一株产ACC脱氨酶的小麦内生固氮菌及其用途

摘要

本发明公开了一株产ACC脱氨酶的小麦内生固氮菌及其用途。该小麦内生固氮菌是假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.5040。本发明所提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040具有较高的固氮活性，具有ACC脱氨酶活性，在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。

权利要求

1.假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.5040。

2.一种菌剂，它的活性成分为权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040。

3.权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040在制备下述1）-7）中任一的菌剂中的应用：

1）用于固氮的菌剂；

2）促进植物生长的菌剂；

3）抑制植物产生乙烯的菌剂；

4）降低植物对逆境敏感性的菌剂；

5）提高植物抗逆性的菌剂；

6）产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的菌剂；

7）产生固氮酶的菌剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述逆境为干旱、淹水、高温、机械损伤、病虫害侵袭或重金属污染。

5.权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040或权利要求2所述的菌剂在生产固氮酶或1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶中应用。

6.权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040或权利要求2所述的菌剂在制备生物有机肥中的应用。

7.含有权利要求1所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040或权利要求2所述的菌剂的生物有机肥。

8.培养权利要求1所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040的方法，包括将假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040在用于培养假单胞菌的培养基中培养的步骤。

9.权利要求2所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040作为活性成分，得到所述菌剂。

说明书

一株产ACC脱氨酶的小麦内生固氮菌及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一株产ACC脱氨酶的小麦内生固氮菌及其用途。

背景技术

[0002] 氮肥是农业生产中最重要的生产资料之一。生产化学氮肥消耗大量能源，占生产总成本的70％～80％。近年来能源日趋紧张，我国化肥生产用煤价格飚升导致化学氮肥价格上涨，农民难以承受，反响强烈。此外，化学氮肥在提高作物产量、保障我国粮食安全方面发挥了巨大作用，但是不合理施氮已经形成了严重的面源污染，造成一系列的严重危害，如太湖蓝藻事件令人触目惊心。城市地下水硝酸盐污染已经对饮用水安全造成了威胁。

[0003] 大气中含有78％的氮素，但其存在形式是分子态氮气，动植物不能直接利用，自然界只有某些原核微生物具有直接利用大气中氮气的能力，将其还原成氨，这就是生物固氮作用。选用高效固氮微生物菌种工厂化生产制成菌剂，或进一步与其它富含植物营养的物料复合加工成生物制品，应用于农业生产，可以提供作物氮素营养，改善作物根际生态环境，提高土壤生物肥力性状，这就是通常所说的固氮微生物菌剂或固氮微生物肥料。生物氮肥具有多种优势：①生物氮肥由可再生的生化制剂和活体微生物组成，可以再生，不存在资源枯竭问题，是可持续发展农资产品。②生物氮肥是环境友好型肥料，其生产和使用过程均不产生三废等污染性物质，而且能改善土壤理化性质，提高土壤肥力，是生态农业农资产品。③生物氮肥生产耗能少、成本低，其成本仅为等效化学氮肥的20％～40％，可以为国家节省大量的煤炭和石油等能源战略物资。④使用生物氮肥可以显著降低农业生产成本，提高农产品品质，提升土壤肥力，使农民受益，促进社会和谐发展。

[0004] 干旱、洪涝、土壤次生盐碱化及重金属污染等逆境条件造成农作物减产等问题日益严重，如何有效提高植物抗逆能力和增加农作物产量已成为当前农业可持续发展工作的重要内容。乙烯是高等植物的内源激素，植物生长发育通常只需要较低水平的乙烯，但在接近成熟或遇到干旱、淹水、高温、机械损伤、病虫害侵袭时会大量产生乙烯，这是植物对环境的一种生理应激反应，但过量乙烯会导致植物生长发育受阻甚至死亡。1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC)是乙烯合成的前体物质，近年来发现，许多植物促生细菌(plant growth promoting bacteria，PGPB)具有ACC脱氨酶活性，能够把ACC分解成氨和α-丁酮酸减少乙烯合成，从而降低植物对逆境的敏感性，提高植物抗逆能力，而且可以促进有机物污染和重金属污染土壤的植物修复，因此人们采用检测ACC脱氨酶的方法来筛选植物促生细菌。

