一种具有透皮给药能力的融合蛋白

摘要

本发明公开了一种促进蛋白质类药物表皮生长因子透皮给药的方法，一种具有良好的透皮给药能力的表皮生长因子融合蛋白，所述融合蛋白的应用，以及一种编码所述融合蛋白的核苷酸序列。本发明的促进蛋白质类药物表皮生长因子透皮给药的方法，包括将所述表皮生长因子与一种透皮增强肽融合组成融合蛋白。本发明通过融合透皮增强短肽达到提高表皮生长因子蛋白透皮输运的能力，同时，此种融合透皮增强短肽的药物与传统药物活性相当，无毒性。

权利要求

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由表皮生长因子EGF以及透皮增强肽TD1构成。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述表皮生长因子EGF以及透皮增强肽TD1通过Linker连接。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述透皮增强肽TD1的序列如SEQ ID NO.6所示。

4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述Linker的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

6.编码权利要求1－5中任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

8.权利要求1－3中任一项所述的透皮增强肽TD1的应用，其特征在于，用于制备提高表皮生长因子EGF的透皮输运能力的药物。

说明书

一种具有透皮给药能力的融合蛋白

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程领域，具体的说，本发明涉及一种促进蛋白类药物透皮给药的方法，本发明还涉及一种包括蛋白类药物表皮生长因子以及透皮增强肽的融合蛋白，以及该融合蛋白的应用。

[0002] 背景技术

[0003] 透皮给药系统或经皮吸收系统（transdermal drug delivery systems/transdermal thrapeutic systems，简称TDDS/TTS），指经皮肤贴敷或涂抹方式用药，药物由皮肤吸收进入全身血液循环并达到有效血药浓度、实现疾病治疗或预防的一种方法。其主要特点：（1）透皮给药系统可避免肝脏的首过效应和药物在胃肠道的灭活，药物的吸收不受胃肠道因素的影响.减少用药的个体差异；（2）维持恒定有效血药浓度或生理效应，避免口服给药引起的血药浓度峰谷现象，降低毒副反应；（3）减少给药次数，提高治疗效能，延长作用时间，避免多剂量给药，使大多数病人易于接受；（4）使用方便，患者可以自主用药，也可以随时撤销用药。

[0004] 透皮增强肽TD1（中国专利申请号200610023887.1，SEQ ID NO.6）是首创性地将分子生物学的经典技术--“体内噬菌体展现技术”应用到经皮给药领域，成功地找到的一个由11个氨基酸组成的“透皮增强肽”，能输运多种从前无法有效透皮的药物，包括蛋白质类的高分子亲水性药物。将该肽和胰岛素混和溶解在生理盐水中，共处理链佐霉素诱导的糖尿病大鼠的腹部裸露皮肤，可显著提高大鼠体内的胰岛素水平并降低血糖浓度。该肽亦可促进人生长激素透皮并达到较高的生物利用度。改变单个氨基酸后增强药物透皮的效果基本丧失，显示透皮增强肽高度的序列特异性。初步结果显示此肽可能作用于毛囊，短暂性地打开皮肤屏障，使大分子药物经过毛囊到达循环系统。透皮增强肽对皮肤无刺激无伤害，不造成皮肤过敏， 在已进行的安全性试验中未发现毒副作用。该项研究在世界上第一次显示由特异序列组成的短肽能有效地促进蛋白质类大分子药物透皮，所得到的透皮增强肽有望成为一个全新的透皮技术平台，用于开发多种药物，特别是蛋白质类药物的经皮给药新剂型。

[0005] 表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，简称EGF)是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，是类EGF大家族的一个成员，是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。EGF同应答细胞表面的特异受体结合。一旦结合，便促进受体二聚化并使其细胞质位点磷酸化。被激活的受体至少可与5种具有不同信号序列的蛋白结合，进行信号转导，在翻译水平上对蛋白质的合成起调节作用，从而促进细胞增殖及存活，它是一种潜在的丝裂原素。目前，表皮生长因子广泛应用于医学美容、皮肤损伤修复领域中。

