一种以分子簇为功能基的内毒素吸附剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种以分子簇为功能基的内毒素吸附剂及其制备方法，属于生物分离和生物医学工程领域。该吸附剂以琼脂糖凝胶为载体，经环氧活化后直接偶联分子簇骨架ε-聚赖氨酸或聚天冬氨酸，然后再通过缩合反应接枝小分子赖氨酸或甜菜碱所得。本发明所得的吸附剂对人血清内毒素的去除率较高，对血清蛋白的吸附较少。同时，吸附剂的制备过程条件温和，合成步骤较少，材料成本相对低廉。

权利要求

1. 一种以分子簇为功能基的内毒素吸附剂，由固相基质琼脂糖凝胶和功能基分子组成，其特征在于该吸附剂由ε-聚赖氨酸或聚天冬氨酸作为功能基骨架分子，通过与赖氨酸或甜菜碱的偶联形成内毒素吸附剂的分子簇功能基。

2.根据权利要求1所述的内毒素吸附剂，其特征在于，聚天冬氨酸的分子量为 1000-5000Da。

3.权利要求1或2所述内毒素吸附剂的制备方法，其特征在于如下步骤：(1)环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶：环氧氯丙烷为0. 01-0. 04ml/ml凝胶，体系NaOH浓度为 0. 4M，40°C 170rpm 振荡反应 l_2h ；(2) ε -聚赖氨酸或聚天冬氨酸与环氧活化琼脂糖凝胶：ε -聚赖氨酸或聚天冬氨酸加入量 0. 06-0. 4g/ml 凝胶，pH 9-11, 50-60°C 300rpm 搅拌反应 3_4h ；(3) ε -聚赖氨酸骨架上固定赖氨酸或甜菜碱：赖氨酸或甜菜碱0. 01-0. 02g/ml凝胶， pH4. 5-7. 5，37°C 170rpm 振荡反应 3_4h ；聚天冬氨酸骨架上固定赖氨酸或甜菜碱：聚天冬氨酸先通过接臂反应接枝乙二胺间隔臂，接臂条件为乙二胺为0. 1-0. 2ml/ml凝胶，ρΗ4· 5-7. 5, 37°C 170rpm振荡反应3_4h ； 再偶联赖氨酸或甜菜碱，偶联条件为赖氨酸或甜菜碱0. 01-0. 02g/ml凝胶，pH4. 5-7. 5， 37 °C 170rpm 振荡反应 3_4h ；琼脂糖凝胶经环氧氯丙烷活化的密度为l-lOymol/ml凝胶，赖氨酸或甜菜碱的偶联密度为10-100 μ mol/ml凝胶。

4.应用权利要求1或2所述的内毒素吸附剂，其特征在于：吸附剂经去热原处理后，与含有l-5EU/ml内毒素的人血清按比例1 ： 5-1 ： 10混合，静态吸附2_池，内毒素去除率为 35% -65%，血清蛋白吸附率在20%之内。

说明书

一种以分子簇为功能基的内毒素吸附剂及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物分离和生物医学工程领域，特别涉及到一种用于内毒素血症治疗的以分子簇为功能基的内毒素吸附剂及其制备方法。

背景技术

[0002] 内毒素，又称脂多糖（Lip0p0lySaCCharideS，LPQ，是革兰氏阴性菌细胞外膜的组成部分。在正常人体内，一定量的内毒素可被肝脏清除从而使血液中的内毒素含量保持在较低水平。如果肝功能严重受损或者内毒素的含量超过了肝脏的解毒能力，经肠道吸收的内毒素就可通过肝脏进入体内循环，形成内毒素血症，进而导致多种器官功能衰竭甚至死亡。据报道，美国每年至少有几十万人患有内毒素血症，其致死率可达40% -90%,日本每年死于内毒素血症的人数为3-5万人。因此，研制出能高效去除病人血液中过量内毒素的方法，对挽救内毒素血症患者的生命将有重大的现实意义。

