝2.2，8.0Hz，6′(t)-H)，6.41(1H，s，5′(u)-H)，6.11(1H，s，6(t)-H)，
5.89(1H，d，J ＝ 2.6Hz，8(u)-H)，5.52(1H，d，J ＝ 2.6Hz，6(u)-H)，4.90(1H，d， 被水 峰 掩 盖，2(t)-H)，4.10(1H，m，3(t)-H)，3.96(2H，m，2(u)，3(u)-H)，2.92(1H，dd，J ＝ 5.8，14.4Hz，4(u)-Ha)，2.85(1H，dd，J ＝ 5.2，16.4Hz，4(t)-Ha)，2.67(1H，d，J ＝ 11.6Hz，2 ′ (u)-Ha)，2.52(1H，dd，J ＝ 9.0，14.4Hz，4(u)-Hb)，2.48(1H，d，J ＝
13
11.6Hz，2 ′ (u)-Hb). C-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：192.8(C-4 ′ (u))，166.7(C-7(t))，
164.9(C-5(t))，162.8(C-6 ′ (u))，156.7(C-8a(u))，156.4(C-7(u))，153.8(C-8a(t))，
155.0(C-5(u))，145.2(C-4 ′ (t))，145.0(C-3 ′ (t))，129.9(C-1 ′ (t))，
118.4(C-6 ′ (t))，115.0(C-5 ′ (t))，113.5(C-2 ′ (t))，111.5(C-5 ′ (u))，
104.3(C-8(t))，102.6(C-4a(t))，99.1(C-4a(u))，95.7(C-8(u))，94.4(C-6(u))，
94.0(C-3 ′ (u))，89.6(C-6(t))，88.5(C-1 ′ (u))，82.1(C-2(t))，78.1(C-2(u))，
66.5(C-3(t))，65.5(C-3(u))，44.3(C-2′(u))，27.0(C-4(u))，26.5(C-4(t))。
[0063] 实施例4.化合物VI和VII的分离制备
[0064] 将实施例1中得到的聚酰胺柱层析粗组分E-4(15g)用适量甲醇溶解，加入约2倍量聚酰胺吸附、干燥，进行聚酰胺柱层析(柱床3.8cm×50cm)，用不同体积比的氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩干燥，得到2个组分E-4-1(2.0g，氯仿-甲醇体积比1∶1洗脱部分)和E-4-2(12g，甲醇洗脱部分)。E-4-2(12g)用适量体积百分数90％的甲醇水溶解进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，用相同体积百分数90％的甲醇水洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩干燥，得到3个组分：E-4-2-1(7.2g)、E-4-2-2(2.3g)和E-4-2-3(2.5g)。取E-4-2-3(2.5g)，经反复的Sephadex LH-20和聚酰胺柱层析分离，根据薄层层析检测结果分别收集化合物VI和VII粗品，再分别从甲醇中重结晶精制，得纯品化合物VI(102mg)和VII(113mg)。
[0065] 化合物VI为淡棕色结晶型粉末(甲醇)，熔点为172-174℃。ESI-MSm/+ + -
z：581[M+H]，603[M+Na]，579[M-H]，与其分子组成C30H28O12相应分子量580一致；
1
H-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：6.87(1H，d，J＝1.2Hz，2′(t)-H)，6.78(1H，d，J＝8.4Hz，
5′(u)-H)，6.75(2H，dd，J＝1.6，6.8Hz，6′(u)，6′(t)-H)，6.67(1H，d，J＝2.0Hz，
2′(u)-H)，6.65(1H，d，J＝8.0Hz，5′(t)-H)，6.02(1H，s，8(t)-H)，5.90(2H，s，3(u)，
5(u)-H)，4.83(1H，d，J ＝ 3.2Hz，α-H)，4.62(1H，d，J ＝ 7.6Hz，2(t)-H)，4.58(1H，br s，β-H)，4.03(1H，m，3(t)-H)，2.90(1H，dd，J ＝ 4.8，16.4Hz，4(t)-Ha)，2.90(1H，dd，J ＝ 4.8，14.8Hz，γ-Ha)，2.62(1H，dd，J ＝ 8.4，16.4Hz，4(t)-Hb)，2.50(1H，
13
dd，J ＝ 10.0，14.8Hz，γ-Hb). C-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：158.2(C-2(u)，6(u))，
158.0(C-4(u))，156.8(C-7(t))，156.2(C-5(t))，155.4(C-8a(t))，146.5(C-4 ′ (u)，
4′(t))，146.0(C-3′(t))，144.3(C-3′(u))，135.5(C-1′(u))，132.6(C-1′(t))，
120.8(C-6 ′ (u))，120.4(C-6 ′ (t))，117.0(C-2 ′ (u))，116.4(C-5 ′ (t))，
116.2(C-5′(u))，115.6(C-2′(t))，108.5(C-6(t))，106.6(C-1(u))，102.1(C-4a(t))，
96.2(C-3(u)，5(u))，95.6(C-8(t))，83.0(C-2(t))，78.1(C-β)，69.4(C-3(t))，
46.6(C-α)，30.6(C-4(t))，29.5(C-γ).