发明内容

[0006] 本发明的第一个目的在于提供一种促进表皮生长因子透皮给药的方法。本发明的方法包括如下步骤：(a)将人、鼠或猪的表皮生长因子DNA序列插入到表达载体上，如原核表达系统、酵母系统和哺乳动物表达系统中，通过发酵获得目的蛋白；(b)通过蛋白纯化系统将目的蛋白进行纯化，获得高纯度目的蛋白；(c)用促细胞增殖、细胞迁移与细胞增殖信号通路等方法进行表皮生长因子活性检测；(d)将不同剂型的药物分别涂抹在动物或人皮肤任意区域上，从上述动物或人的循环系统、器官、组织以及细胞中检测表皮生长因子含量。在一个较佳的实施例中，应用本发明的方法证明携带透皮增强肽的表皮生长因子能够持续穿过皮肤屏障并达到血液以及其他组织的能力，且透过皮肤的效率明显高于天然表皮生长因子。

[0007] 本发明的第二个目的在于提供一种具有良好的透皮给药能力的融合蛋白。这类融合蛋白以不同组合方式进行连接，包括透皮增强肽分别与EGF的N端和C端连接，形成含多个透皮增强肽拷贝的融合蛋白。显示这些融合蛋白均有EGF活性以及增强或方便药物透皮或经皮给药能力。任何本领域的技术人员所熟知的这些蛋白质的生产技术，包括但不限于通过诸如重 组技术等标准的分子生物学技术来表达蛋白质或者化学合成这些蛋白质等，都包括在本发明的保护范围之内。

[0008] 在一个较佳的实施例中，本发明证明了连接在表皮生长因子N端的TD-1能够提高或便于表皮生长因子通过毛孔渗透的透皮给药效果。

[0009] 本发明的第三个目的在于提供一种编码所述融合蛋白的核苷酸序列。发明中所提到的透皮增强肽TD-1(ACSSSPSKHCG，SEQ ID NO6)、TD-2(CSSSPSKHC，SEQ ID NO7)、TD-10(ACSSSSSKHCG，SEQ ID NO：8)、以及TD1、TD2、TD10的同源物及类似物。如TD1、TD2、TD10的部分的分离的核苷酸、同系物或者类似物，或者在严格条件下杂交为编码TD-1、TD-2、TD-10或者是他们的部分所示的氨基酸序列通过GGGGS或者(GGGGS)n与人、鼠或猪的表皮生长因子的核苷酸序列连接，都具有透皮给药增强功能。

[0010] 本发明的第四个目的在于提供所述融合蛋白表达纯化系统的选择。利用标准分子生物学技术来表达蛋白质，在大肠杆菌系统、酵母系统、哺乳动物细胞系统中进行表达。并使用不同纯化方法，如包括采用HIS纯化系统与halotag纯化系统的亲和纯化、离子交换树脂、疏水层析以及分子筛等技术。显示获得的高纯度蛋白均有透皮给药增强功能 [0011] 本发明的第五个目的在于提供所述融合蛋白的应用。

[0012] 将融合蛋白与表皮生长因子标准品相比，通过本发明的融合蛋白可以进一步包含一种或多种药学上可接受的载体或者含有任何可接受的物质的赋形剂，和/或一种或多种本领域熟知的添加剂。本发明的融合蛋白液可以制成溶液和/或适于局部和/或透皮给药的剂型，和/或透皮贴片方式。

[0013] 本发明还提供了一种增强了药物和一种透皮给药的药物给药系统，该药物给药系统包括：(a)至少一个含有一种药物和一种透皮给药增强剂的药库，该透皮给药增强剂的量能够一定数量的所属药物穿透皮肤或身体表面，以达到治疗效果而不会造成伤害；(b)一个工具，用于维持所述系统中药物和透皮给药增强剂向皮肤或机体表面的输送关系，并且形成机体表面-系统接触面；(c)一个衬底层，用于在所述工具的使用过程中作为外表面。

[0014] 本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现： [0015] 本发明的促进蛋白类药物透皮给药的方法，包括将所述蛋白类药物与一种透皮增强肽融合组成融合蛋白。

[0016] 根据本发明，所述融合是通过采用Linker将所述蛋白类药物与所述透皮增强肽连接。

[0017] 根据本发明的一个优选实施例，所述蛋白类药物为表皮生长因子EGF；所述透皮增强肽为TD1，其序列如SEQ ID NO.6所示；或所述透皮增强肽为TD2，其序列如SEQ ID NO.7所示；或所述透皮增强肽为TD10，其序列如SEQ ID NO.8所示；以及TD1、TD2、TD10的同源物及类似物。