[0003] 迄今为止，针对内毒素的去除，已经有各种研究报道。目前研究较多的主要集中于抗内毒素药物的直接治疗去除以及血液净化疗法中的血液灌流去除。

[0004] 抗内毒素药物主要包括：类脂A拮抗剂、多粘菌素B、抗内毒素蛋白及多肽以及内毒素抗体等。类脂A是LPS的毒性和生物活性中心，Loppbow等研究发现，其生物合成前体物质及无毒的类脂A衍生物均能拮抗LPS的毒性反应。多粘菌素B作为一种抗生素对内毒素有很强的结合能力，但其对中枢神经系统及肾脏有毒性作用，不能直接用药。Jian-Dong Ren 等（JD Renet al.Int Immunopharmacol. 2008 Jun ；8 (6) :775-81. Epub 2008 Feb 25.) 合成了一种环肽（CRKPTFRRLKWKIKFKFKC，CLP-19)，借助正电荷氨基酸和环状结构来实现对带负电的内毒素的去除。小鼠实验表明内毒素血症的小鼠存活率为60-80 %。US6395717B1 公开了一种唾液酸及其聚合物对小鼠内毒素血症的治疗效果，小鼠存活率80%以上，且该药物与传统抗生素治疗相比，机体不会产生抗药性，安全性更高，但其与内毒素的作用机理尚不明确。

[0005] 另外，研究表明磷脂复合物、脂质A类似物、藻类脂多糖等均对内毒素有不同程度的中和作用。以上这些均是针对内毒素分子中磷酸基的负电性或脂肪链的疏水性而设计的分子，但由于这些分子合成费用昂贵，因此离临床应用还有很长时间。

[0006] 内毒素抗体主要包括抗内毒素的多克隆抗体、抗类脂A的单克隆抗体、抗内毒素结合蛋白抗体、抗内毒素受体CD14等。但这些抗体同样面临制备困难、成本高、具有细菌种属特异性、容易引起过敏反应且可能会在患者损伤的免疫系统中失去作用等问题。

[0007] 血液净化疗法对于一些重大疑难病症有着独特的疗效，其中的血液灌流法由于其较低的费用而受到研究者的广泛关注。该疗法主要是基于吸附剂的特殊功能基分子与毒性分子的物理化学相互作用，通过吸附来清除血液中的有毒或致病物质，进而达到净化血液和治疗疾病的目的。传统的活性碳、大孔树脂类吸附剂对血液内毒素没有吸附选择性，且血液相容性较差，去除效果不明显。因此，新型高效的内毒素吸附剂的研制及临床应用迫在眉睫。3[0008] 多粘菌素B由于其优良的抗菌性能，一直受到研究者的关注。为了解决直接用药存在的神经毒性和肾脏毒性问题，很多学者考虑将其固定在各种载体上制成不同种类的吸附材料。1994年^Voki等首次将多粘菌素B固定在纤维载体上用来治疗内毒素血症。日本 Toray Industried Inc已将多粘菌素B固定到纤维上制成吸附载体-多粘菌素B纤维柱， 且已经实现商品化生产（PMX-F，商品名Toraymyxin)。

[0009] 南开大学（中国专利CN1493368A)公开了一种以琼脂糖为载体，经环氧活化、胺化、戊二醛交联后偶联多粘菌素B、α-聚赖氨酸（Mr = 10，000-40，OOODa)等配基制得一系列用于血浆内毒素去除的吸附剂，血液相容性好，且去除效果较好。但是，该吸附剂合成步骤较多，且多粘菌素B配基价格较贵，一旦脱落将会对患者神经和肾脏造成潜在的危险。另夕卜，有研究（D. Petsch，F. B. Anspach Journal of Biotechnology 76 QOOO) 97—119)表明多粘菌素B对BSA也会有20%左右的吸附。相对而言，α-聚赖氨酸虽然对BSA吸附较少，但其价格不菲（7，000RMB/g)。以上这些不足限制了多粘菌素B和α-聚赖氨酸作为配基的吸附剂在临床上的广泛应用。

[0010] 另外，为了提高吸附剂对内毒素的选择性，美国专利US2005/0238641A1公开了一种以琼脂糖凝胶等为载体，环氧氯丙烷活化，接分支配基（三（2-氨基乙基）胺）所得的吸附剂，在含内毒素的HSA溶液中对内毒素去除率较高，且对HSA的吸附量很少。但实际内毒素血浆中的去除效果却未见报道，而只有在实际血浆（或血清）中具有良好去除率的吸附剂才具有潜在的临床应用价值。