[0005] 菌种是微生物肥料生产应用的基础。目前，限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈就是高效菌种的选育问题。农业生产迫切需要能够高效固氮、提高作物抗逆性的微生物肥料生产用菌种。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一株具有1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶活性，可以在小麦体内进行高效固氮的细菌。

[0007] 本发明提供的细菌是假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.5040。

[0008] 本发明的另一个目的是提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040。

[0009] 该菌剂除包含作为活性成分的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040外，还可包括辅料，如草炭、动物的粪便、各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生皮等。

[0010] 该菌剂可用于固氮、促进植物生长、抑制植物产生乙烯、降低植物对逆境敏感性、提高植物抗逆性、产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶及固氮酶等。

[0011] 所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040在制备下述1)-7)中任一的菌剂中的应用也属于本发明的保护范围：

[0012] 1)用于固氮的菌剂；

[0013] 2)促进植物生长的菌剂；

[0014] 3)抑制植物产生乙烯的菌剂；

[0015] 4)降低植物对逆境敏感性的菌剂；

[0016] 5)提高植物抗逆性的菌剂；

[0017] 6)产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶的菌剂；

[0018] 7)产生固氮酶的菌剂。

[0019] 所述逆境为干旱、淹水、高温、机械损伤、病虫害侵袭或重金属污染等。

[0020] 所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040或以假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040为活性成分的菌剂在生产固氮酶或1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶中应用以及在制备生物有机肥中的应用也属于本发明的保护范围。

[0021] 本发明的另一个目的是提供一种含有所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040或以所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040为活性成分的菌剂的生物有机肥。

[0022] 本发明的又一目的是提供一种培养假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040的方法，包括将假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040在用于培养假单胞菌的培养基中培养的步骤。

[0023] 本发明的又一目的是提供一种制备所述菌剂的方法，该方法包括如下步骤：将所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040作为活性成分，得到所述菌剂。

[0024] 实验证明，本发明是从水稻植株中分离作物内生固氮菌，进一步筛选较高固氮酶活性的菌株和能够产生ACC脱氨酶的菌株，最终筛选到1株小麦内生固氮菌，编号为GDXM114，该菌株可产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶，且固氮酶活性很高，在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。

[0025] 保藏说明

[0026] 菌种名称：假单胞菌

[0027] 拉丁名：(Pseudomonas sp.)

[0028] 菌株编号：GDXM114

[0029] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

[0030] 保藏机构简称：CGMCC

[0031] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

[0032] 保藏日期：2011年7月6日

[0033] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5040

附图说明

[0034] 图1为假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040的固氮酶活性。

[0035] 图2为假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040的ACC脱氨酶活性。

具体实施方式

[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0037] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0038] 多碳源低氮培养基(CCM)：溶液Ⅰ：KH2PO4 0.2g，NaCl 0.1g，K2HPO4 0.8g，Na2FeEDTA 28mg，钼酸钠25mg，酵母浸膏100mg，甘露醇5g，蔗糖5g，乳酸钠0.5mL，蒸馏水900mL。溶液Ⅱ：MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.06g，蒸馏水100mL。将溶液Ⅰ、Ⅱ分别灭菌，冷却至50℃左右混合，加入生物素(5μg/L)和维生素(10μg/L)各0.5mL。

[0039] 无氮培养基：蔗糖10g，NaCl 0.12g，K2HPO4·3H2O 0.5g，CaCO3 1g，MgSO4·7H2O0.2g，蒸馏水1000mL，pH7.2。

[0040] DF培养基：KH2PO4 4.0g，Na2HPO4 6.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，葡萄糖2.0g，葡萄糖酸钠2.0g，柠檬酸2.0g，(NH4)2SO4 2.0g，组分一、组分二溶液各0.1ml，H2O 1000mL，pH 7.2；其中组分一：H3BO3 10mg，MnSO4·H2O 11.19mg，ZnSO4·7H2O 124.6mg，CuSO4·5H2O 78.22mg，MoO3 10mg，溶于100mL灭菌蒸馏水中；组分二：FeSO4·7H2O 100mg溶于10mL灭菌蒸馏水中。

[0041] ADF培养基：将ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)溶于超纯水，过滤灭菌，加到不含(NH4)2SO4的灭菌DF培养基中，终浓度为3.0mM。

[0042] 改良固氮培养基：蔗糖10g、K2HPO4·3H2O 0.5g、NaCl 0.2g、CaCO3 1g、MgSO4·7H2O0.2g、酵母膏0.5g、蒸馏水1000ml、琼脂1.5％～2.0％，pH 7.0～7.2。