[0018] 优选的，所述Linker的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。 [0019] 本发明的具有良好的透皮给药能力的融合蛋白，由至少一种蛋白类药物以及至少一种透皮增强肽构成。

[0020] 根据本发明，所述至少一种蛋白类药物以及至少一种透皮增强肽通过Linker连接。

[0021] 根据本发明的一个优选实施例，所述蛋白类药物为表皮生长因子EGF；所述透皮增强肽为TD1，其序列如SEQ ID NO.6所示；或所述透皮增强肽为TD2，其序列如SEQ ID NO.7所示；或所述透皮增强肽为TD10，其序列如SEQ ID NO.8所示；以及TD1、TD2、TD10的同源物及类似物。

[0022] 优选的，所述Linker的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。 [0023] 根据本发明，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。 [0024] 本发明的编码所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。 [0025] 本发明的融合蛋白的可用于提高蛋白类药物的透皮输运能力。

[0026] 本发明的有益效果：

[0027] 本发明通过将蛋白类药物与透皮增强肽融合组成融合蛋白，显著提高了蛋白类药物的透皮输运能力，同时，此种融合蛋白与传统经皮的蛋白类药物活性相当，且无毒性。 附图说明

[0028] 图1、TD1-EGF的PCR片段克隆到pFN18A halotag7 flex vector中，替换掉barnase基因的示意图。实例中利用N端NcoI和C端BamHI两个酶切位点处理PCR片段和载体质粒，获得含有两个不同粘性末端的DNA片段，经过粘性末端互补配对以及连接酶作用，使得PCR获得的TD1-EGF基因和pFN18A halotag7 flex vector相互连接，形成所需的重组质粒。后经PCR、酶切、测序等方法进行序列的检定。

[0029] 图2、纯化的TD1-EGF，EGF和购买的标准品EGF考马斯亮蓝染色。实例中分别纯化了TD1与EGF融合的TD1-EGF蛋白，以及不含TD1的EGF蛋白，并与商业化的EGF进行比较。通过考马斯亮蓝染色对其分子量进行了初步检定，证明TD1-EGF要比EGF的分子量大一些，约8kd左右。

[0030] 图3、精细纯化前后TD1-EGF纯度与标准品EGF。TD1-EGF具有分子量小的特点，使用凝胶排阻技术，有效的将蛋白按照不同分子量进行分离，从而获得高纯度蛋白，图中显示最终纯化蛋白的纯度大于95％。

[0031] 图4、western检定TD1-EGF，分别使用TD1抗体、hEGF抗体对纯化的TD1-EGF、纯化的EGF以及商业化EGF进行检定，从图上显示使用TD1抗体进行鉴定，只有TD1-EGF条带被胶片曝光，使用EGF抗体进行鉴定，三种EGF条带胶片曝光。

[0032] 图5、动态光散射检测蛋白的均一度；TD1-EGF与阳性对照EGF测出的粒径大小分别为2.1nm与2.0nm，分子粒径大小相差很小，且测出的分子量均是理论分子量的两倍，分别为19KD与16KD，说明二者可能在水溶液中以二聚体形式存在。而TD1-EGF的均一度不如阳性对照，数值为12.7％。

[0033] 图6、蛋白的热稳定性试验；非变性检测显示TD1-EGF在24h和48h时在胶上的位置与0h相同，说明其高级结构在高温下放置长时间并不发生改变。TD1-EGF与EGF的稳定性类似，具有良好的热稳定性

[0034] 图7、western鉴定融合蛋白激活细胞ERK信号通路；用TD1-EGF激活balb/c细胞的ERK信号通路，再用ERK1/2抗体进行Western Blotting检测P-ERK1/2的激活情况。(如图)，TD1-EGF在10ng/ml时明显刺激了 ERK1/2的磷酸化，且25ng/ml时激活程度更高。
TD1-EGF对ERK1/2激活的浓度作用趋势与其对细胞的促生长活性浓度作用趋势相当。 [0035] 在使用相同给药浓度(10ng/ml)的TD1-EGF、阳性对照1、阳性对照2及用相同方法纯化的EGF处理细胞时，ERK1/2均被明显磷酸化，而阴性对照(0ng/ml)几乎无ERK1/2的激活。