[0011] 因此，为了解决目前内毒素去除研究中存在的（1)抗内毒素药物及α-聚赖氨酸等制备困难，价格昂贵；（¾多粘菌素B潜在的毒性隐患；C3)传统的血液灌流吸附剂血液相容性差、选择性不高及去除效果不理想等缺陷，本发明提供了一种廉价、高效的内毒素吸附剂及其制备方法，有望用于内毒素血症的临床治疗。

发明内容

[0012] 本发明提供了一种以分子簇为功能基的内毒素吸附剂及其制备方法。本发明的构思是：以血液相容性较好的琼脂糖凝胶为基质，经过环氧活化后直接与无毒、价廉的ε -聚赖氨酸或聚天冬氨酸偶联，借助大分子聚合物的分子簇作用，再接枝能与内毒素分子主要通过静电作用结合的小分子赖氨酸或甜菜碱，通过控制环氧活化的密度和分子簇功能基的加入量合成不同功能基密度的吸附剂，以达到对血清中内毒素的选择性去除效果。

[0013] 本发明的技术方案如下：

[0014] 一种以分子簇为功能基的内毒素吸附剂，由固相基质琼脂糖凝胶和功能基分子组成，该吸附剂由ε -聚赖氨酸或聚天冬氨酸作为功能基骨架分子，通过与赖氨酸或甜菜碱的偶联形成内毒素吸附剂的分子簇功能基。所述的ε -聚赖氨酸的分子量为3600-4300Da， 聚天冬氨酸的分子量为1000-5000Da。

[0015] 制备上述的内毒素吸附剂包括如下步骤：

[0016] (1)环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶：环氧氯丙烷加入量为0. 01-0. 04ml/ml凝胶，体系NaOH浓度为0. 4M，40°C 170rpm振荡反应Uh ；

[0017] (2)分子簇骨架的偶联：ε -聚赖氨酸或聚天冬氨酸加入量0. 06-0. 4g/ml凝胶，ρΗ 9-11, 50-60°C 300rpm 搅拌反应 3-4h ；[0018] (3) ε -聚赖氨酸偶联赖氨酸或甜菜碱：赖氨酸或甜菜碱加入量0. 01-0. 02g/ml凝胶，ρΗ4· 5-7. 5，37°C 170rpm 振荡反应 3_4h ；

[0019] (4)聚天冬氨酸偶联赖氨酸或甜菜碱：聚天冬氨酸先通过接臂反应接枝乙二胺间隔臂，接臂条件为乙二胺的加入量为0. 1-0. 2ml/ml凝胶，ρΗ4· 5-7. 5, 37 °C 170rpm振荡反应3-4h ；再偶联赖氨酸或甜菜碱，偶联条件为赖氨酸或甜菜碱0. 01-0. 02g/ml凝胶， pH4. 5-7. 5，37°C 170rpm 振荡反应 3_4h。

[0020] 所述的琼脂糖凝胶经环氧氯丙烷活化的密度为l-lOymol/ml凝胶，赖氨酸或甜菜碱的偶联密度为10-100 μ mol/ml凝胶。

[0021] 所述的内毒素吸附剂经去热原处理后，与含有l_5EU/ml内毒素的人血清按一定比例混合（1 ： 5-1 ： 10)，静态吸附2-池，内毒素去除率为35%-65%，血清蛋白吸附率在 20%之内。

[0022] 本发明的有益效果是：

[0023] 1、采用血液相容性良好，理化性质稳定的琼脂糖凝胶kpharose CL-6B为基质，通过环氧活化后直接偶联分子簇骨架再接小分子的方法制备内毒素吸附剂。本发明克服了溴化氰法的毒性和不稳定性；羰基二咪唑法形成的酯键在酸、碱处理中可能会断裂从而引起配基脱落的风险；戊二醛键合法相对步骤较多的缺点。制备过程有机溶剂使用较少，增加了制备的安全性，反应条件温和，步骤简单。