[0043] 圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC11103(参见“孙建光等.高效固氮芽孢杆菌筛选及其生物学特性.中国农业科学，2009，42(6)：2043-2051”)。

[0044] 实施例1、小麦内生固氮菌GDXM114的分离与鉴定

[0045] 一、小麦内生固氮菌的分离

[0046] 小麦内生固氮菌的分离的具体操作如下：取新鲜小麦植株(采自中国北京市)，首先用自来水冲洗干净，然后依次用70％乙醇浸泡1min，2％次氯酸钠表面消毒灭菌10min，无菌水冲洗3次。无菌操作条件下，准确称样品10.0g，在无菌研钵内磨成糊状，转移、定容-4 -5 -6至100ml，继续稀释制成系列稀释样品，分别从10 、10 、10 稀释液中取0.1ml分别均匀涂布在上述CCM培养基和无氮培养基平板上，28℃倒置培养，3～4d后，挑取单菌落划线纯化，得到小麦内生固氮菌。同时，将表面消毒时最后一次洗涤水涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上检测确认植株样品消毒彻底。

[0047] 二、ACC脱氨酶阳性菌株筛选

[0048] 对步骤一所得的水稻内生固氮菌进行ACC脱氨酶阳性菌株筛选，具体方法如下所述：把分离到的内生固氮菌，接入5mL液体无氮培养基中，30℃、200r/min振荡培养24h；吸取上述培养液0.1mL接种至5mL DF培养基振荡培养24h；吸取上述培养液0.1mL接种至5mL ADF培养基中振荡培养24～48h；将在ADF中生长的菌种重复转接、培养，并以ADF培养基作为阴性对照，能够以ACC为唯一氮源生长的菌株为ACC脱氨酶阳性菌株。将筛选所得的一株ACC脱氨酶阳性菌株命名为小麦内生固氮菌GDXM114。

[0049] 三、小麦内生固氮菌GDXM114的鉴定

[0050] 从以下几个方面鉴定步骤一和二分离纯化并筛选得到的小麦内生固氮菌GDXM114：

[0051] 1、形态学鉴定

[0052] 将处于对数生长期且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的固氮菌GDXM114进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。

[0053] 对于处于对数生长期的所述固氮菌GDXM114，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。

[0054] 结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的固氮菌GDXM114菌落圆形凸起，表面光滑湿润，边缘整齐；菌体杆状，1.0×2.0～2.5μm，革兰氏阴性。

[0055] 2、生理生化特征分析

[0056] 参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第三版).北京：高等教育出版社，1999.)测定上述小麦内生固氮菌GDXM114的生理生化特征。

[0057] 所述固氮菌GDXM114的生理生化特征测定结果如下：

[0058] 接触酶反应：阴性

[0059] 氧化酶反应：阴性

[0060] 生长温度：4℃不生长，28℃生长，37℃不生长，60℃不生长。

[0061] 耐盐性试验：2％NaCl不生长，5％NaCl不生长，7％NaCl不生长，10％NaCl不生长。

[0062] 苯丙氨酸脱氨酶试验：阴性

[0063] 利用柠檬酸盐：阴性

[0064] 水解淀粉：阳性

[0065] 卵黄卵磷脂酶：阴性

[0066] 甲基红试验：阴性

[0067] V.P试验：阳性

[0068] PH 5.7生长：阳性

[0069] 糖醇发酵产酸：葡萄糖阳性，甘露醇阳性，乳糖阳性，蔗糖阳性。

[0070] 3、16s rDNA序列同源性分析

[0071] 常规方法培养上述步骤一和二分离纯化并筛选得到的固氮菌GDXM114，提 取 菌 株 的 总 DNA作 为 基 因 扩 增 模 板，以 细 菌16s rDNA通 用 引 物，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR反应。反应体系采用上海生物工程有限公司PCR扩增试剂盒。反应程序为：95℃变性30s、
55℃退火1min、72℃延伸2min，共30个循环。DNA测序由北京三博远志生物技术公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线完成。

[0072] 小麦内生固氮菌GDXM114菌株16s rDNA的序列详见序列表中序列1。

[0073] 4、生长特性分析

[0074] 进行了菌株最适温度和最适pH生长实验。采用无氮培养基，分别在4℃、28℃、37℃、60℃培养、观察、记录菌株的温度适应性，每个处理3次重复。调整酸度分别为pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11，每个处理3次重复，培养、观察、记录菌株生长的最适pH。