[0036] 图8、MTT法检测TD1-EGF促进balbc 3T3细胞增殖(标准品作为对照)。如图，阴性对照(0ng/ml)细胞生长处于很低的水平。但随着浓度的提高，检测到的细胞数也随着升高，并且TD1-EGF在10ng/ml时表现出明显的促细胞生长活性，且随着浓度的升高其促进作用保持稳定，在100ng/ml时细胞数有所下降。相对于阳性对照，二者的促生长曲线基本一致，说明TD1-EGF同普通的EGF具有类似的促生长活性。

[0037] 图9、不同浓度TD1-EGF促进balbc 3T3细胞迁移影响；随着TD1-EGF浓度的提高，划线空白区段的面积也变小，在10ng/ml时表现出明显的细胞迁移现象。而阴性对照(0ng/ml)只有极少量的细胞向空白区移动。说明TD1-EGF具有促细胞发生迁移的活性。 [0038] 图10、TD1-EGF与不同标准品促进balbc 3T3细胞迁移比较。

[0039] 图11、融合蛋白大鼠体内透皮实验；TD1-EGF组随着时间的延伸，鼠血清中的EGF量也在升高，且45min时便比EGF组的量大，说明TD1已经发挥促透作用；而EGF组的鼠血清中EGF量一直保持在很低的水平。

[0040] 图12、融合蛋白大鼠体外透皮实验；在4h时TD1-EGF是EGF的4倍，表现出一定的促透效果；16h时为16倍，促透效果显著增大，二者间存在显著性差异。而在2h时尚未检测到透过的EGF。因此，TD1的促透作用具有时间依赖性。

[0041] 图13、温度对透皮效率的影响；在4℃时TD1-EGF约是EGF的4倍，表现出一定的促透效果；37℃时约为23倍，促透效果显著增大，二者间存在显著性差异。 [0042] 图14、不同浓度融合蛋白的透皮量；TD1-EGF组随着给药浓度的提高，检测到的EGF量也在升高，且前后两浓度间存在显著性差异；而EGF组则一直保持在很低的水平。因此，TD1的促透效果具有浓度依赖性。

[0043] 图15、融合蛋白在猪体内的透皮效果。

[0044] 图16、融合蛋白在人皮系统中的透皮效果。

具体实施方式

[0045] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

[0046] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或厂商提供的条件进行。

[0047] 实施例1：重组质粒halotag-TD1-EGF的构建

[0048] 本实施例通过分别扩增Linker以及编码透皮增强肽序列TD1，并通过Linker连接TD1和表皮生长因子EGF，然后插入到pFN18A halotag7 Flexi vector，构建了用于表达融合蛋白TD1-EGF的重组质粒halotag-TD1-EGF。

[0049] 1.1、PCR扩增Linker：

[0050] 以pCR-4-TOPO-hEGF(武汉三鹰)为模板，以下列引物对为正反向引物，PCR扩增Linker：GGGGS

[0051] 前向引物(Primer-1-F)：

[0052] 5′-AAGCATTGTGGGGGTGGTGGTGGTTCTAATAGTGACTCTGAATGTCCCCTGTC-3′；(SEQ ID NO.1)

[0053] 反向引物(Primer-R)：

[0054] 5′-CGCGGATCCCTAGCGCAGTTCCCACCACTTC-3′(SEQ ID NO.2)。

[0055] PCR反应体系和条件：

[0056]

[0057] 反应条件：

[0058]

[0059] (Linker序列为GGGGS(SEQ ID NO.4)或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.5)。) [0060] 1.2、PCR扩增TD1：

[0061] 以第一轮PCR产物为模板，以下列引物对为引物，PCR扩增透皮增强肽序列TD1：gcttgttcttcttccccatctaagcattgtggg(SEQ ID NO.6)。

[0062] 发明中所提到的透皮增强肽TD-1(ACSSSPSKHCG，SEQ ID NO6)、TD-2(CSSSPSKHC，SEQ ID NO7)、TD-10(ACSSSSSKHCG，SEQ ID NO：8)、或者是它们的部分的分离的核苷酸、同系物或者类似物，或者在严格条件下杂交为为编码TD-1、TD-2、TD-10或者是他们的部分所示的氨基酸序列通过GGGGS或者(GGGGS)n与人、鼠或猪的表皮生长因子的核苷酸序列连接，都具有透皮给药增强功能。本实施例仅以TD-1为例。