[0024] 2、琼脂糖凝胶kpharose CL-6B上有大量的可活化基团，通过控制环氧氯丙烷的加入量可以控制环氧活化的密度；通过控制ε -聚赖氨酸和聚天冬氨酸的加入量和反应温度可以得到偶联不同密度末端功能基的内毒素吸附剂，从而选择性的去除血清中的内毒ο

[0025] 3、具有分子簇作用的ε-聚赖氨酸或聚天冬氨酸，凭借其每个分子中多个赖氨酸残基的氨基或天冬氨酸的羧基可以解决环氧活化后的材料偶联密度较低的问题，且多个氨基或羧基形成的分子簇作用接上小分子赖氨酸或甜菜碱后能通过多点作用和内毒素大分子发生相对牢固的作用。

[0026] 4、该内毒素吸附剂所用的ε -聚赖氨酸、聚天冬氨酸、赖氨酸及甜菜碱分子与多粘菌素B和α-聚赖氨酸相比价廉易得。其中的ε-聚赖氨酸和聚天冬氨酸均为无毒、可降解的环境友好型高分子化合物，热稳定性高。

具体实施方式

[0027] 以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例。

[0028] 实施例1 ： ε -聚赖氨酸偶联赖氨酸作为分子簇功能基的吸附剂制备

[0029] (1)环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶

[0030] 取IOml清洗后的kpharose CL-6B凝胶，加入到IOml环氧氯丙烷浓度为1 % (ν/ ν)、Na0H浓度为0. 4M的水溶液中，40°C摇床170rpm振荡反应2h，反应完毕用去离子水清洗凝胶至中性为止；

[0031] (2) ε-聚赖氨酸的偶联

[0032] 配制IOml浓度为6% (w/v)、pH为11的ε -聚赖氨酸水溶液，加入上一步反应完清洗后的凝胶，500C 300rpm悬桨搅拌反应3_4h，反应完后的凝胶用去离子水充分清洗；[0033] (3)末端功能基赖氨酸的固定

[0034] 在IOml pH为4. 8的MES缓冲液中加入一定质量的赖氨酸，使其浓度为1 % (w/v)， 然后将上一步反应完后的凝胶加入其中，调节PH至4. 8，再加入0. 2g 1-乙基-3-(3- 二甲氨丙基）_碳酰二亚胺（EDC)缩合剂，37°C、170rpm振荡反应4h，反应结束后用去离子水充分清洗，即得到最终的内毒素吸附剂1。

[0035] 实施例2 ： ε -聚赖氨酸偶联甜菜碱作为分子簇功能基的吸附剂制备

[0036] ε-聚赖氨酸末端接甜菜碱的内毒素吸附剂2的制备方法同实施例1，只需将步骤(3)中的赖氨酸换成甜菜碱，其余步骤及条件均不变。

[0037] 实施例3 ：聚天冬氨酸偶联赖氨酸作为分子簇功能基的吸附剂制备

[0038] 聚天冬氨酸偶联赖氨酸作为分子簇功能基的吸附剂3的制备方法包括四个步骤， 前两步同实施例ι中的（1)和0)，只需将O)中的ε -聚赖氨酸换成聚天冬氨酸，其余条件均不变，步骤⑶和⑷如下：

[0039] (3)间隔臂的连接

[0040] 在IOml pH为4. 8的MES缓冲液中加入一定体积的乙二胺，使其浓度为10% (ν/ ν)，然后将上一步反应完后的凝胶加入其中，调节pH至4. 8，再加入0. 2g EDC缩合剂，37 °C、 170rpm振荡反应4h，反应结束后用去离子水充分清洗；

[0041] (4)末端功能基赖氨酸的固定

[0042] 在IOml pH为4.8的MES缓冲液中加入一定质量的赖氨酸，使其浓度为(w/ ν)，然后将上一步反应完后的凝胶加入其中，调节pH至4. 8，再加入0. 2gEDC缩合剂，37°C、 170rpm振荡反应4h。反应结束后用去离子水充分清洗，即得到最终的内毒素吸附剂3。