[0075] 结果表明，所述小麦内生固氮菌GDXM114的最适生长温度为28℃，最适生长pH为pH7～8。

[0076] 鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一和二分离纯化并筛选得到的小麦内生固氮菌GDXM114鉴定为变型细菌γ亚群假单胞菌科假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。该假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114已于2011年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.5040。

[0077] 实施例2、假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040固氮酶活性测定[0078] 对实施例1所得到的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040进行固氮酶活性测定，具体方法如下所述：在15×150mm螺口玻璃管中加入5ml改良固氮培养基制成斜面，接种固氮菌，28℃培养。以微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC11103为阳性对照，不接种空白斜面为阴性对照，设3个重复。培养72h后，换橡胶塞，注入乙炔气体使终浓度为10％，用医用胶布密封，继续培养72h，取100μl反应气体，用气相色谱仪测定乙烯生成量，根据以下公式计算菌株的固氮酶活性。固氮酶活性(nmol/mg·h)＝C2H4nmol/[菌体蛋白量(mg)×反应时间(h)]，其中C2H4nmol＝1000×C2H4体积(μl)×273×P/[22.4×(273+t)×760]，其中P为气压(mm汞柱)，t为反应温度(℃)。

[0079] 其中，菌体蛋白含量测定方法如下所述：用5ml生理盐水将试管斜面上的菌苔洗入离心管中，收集菌体，向沉淀中加入3ml 0.5M的NaOH沸水煮沸5min，加入3ml 0.5M的HCl混合，离心后取上清1.0ml，加入5ml考马斯亮蓝溶液，在漩涡混合器上混合，显色3min，测定595nm处的吸光值A595，根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含量。

[0080] 结果显示，筛选到的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040的固氮酶活性为22.807nmol C2H4/h·mg蛋白，经统计分析与微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性25.100nmol/h·mg蛋白统计学无差异，如图1所示。这一结果表明，本发明的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040能高效固氮。

[0081] 实施例3、假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.50401-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶酶活测定

[0082] 对实施例1所得到的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040进行ACC脱氨酶活性测定，具体方法如下所述：以圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC11103作为对照组，实施例1筛选所得的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040作为实验组。用5ml无氮液体培养基活化菌株，吸取0.5ml培养液接种到60ml培养液中，30℃培养24～48h，4℃、8000rpm离心10min收集菌体，用15ml不含(NH4)2SO4的DF液体培养基离心洗涤菌体2次，将菌体重悬于24ml ADF培养基中，30℃培养24h，收集并记录菌体重量。用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)离心洗涤菌体2次，将菌体平均分在3个EP管中，-20℃贮存。取贮存菌体重悬于1ml 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)，12000rmp离心5min收集菌体，重悬于600μl 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)中，加入30μl甲苯，迅速振荡30s破碎细胞，取100μl粗酶液4℃贮存用于测定蛋白浓度；其余粗酶液进行ACC脱氨酶活性测定。取粗酶液200μl加入20μl浓度为0.5M的ACC溶液混匀，置于30℃水浴反应15min，加入1ml 0.56M HCl终止反应，12000rmp离心5min，取上清1ml，加入800μl0.56M HCl和300μl 0.2％2，4-二硝基苯肼溶液(2M HCl中溶解)，30℃保温30min；加入
2ml 2M NaOH混匀，540nm测吸光度值。对照α-酮丁酸标准曲线和蛋白测定标准曲线计算菌株的酶活性。ACC脱氨酶表示方法为：反应条件下，每毫克菌体蛋白每小时催化ACC脱氨形成α-丁酮酸的微摩尔数，单位是(μmolα-丁酮酸/h·mg蛋白)。蛋白质测定方法同实施例2。测定结果为3次重复平均值。

[0083] 结果显示，所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040的ACC脱氨酶活性为7.739μmolα-丁酮酸/h·mg蛋白，远高于对照组圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC11103的酶活性，如图2所示。这一结果表明，所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)GDXM114 CGMCC No.5040具有ACC脱氨酶活性，进而可以提高作物抵御干旱、淹水、高温、机械损伤、病虫害侵袭或重金属污染等逆境条件的潜能。