[0063] 前向引物(Primer-2-F)：

[0064] 5′-CATG CCATGG

[0065] CTTGTTCTTCTTCCCCATCTAAGCATTGTGGGGGTGGTG-3′；(SEQ ID NO.3) [0066] 反向引物(Primer-R)：

[0067] 5′-CGCGGATCCCTAGCGCAGTTCCCACCACTTC-3′

[0068] (SEQ.ID.NO.2)。

[0069] PCR反应体系和条件：

[0070] 反应体系和条件与第一轮(1.1)相同

[0071] 用2％琼脂糖凝胶检测PCR结果。

[0072] 1.3、PCR产物克隆至pFN18Ahalotag 7 Flexi vector

[0073] PCR产物(TD1-EGF)经2％琼脂糖凝胶151V电压电泳30min后，用DNA胶回收试剂盒纯化(AXYGEN公司)。

[0074] 于37℃水浴，用NcoI和BamHI(TAKARA公司)分别酶切PCR获得的TD1-EGF基因和pFN18A halotag 7 Flexi vector(Promega公司，具有氨卞抗性基因)的N端和C端，酶切过夜；将酶切完毕的DNA用DNA胶回收试剂盒回收。

[0075] 酶切10ul体系如下：10×K buffer 1ul

[0076] PCR产物 8.8ul

[0077] NcoI 0.1ul

[0078] BamH I 0.1ul

[0079] (更大体系，按照10ul体系进行扩大)

[0080] 将回收到的TD1-EGF和载体片段按9∶1的比例混合，加入连接buffer和连接酶(NEB公司)，于16℃连接过夜，以将TD1-EGF插入到pFN18Ahalotag7 flex vector载体中，替换掉载体中的barnase基因(图1所示)，得到的重组质粒命名为halotag-TD1-EGF。 [0081] 10ul连接体系如下：10×ligase buffer 1ul

[0082] TD1-EGF GENE 8ul

[0083] pFN 18A halotag7 flex vector 0.9ul

[0084] T4DNAligase 0.1ul

[0085] 1.4、重组质粒halotag-TD1-EGF转化TRANS 5α感受态

[0086] 将重组质粒halotag-TD1-EGF转化TRANS 5α感受态，具体过程如下： [0087] 3μl重组质粒加入到50μl Trans 5α感受态(天根生物公司)，冰上孵育30min，立即放入42℃水浴热激90秒，再放入冰上2分钟。加入200μl无抗生素新鲜培养基，在37℃摇床培养1小时。将转化好的细胞涂在含有氨苄抗生素的培养板上，37℃培养过夜。

[0088] 1.5、重组质粒halotag-TD1-EGF的鉴定

[0089] 挑取在含有氨苄抗生素的培养板上长出的单克隆，加入到培养基中培养过夜后，利用质粒抽提试剂盒(Axygen公司)提取质粒，分别用凝胶电泳、酶切、PCR、序列测定方法鉴定克隆质粒，以确定得到的重组质粒为正确。

[0090] 1.6、重组质粒halotag-TD1-EGF转化KRX感受态

[0091] 把克隆正确的质粒halotag-TD1-EGF转化到KRX感受态(Promega公司)中，具体转化过程如下：

[0092] 3μl重组质粒加入到50μl Trans 5α感受态细胞(KRX感受态Promega公司)中，冰上孵育8min，立即放入42℃水浴热激18秒，再放入冰上2分钟；加入200μl无抗生素新鲜培养基，在37℃摇床培养1小时；将转化好的细胞涂在含有氨苄抗生素的培养板上，37℃培养过夜。与前面转化方法不同的是，第一步冰上孵育8分钟，水上热激18秒，其他步骤同上。

[0093] 实施例2：Halotag-TD1-EGF诱导表达

[0094] 挑取转化到KRX感受态上的单克隆菌落于液体LB培养基于37℃培养过夜。将菌液按1∶100接种到TB培养基中，同时加入葡萄糖和鼠李糖至终浓度为0.05％。在摇床中25℃诱导表达18小时。

[0095] 诱导完毕后，收集菌液，在4℃下，8000转离心10分钟，弃上清。用Hepes Buffer重悬菌体。用高压破碎仪破碎菌体。在4℃下，12000rpm转离心30分钟，收集上清(融合蛋白TD1-EGF存在于上清液中)。