[0043] 实施例4 ：聚天冬氨酸偶联甜菜碱作为分子簇功能基的吸附剂制备

[0044] 聚天冬氨酸末端接甜菜碱的内毒素吸附剂4的制备方法同实施例3，只需将步骤(4)中的赖氨酸换成甜菜碱，其余步骤及条件均不变。

[0045] 实施例5 ：吸附材料及实验器具的去热原处理

[0046] 实验中所用到的所有材料及器具均需去热原处理：玻璃试管反复清洗干净后置于 250°C烘箱干烤池以上；塑料离心管经30%双氧水浸泡过夜，然后用无热原水冲洗多次后烘干；吸附剂先用生理盐水淋洗多次，然后依次经过0. 2M NaOH(含20%乙醇）、1. 5M NaOH 淋洗，最后用生理盐水、无热原水冲洗至中性为止。

[0047] 实施例6 ：人血清中内毒素的静态吸附去除

[0048] 取去热原处理后的末端功能基密度均为10 μ mol/ml的吸附剂1-4，与含1. 95EU/ ml内毒素的人血清按体积比1 ： 5混合，置于37°C 200rpm的摇床中静态吸附池。离心取上清测剩余内毒素浓度及蛋白浓度，分别计算四种吸附剂对内毒素的去除率及蛋白的吸附率。

[0049] 表1是末端功能基密度均为10 μ mol/ml的内毒素吸附剂对人血清中内毒素的去除率和主要蛋白质的吸附率。结果表明在内毒素初浓度为1.95EU/ml，血清总蛋白和白蛋白浓度分别为60. 23g/L和41. 67g/L的条件下，四种内毒素吸附剂对内毒素的去除率在 48% -53%之间，且血清蛋白的吸附率在15%之内。

[0050] 表1 ：人血清中内毒素及蛋白的吸附效果

[0051]

[0052] 实施例7 ：不同功能基密度的吸附剂（5-14)对人血清中内毒素的静态去除效果

[0053] 通过控制环氧氯丙烷的加入量（1% -4% (ν/ν))和ε-聚赖氨酸的加入量 (6 % -40 % (w/v))合成末端偶联密度分别为 10ymol/ml、37ymol/ml、52ymol/ml、 81 μ mol/ml及100 μ mol/ml的赖氨酸（吸附剂5-9)和甜菜碱吸附剂（吸附剂10-14)，方法同实施例1和2。所得吸附剂经去热原处理后，分别与内毒素初浓度为3. 81EU/ml的血清按体积比1 ： 5混合，静态吸附后测上清中的内毒素浓度，计算不同密度吸附剂对内毒素的去除率。

[0054] 实施例8不同功能基密度的吸附剂（15-24)对人血清中内毒素的静态去除效果

[0055] 通过控制环氧氯丙烷的加入量（1% -4% (ν/ν))和聚天冬氨酸的加入量 (6 % -40 % (w/v))合成末端偶联密度分别为 10ymol/ml、37ymol/ml、52ymol/ml、 81 μ mol/ml及100 μ mol/ml的赖氨酸（吸附剂15-19)和甜菜碱吸附剂（吸附剂20-24)， 方法同实施例3和4。所得吸附剂经去热原处理后，分别与内毒素初浓度为3. 81EU/ml的血清按体积比1 ： 5混合，静态吸附后测上清中的内毒素浓度，计算不同密度吸附剂对内毒素的去除率。

[0056] 表2为不同功能基密度时各种吸附剂对内毒素的去除效果。通过控制环氧活化密度和ε-聚赖氨酸或聚天冬氨酸的加入量合成末端偶联密度分别为10ymOl/ml、37ymOl/ πι1、52μπιΟ1/πι1、8ΐμπιΟ1/πι1&100μπιΟ1/πι1的赖氨酸或甜菜碱吸附剂，在内毒素初浓度为 3.81EU/ml的血清中考察功能基密度对内毒素去除效果的影响。结果表明在一定的内毒素浓度下，随着功能基密度的提高，不同吸附剂对内毒素的去除率均有所增加。

[0057] 表2 ：不同功能基密度的吸附剂对人血清中内毒素的去除效果

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