z：581[M+H]，603[M+Na]，579[M-H]，与其分子组成C30H28O12相应分子量580一致；
1
H-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：6.87(1H，d，J＝1.2Hz，2′(t)-H)，6.78(1H，d，J＝8.4Hz，
5′(u)-H)，6.75(2H，dd，J＝1.6，6.8Hz，6′(u)，6′(t)-H)，6.67(1H，d，J＝2.0Hz，
2′(u)-H)，6.65(1H，d，J＝8.0Hz，5′(t)-H)，6.02(1H，s，8(t)-H)，5.90(2H，s，3(u)，
5(u)-H)，4.83(1H，d，J ＝ 3.2Hz，α-H)，4.62(1H，d，J ＝ 7.6Hz，2(t)-H)，4.58(1H，br s，β-H)，4.03(1H，m，3(t)-H)，2.90(1H，dd，J ＝ 4.8，16.4Hz，4(t)-Ha)，2.90(1H，dd，J ＝ 4.8，14.8Hz，γ-Ha)，2.62(1H，dd，J ＝ 8.4，16.4Hz，4(t)-Hb)，2.50(1H，
13
dd，J ＝ 10.0，14.8Hz，γ-Hb). C-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：158.2(C-2(u)，6(u))，
158.0(C-4(u))，156.8(C-7(t))，156.2(C-5(t))，155.4(C-8a(t))，146.5(C-4 ′ (u)，
4′(t))，146.0(C-3′(t))，144.3(C-3′(u))，135.5(C-1′(u))，132.6(C-1′(t))，
120.8(C-6 ′ (u))，120.4(C-6 ′ (t))，117.0(C-2 ′ (u))，116.4(C-5 ′ (t))，
116.2(C-5′(u))，115.6(C-2′(t))，108.5(C-6(t))，106.6(C-1(u))，102.1(C-4a(t))，
96.2(C-3(u)，5(u))，95.6(C-8(t))，83.0(C-2(t))，78.1(C-β)，69.4(C-3(t))，
46.6(C-α)，30.6(C-4(t))，29.5(C-γ).
[0066] 化合物VII为淡棕色结晶型粉末(甲醇)，熔点为167-169℃。ESI-MS m/+ + -
z：581[M+H]，603[M+Na]，579[M-H]，与其分子组成C30H28O12相应分子量580一致；
1
H-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：6.78(1H，d，J ＝ 1.6Hz，2 ′ (t)-H)，6.75(1H，br s，
2 ′ (u)-H)，6.68(1H，d，J ＝8.0Hz，5 ′(t)-H)，6.63(3H，br s，5 ′ (u)，6 ′ (u)，
6′(t)-H)，6.04(1H，s，6(t)-H)，5.84(2H，s，3(u)，5(u)-H)，4.70(1H，br s，α，2(t)-H)，
4.59(1H，br s，β-H)，3.93(1H，m，3(t)-H)，2.90(2H，m，γ，4(t)-H)，2.56(1H，m，4(t)-H)，
1
2.49(1H，m，γ-H).H-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：158.5(C-2(u)，6(u))，158.0(C-4(u))，
156.3(C-7(t))，156.2(C-5(t))，155.5(C-8a(t))，146.5(C-3′(t))，146.4(C-4′(t))，
146.0(C-3 ′ (u))，144.5(C-4 ′ (u))，136.2(C-1 ′ (u))，132.8(C-1 ′ (t))，
121.4(C-6 ′ (u))，120.8(C-6 ′ (t))，117.4(C-2 ′ (u))，116.5(C-5 ′ (t))，
116.3(C-5′(u))，115.6(C-2′(t))，107.9(C-8(t))，106.6(C-1(u))，101.4(C-4a(t))，
97.9(C-6(t))，96.4(C-3(u)，5(u))，83.2(C-2(t))，77.6(C-β)，69.3(C-3(t))，
46.9(C-α)，30.8(C-γ)，29.6(C-4(t))。
z：581[M+H]，603[M+Na]，579[M-H]，与其分子组成C30H28O12相应分子量580一致；
1
H-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：6.78(1H，d，J ＝ 1.6Hz，2 ′ (t)-H)，6.75(1H，br s，
2 ′ (u)-H)，6.68(1H，d，J ＝8.0Hz，5 ′(t)-H)，6.63(3H，br s，5 ′ (u)，6 ′ (u)，
6′(t)-H)，6.04(1H，s，6(t)-H)，5.84(2H，s，3(u)，5(u)-H)，4.70(1H，br s，α，2(t)-H)，
4.59(1H，br s，β-H)，3.93(1H，m，3(t)-H)，2.90(2H，m，γ，4(t)-H)，2.56(1H，m，4(t)-H)，