[0096] 实施例3：TD1-EGF融合蛋白的纯化及鉴定

[0097] 3.1、纯化

[0098] 将Halotag Resin(Promega公司)用20倍体积Hepes Buffer(50mMHEPES，150mM NaCl，PH7.5)平衡，加入细胞裂解液上清，在4℃条件下旋转孵育过夜。完毕后，用Hepes Buffer冲洗珠子，以去除非特异性结 合。加入TEV蛋白酶，在4℃条件下旋转酶切过夜。完毕后，2000转离心收集酶切上清(见图2)。

[0099] 将G75分子筛预装柱(GE公司)用Hepes Buffer平衡120min，加入酶切上清液，在5ml/min流速下洗脱，收集第二个峰的蛋白液(见图3)。经测序融合蛋白(TD1-EGF蛋白)的核苷酸序列为(SEQ.ID.NO.10)

[0100] GCTTGTTCTTCTTCCCCATCTAAGCATTGTGGGGGTGGTGGTGGTTCTAATAGTGACTCTGAATGTCCCCTGTCCCACGATGGGTACTGCCTCCATGATGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTATGCATGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGATGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGC，其氨基酸序列(SEQ.ID.NO.11)

[0101] ACSSSPSKHCGGGGGSNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR。现有EGF的核苷酸序列为(SEQ.ID.NO.9)AATAGTGACT CTGAATGTCC CCTGTCCCACGATGGGTACT GCCTCCATGA TGGTGTGTGC ATGTATATTGAAGCATTGGA CAAGTATGCA TGCAACTGTG TTGTTGGCTACATCGGGGAG CGATGTCAGT ACCGAGACCT GAAGTGGTGGGAACTGCGC。 [0102] 3.2、鉴定

[0103] 蛋白检测及鉴定方法：用BCA蛋白浓度试剂盒(碧云天生物公司)测定蛋白浓度，将纯化好的蛋白分别稀释10倍、100倍、1000倍，取20ul加入到96孔平板中，然后将标准品蛋白分别稀释到终浓度为0ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml、500ug/ml，在所有孔中加入200ul BCA试剂(A∶B＝50∶1)，在37℃培养箱中培养30分钟，利用酶标仪在570nm波长下读数，经数据经过统计分析，制作出标准曲线，计算出蛋白浓度；

[0104] 用Tricine-SDS-PAGE方法检定蛋白纯度，去纯化的蛋白质40ul，加入变性的上样缓冲液，混合，在100℃水浴中加热10分钟。取5ul样品加入到蛋白胶的孔洞中，分别利用80V电压压缩条带，利用120V电压分离条带，待溴酚蓝刚跑出胶板时停止电泳，剥下胶块，用考马斯亮蓝进行染色 10分钟，再用甲醇脱色液进行脱色，至清晰分辨出蛋白条带； [0105] Western blot方法检定蛋白质(图4)，将Tricine-SDS-PAGE完毕后的胶块取下放入电转缓冲液中，按照夹心法方法铺好胶块以及PVDF膜，装入电转装置，在100V电压，
250mA电流下运行55分钟。电转完毕后用5％脱脂奶粉封闭1小时。之后，孵育TD1或者EGF抗体(1∶5000用)，37℃孵育2小时，完毕后用TBST清洗3次，每次10分钟。然后以兔抗作为二抗在室温下孵育1小时，用TBST清洗3次，每次10分钟。最后将PVDF膜上加入显色底物，曝光5分钟。

[0106] 紫外分光光度计对蛋白吸收峰进行检定(图5)：将纯化的TD1-EGF与阳性对照EGF稀释至浓度均约为50ug/ml，上样约20ul进入动态光散射仪中进行分子粒径与均一度的测定。如图5，TD1-EGF与阳性对照EGF测出的粒径大小分别为2.1nm与2.0nm，分子粒径大小相差很小，且测出的分子量均是理论分子量的两倍，分别为19KD与16KD，说明二者可能在水溶液中以二聚体形式存在。而TD1-EGF的均一度不如阳性对照，数值为12.7％。 [0107] 用质谱1D-LC-MS对蛋白质鉴定。用紫外分光光度计对蛋白吸收峰进行检定。 [0108] 检定结果：经过最后一步精纯化后，蛋白纯度达到95％以上，与标准品EGF纯度相当，达到《2010药典》要求(如图3所示)。质谱鉴定出三条多肽片段与EGF序列相同，可以确定表达的正确性，具体参数如下表1和表2所示。

[0109] 表1、主要测试参数

[0110]

[0111] 表2、多肽获得数和序列覆盖度

[0112]

[0113] 蛋白的热稳定性鉴定(图6)；将阳性对照EGF与TD1-EGF分别置于55℃与37℃温箱中存放1h、6h、24h和48h，然后取各时间点同等体积的蛋白液加入相同体积的Lodding Buffer并煮样10min，接着进行变性与非变性的SDS-PAGE分析蛋白存在情况，跑胶上样量亦相同。如图6，在两个温度中随着时间的延长，TD1-EGF与阳性对照一样蛋白量并无减少，由于55℃温度较高会蒸发少量水分，故可见TD1-EGF在48h时蛋白条带有所变浓。如图6，非变性检测显示TD1-EGF在24h和48h时在胶上的位置与0h相同，说明其高级结构在高温下放置长时间并不发生改变。

[0114] 由此可见，TD1-EGF与EGF的稳定性类似，具有良好的热稳定性。 [0115] 实施例4：融合蛋白细胞水平生物学活性检定

[0116] 4.1、MTT实验检定TD1-EGF对balb/c 3T3细胞增殖的影响

[0117] 在96孔细胞培养板中，每孔加入细胞约5000～7000个；过夜贴壁后， 吸掉完全培养基(含10％血清)，每孔加100μl不同浓度的TD1-EGF(含0.1％血清)。37℃培养48h后，每孔空加入10μl MTT，37℃孵育4小时，吸掉培养基每孔加150μl DMSO，摇床孵育
15～20min，490nm测OD值。

[0118] 结果显示：TD1-EGF具有促进细胞增殖的能力，并且和标准品EGF一样随着浓度的增加活性越大(见图8)。

[0119] 4.2、促balb/c 3T3细胞迁移检定融合蛋白活性

[0120] 在24孔细胞培养板中，每孔加入细胞约50000～70000个；继续37℃培养细胞待细胞铺满孔底部90％左右，用无菌牙签在孔底中央画一条直线，完毕后，吸掉完全培养基(含10％血清)，每孔加500μl不同浓度的TD1-EGF和标准品(含0.1％血清)。37℃培养24小时和48小时后，并在不同时间上用倒置显微镜(奥林巴斯公司)拍照观察细胞迁移情况(0小时为对照组)。

[0121] 结果显示：TD1-EGF在0.1ng/ml时便具有生物学活性，且细胞迁移程度呈药物浓度依赖性(见图9)。同时发明人纯化的TD1-EGF和EGF在促进细胞迁移方面和市场上出售的EGF具有相同的活性(见图10)。

[0122] 4.3、融合蛋白对细胞ERK信号通路的激活

[0123] 在24孔细胞培养板中，每孔加入细胞约50000～70000个，过夜贴壁后，洗掉完全培养基(含10％血清)，加入500μl无血清培养基，37℃饥饿培养24小时。完毕后，洗掉无血清培养基，加入一定浓度的TD1-EGF和标准品EGF(无血清)，在37摄氏度下培养25min，完毕后，用胰酶消化贴壁细胞，5000rpm离心收集细胞沉淀，加入50μl细胞裂解液，待细胞完全裂解后，加入loading buffer，加入煮10min，用western blot检测ERK蛋白的含量，一抗使用ERK抗体(promega公司)，内参使用GAPDH(promega公司)。

[0124] 结果显示：在较低浓度的融合蛋白存在下，即可激活细胞内ERK信号通路的产生，使得ERK2蛋白含量增加，同时与相同浓度标准品的激活效果相当。说明纯化出的融合蛋白与商品化的EGF活性相当(见图7)。

[0125] 实施例5：体外透皮实验——大鼠系统、猪系统、人皮系统

[0126] 5.1、SD大鼠透皮系统，抽取若干只SD大鼠，随机分成两组，脱毛后，放置约48小时。心脏取血处死，立即从同一动物身上取两块皮肤，分别做EGF组和TD1-EGF组。将皮肤安装在透皮槽上，角质面加1ml药物，真皮面加4ml接受液(Hepes Buffer)。每组给药30ug，分别于2h、4h、16h吸取收集液。取100μl收集液加入ELISA 96孔板中(博士德公司)检测。