1
2.49(1H，m，γ-H).H-NMR(400MHz，MeOH-d4)δ：158.5(C-2(u)，6(u))，158.0(C-4(u))，
156.3(C-7(t))，156.2(C-5(t))，155.5(C-8a(t))，146.5(C-3′(t))，146.4(C-4′(t))，
146.0(C-3 ′ (u))，144.5(C-4 ′ (u))，136.2(C-1 ′ (u))，132.8(C-1 ′ (t))，
121.4(C-6 ′ (u))，120.8(C-6 ′ (t))，117.4(C-2 ′ (u))，116.5(C-5 ′ (t))，
116.3(C-5′(u))，115.6(C-2′(t))，107.9(C-8(t))，106.6(C-1(u))，101.4(C-4a(t))，
97.9(C-6(t))，96.4(C-3(u)，5(u))，83.2(C-2(t))，77.6(C-β)，69.3(C-3(t))，
46.9(C-α)，30.8(C-γ)，29.6(C-4(t))。
[0067] 实施例5.抗缺氧活性测试
[0068] 细胞系与细胞培养：活性测试采用大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞株，细胞用含10％新生小牛血清和青霉素、链霉素各100μg/mL的DMEM培养基，于37℃通入5％CO2和95％空气的培养箱中常规培养和继代维护。
[0069] 被测样品与样品溶液配制：实施例1～实施例4中化合物I、II、III、IV、V、VI和VII。精密称量被测样品适量，用含10％新生小牛血清和青霉素与链霉素各100μg/mL的DMEM培养基溶解，配制成50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的样品溶液，供测活性。
[0070] 活性测试方法：取对数生长期的PC12细胞，用含10％新生小牛血清和青霉素、链5
霉素各100μg/mL的新鲜DMEM培养基配成细胞密度为每毫升1×10 个的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔150μL，于37℃通入5％CO2和95％空气的培养箱中培养18～24h，吸引弃去培养液，分成正常对照组、缺氧对照组和缺氧给药组，各组每个样品均设三孔。正常对照组和缺氧对照组每孔加含10％新生小牛血清、青霉素和链霉素各100μg/mL的新鲜DMEM培养基各150μL，缺氧给药组每孔加样品溶液各150μL。对照组和给药组于培养箱中培养1h，缺氧对照组和缺氧给药组以31.25μM CoCl2处理2h造成对细胞的缺氧损伤，然后于培养箱中正常培养24h。培养结束后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液(用0.01M的PBS液配制)各15μL，混匀，37℃孵育4h，翻板法弃去孔内培养液，每孔加DMSO各150μL，振荡10min使MTT紫色产物充分溶解，用酶标仪测量每孔于490nm处的OD值。数据以正常对照组为100％，取各组OD平均值按下式计算缺氧对照组和缺氧给药组的细胞存活率：细胞存活率(％)＝缺氧对照组或缺氧给药组OD平均值/正常对照组OD平均值×100％。取
8次独立实验数据，计算相应细胞存活率(％)，并用Student-t检验法，统计检验缺氧对照组和缺氧给药组两组间细胞存活率的显著性差异。
霉素各100μg/mL的新鲜DMEM培养基配成细胞密度为每毫升1×10 个的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔150μL，于37℃通入5％CO2和95％空气的培养箱中培养18～24h，吸引弃去培养液，分成正常对照组、缺氧对照组和缺氧给药组，各组每个样品均设三孔。正常对照组和缺氧对照组每孔加含10％新生小牛血清、青霉素和链霉素各100μg/mL的新鲜DMEM培养基各150μL，缺氧给药组每孔加样品溶液各150μL。对照组和给药组于培养箱中培养1h，缺氧对照组和缺氧给药组以31.25μM CoCl2处理2h造成对细胞的缺氧损伤，然后于培养箱中正常培养24h。培养结束后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液(用0.01M的PBS液配制)各15μL，混匀，37℃孵育4h，翻板法弃去孔内培养液，每孔加DMSO各150μL，振荡10min使MTT紫色产物充分溶解，用酶标仪测量每孔于490nm处的OD值。数据以正常对照组为100％，取各组OD平均值按下式计算缺氧对照组和缺氧给药组的细胞存活率：细胞存活率(％)＝缺氧对照组或缺氧给药组OD平均值/正常对照组OD平均值×100％。取
8次独立实验数据，计算相应细胞存活率(％)，并用Student-t检验法，统计检验缺氧对照组和缺氧给药组两组间细胞存活率的显著性差异。
[0071] 实验结果详见表1。表1所示测试结果表明，本发明化合物I～VII在所试浓度范围内对PC12细胞的缺氧损伤具有显著保护作用。
[0072] 表1.化合物I～VII对PC12细胞缺氧损伤的保护作用
[0073]
[0074] ＊星号表明与相应缺氧对照组相比有显著性差异，P＜0.01
[0075] 结论：