[0127] 5.2、人皮透皮系统，去除皮下脂肪层，装置体外透皮槽->给药设置为：400ugTD1-EGF、400ug-EGF和400ugTD1-EGF+0.5mol ATP，生理盐水补充至500μl体系，每组3个样品->将透皮槽分别置于37℃水浴中固定，透皮16h透皮->收集槽中样品用hEGF ELISAKit进行检测。

[0128] 数据分析方法如下：student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。 [0129] 结果显示，在大鼠透皮系统中，TD1-EGF在体外透皮中仍有很高的透皮效率，并随着时间的增加，透过皮肤的量也随之增加。在16小时TD1-EGF的透皮量要比EGF高出16倍(见图12)。

[0130] 在人皮透皮系统中，在ATP存在下，TD1-EGF可以透过人类皮肤，并且透过皮肤的总量要比没有ATP存在时的透过的多；该结果说明ATP作为一种能量物质，影响了TD1-EGF的透皮过程，它可能在TD1协助EGF透皮过程中起供给能量的作用(见图16)。 [0131] 实施例6：体内透皮实验——大鼠系统，猪系统

[0132] 6.1、SD大鼠体内透皮系统，随机抽取10只SD大鼠，并将其平均分成共分2组(EGF2
透皮给药组，TD1-EGF透皮给药组)，1ml乌来糖麻醉后，在腹部剪出约2*2cm 面积的无毛区，在此部位给药50ug。分别在给药45min、120min以及300min的时候采集血样，前两次采用尾静脉取血，最后一次采用心脏取血。离心收集血清。取100μl血清，EGF ELISA试剂盒检测(博士德公司)(见图11)。

[0133] 6.2、猪透皮系统，本系统使用体重约10斤的小型猪，给药前先将其四肢固定，从其颈下位置的前腔静脉取给药前的空白血清。完毕后，在其腹 部涂抹给药400ug，待药物作用4小时后，在其前腔静脉处取血，离心收集血清，用ELISA方法检测EGF含量。 [0134] 结果显示：与对照组相比，在给药4小时后在猪的体内检测到的融合蛋白含量要高于对照组的含量，进一步说明在TD1具有良好的促进蛋白类药物透皮的效果(见图15)。 [0135] 实施例7：融合蛋白透皮机理相关研究

[0136] 7.1、药物透皮量与给药浓度呈剂量依赖

[0137] 在大鼠，猪，人的透皮系统中，将处理好的皮肤安装于体外透皮槽中，分1)EGF组；2)TD1-EGF组；(给药浓度分别为：0ug/ml、20ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、500ug/ml)，将透皮槽置于37℃水浴中固定，透皮16h。完毕后，收集收集槽中样品，用hEGF ELISAKit进行检测。

[0138] 结果显示：随着给药浓度的增加，TD1-EGF的透过皮肤量显著增加，呈浓度依赖性；而EGF随着给药浓度的增加几乎没有透过皮肤(见图14)。

[0139] 7.2、温度对融合蛋白透皮效率的影响

[0140] 在大鼠、猪、人的透皮系统中，将处理好的皮肤安装于体外透皮槽中，将给药组设置为：1)EGF(37℃)组；2)EGF(4℃)组；3)TD1-EGF(37℃)组；4)TD1-EGF(4℃)组，给药量为500μl(25ug/ml)->将透皮槽分别置于37℃和4℃水浴中固定，透皮16h。完毕后，收集槽中样品，用hEGF ELISAKit进行检测。

[0141] 结果显示：温度对TD1-EGF透皮有很显著的影响，在4℃温度下，TD1-EGF透过皮肤含量比37摄氏度透过的量低。说明在正常体温下，TD1-EGF有很高的透皮效率(见图13)。 [0142] 能量对融合蛋白透皮效率的影响

[0143] 在大鼠、猪和人的透皮系统中，将处理好的皮肤安装于体外透皮槽中，将给药组设置为：400ugTD1-EGF、400ug-EGF和400ug TD1-EGF+0.5molATP，生理盐水补充至500ul体系，每组3个样品->将透皮槽分别置于37℃ 水浴中固定，透皮16h透皮->收集槽中样品用hEGF ELISAKit进行检测。

[0144] 结果显示：在ATP存在下，TD1-EGF可以透过人类皮肤，并且透过皮肤的含量要比没有ATP存在时透过的多；该结果说明ATP作为一种能量物质，影响了TD1-EGF的透皮过程，它可能在TD1协助EGF透皮过程中起供给能量的作用(见图16)。

[0145] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。